日本曲霉HY-8-25及其在迷迭香精油提取中的应用的制作方法

日本曲霉hy-8-25及其在迷迭香精油提取中的应用
(一)技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株日本曲霉hy-8-25及其在迷迭香精油提取中的应用。
(二)

背景技术：

2.迷迭香(rosmarinus officinalis)是一种唇形科(lamiaceae)常绿灌木，原产欧洲和非洲北部的地中海沿岸，近些年来，陆续在我国的云南、贵州、海南等南方地区有大面积种植。迷迭香在生长时就会散发一种清香气味，它的茎、叶和花含有气味芳香的挥发油，即迷迭香精油，其主要成分是单萜、倍半萜等萜类物质。迷迭香精油的香气宜人，目前已广泛用于调配空气清新剂、护肤油、香水、沐浴露、洗发水等日化品，在饮料、油炸和烘焙类食品中也有应用；此外，迷迭香精油还有较高的药用价值，表现出良好的抑菌、抗氧化、缓解胃痉挛、胃胀、促进肠胃蠕动、增强食欲、消炎镇痛等药理作用。
3.目前，关于迷迭香精油提取方法有较多报道，基本的方法有水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法、分子蒸馏法和超临界co2萃取法等。不同方法有各自的优缺点，如水蒸气蒸馏法设备要求低，操作简单，精油品质好，但存在热分解的问题，提取得率往往不高，一般在2.0％以下；有机溶剂浸提法的提取得率较高，但精油品质不高，往往还提取了植物的脂类和蜡质等，如胡超用70％乙醇从迷迭香叶片中提取精油，得率高达8.17％[胡超.迷迭香的提取工艺研究.低碳世界,2014,(10):336-338]。超临界co2萃取法和分子蒸馏提取法，精油的纯度较高，但设备成本较高、产能低，在生产实践中应用还有一定局限性。
[0004]
近年来，有不少研究报道采用微波辅助或酶辅助水蒸气蒸馏法提取迷迭香精油，得率可以显著提高。微波辅助提取法是通过微波辐射高频电磁波以穿透介质，使植物细胞内部升温，增大细胞内部压力，导致细胞破裂，胞内有效成分溶出，从而可以显著提高精油提取得率，如范琳用微波辅助水蒸气蒸馏法提取迷迭香精油，得率可达4.25％[范琳.微波法提取迷迭香精油的工艺研究.科技风,2020,(10):158]。微波辅助提取法虽具有操作简单、提取时间短及出油率高等特点，但是应用于植物精油的提取，精油的品质往往不高[王秀环,孙伟卫,季新燕,等.迷迭香精油提取工艺研究进展.山西中医学院学报,2015,16(1):73-76]。酶辅助提取法是在迷迭香精油提取前，用纤维素酶预处理提取原料(迷迭香的叶)，纤维素酶分解细胞壁成分，促使细胞内的有效物质溶出，从而达到提高提取得率的目的。如于功明等利用纤维素酶预处理迷迭香叶后，水蒸气蒸馏法提取精油的提取得率为2.03％，与单纯使用水蒸气蒸馏法相比，出油率提高了69.2％[于功明,刘克胜,秦大伟,等.酶法辅助提取对迷迭香精油出油率的影响.齐鲁工业大学学报(自然科学版),2012,26(4):58-60]。
[0005]
用纯的纤维素酶预处理迷迭香叶，虽然可以显著提高精油提取得率，但酶的使用量往往较大，酶的大量使用无疑会增加提取的成本；而且，植物细胞壁的构成不仅仅是纤维素，还有半纤维素和木质素等物质，单一使用纤维素酶水解植物细胞壁，效果并不理想。很多微生物在生长过程中可以产生多种多糖水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木
质素酶等，如果用微生物发酵制备的粗酶液酶解迷迭香叶，含有的多种糖苷酶协同水解叶片细胞壁成分，更有利于细胞中的精油释放出来，从而提高精油提取得率。本发明采用微生物发酵制备的粗酶液酶解迷迭香叶，可使迷迭香精油的提取得率大幅度提高。
(三)

技术实现要素：

[0006]
本发明目的是提供一株微生物新菌株—日本曲霉(aspergillus japonicus)hy-8-25及其在迷迭香精油提取中的应用，迷迭香叶经该菌株发酵制备的粗酶液酶解后，精油的提取得率可以显著提高。
[0007]
本发明采用的技术方案是：
[0008]
本发明提供一株微生物新菌株—日本曲霉(aspergillus japonicus)hy-8-25，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:62230，保藏日期2022年1月11日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
[0009]
本发明所述日本曲霉hy-8-25，是从迷迭香叶的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述的日本曲霉hy-8-25的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(pda)平板培养基上，28℃培养48h后，长出紫褐色菌落，菌丝稀疏，表面有大量黑褐色小颗粒状物，无渗出液，菌落背面浅黄色；分生孢子梗直立或稍弯曲，顶囊幼时稍长形，成熟后呈球形或近球形，单层小梗；分生孢子呈球形或近似球形，表面周生小刺，直径3
–
4μm。日本曲霉hy-8-25在pda平板培养基上划线接种后，28℃培养48h的菌落照片见图1。
[0010]
所述日本曲霉hy-8-25的核糖体dna内转录间隔区(ribosomal dna internal transcribed spacer，rdna-its)核苷酸序列为seq id no.1所示。
[0011]
本发明还提供一种所述日本曲霉hy-8-25在迷迭香精油提取中的应用，所述应用的方法为：将日本曲霉hy-8-25的发酵液过滤，获得的滤液即为含糖苷酶的粗酶液；将粗酶液与迷迭香叶粉混合，于30
–
35℃、80
–
100r/min条件酶解6
–
8h，得迷迭香叶酶解物；迷迭香叶酶解物经水蒸气蒸馏法提取，获得迷迭香精油。
[0012]
进一步，所述粗酶液体积用量以迷迭香叶粉质量计为4
–
5ml/g，所述迷迭香叶粉是将迷迭香叶自然晾干或50℃烘干，并粉碎过40目筛。
[0013]
进一步，所述粗酶液制备方法为：将日本曲霉hy-8-25接种于产酶培养基中，于28
–
30℃、200
–
250r/min恒温振荡培养3
–
4d，发酵液过滤，滤液即为含糖苷酶的粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：麸皮20
–
25g/l，蛋白胨10
–
12g/l，kh2po
43–
5g/l，mgso
4 0.5
–
1.0g/l，cacl
2 0.2
–
0.5g/l，溶剂为自来水，ph 6.0
–
6.5。
[0014]
进一步，优选所述产酶培养基组成为：麸皮25g/l，蛋白胨12g/l，kh2po45 g/l，mgso41.0 g/l，cacl
2 0.5g/l，溶剂为自来水，ph 6.0。
[0015]
本发明所述日本曲霉hy-8-25在产酶发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子液，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后将孢子液或种子液以体积浓度2％
–
5％的量接入产酶培养基进行发酵培养，所述日本曲霉hy-8-25发酵液制备方法为：
[0016]
(1)活化培养：将日本曲霉hy-8-25接种于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)平板培养基，于28
–
30℃恒温培养48
–
60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得日本曲霉hy-8-25孢子液；所述pda平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/l(切成小块，加水煮沸20min，去渣留汁)、葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，ph
自然(实测6.5)；
[0017]
(2)种子扩大培养：步骤(1)活化培养后的日本曲霉hy-8-25孢子液按体积浓度2％
–
4％的接种量接种至种子培养基中，于28
–
30℃、150
–
200r/min恒温振荡培养36
–
40h，得干菌体浓度为2.38
–
2.52g/l的种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10
–
15g/l，蛋白胨3
–
5g/l，kh2po
4 2
–
3g/l，mgso
4 0.3
–
0.5g/l，cacl
2 0.1
–
0.2g/l，溶剂为自来水，ph 6.0-6.5。优选所述种子培养基组成为：葡萄糖15g/l，蛋白胨5g/l，kh2po43g/l，mgso
4 0.5g/l，cacl
2 0.2g/l，溶剂为自来水，ph 6.0。
[0018]
(3)产酶培养：用步骤(1)活化培养后日本曲霉hy-8-25孢子液，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度2％
–
5％的接种量接入产酶培养基，于28
–
30℃、200
–
250r/min恒温振荡培养3
–
4d，获得干菌体浓度为4.13
–
4.67g/l、β-葡萄糖苷酶活力为42.1
–
45.4u/ml的发酵液。
[0019]
进一步，所述水蒸气蒸馏法从迷迭香叶酶解物中提取精油的方法为：将迷迭香叶酶解物转入圆底烧瓶中，并补充去离子水，加入少许玻璃珠。圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止；接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内沸腾，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3
–
5h)，停止加热，放置1h以上；开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出精油。所述去离子水体积用量以发酵前迷迭香叶粉质量计为3
–
4ml/g；所述玻璃珠加入目的是防止加热爆沸，数量在50粒左右；所述挥发油提取器，也称挥发油测定器，结构见图2。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种新菌株—日本曲霉(aspergillus japonicus)hy-8-25，该菌株是针对能够产酶水解迷迭香叶植物组织而有目的筛选得到，它能在麸皮为主要碳源的培养基中快速生长，产糖苷酶的活性高。在从迷迭香叶中提取精油前，增加日本曲霉hy-8-25发酵的粗酶液预处理，粗酶液中多种酶能够协同水解迷迭香叶细胞壁的纤维素和半纤维素等物质，从而有助于迷迭香精油释放，精油的提取得率得以显著提高。较不采用酶解预处理的常规方法相比，迷迭香精油的提取得率提高了55.2％。
(四)附图说明
[0021]
图1为日本曲霉hy-8-25的菌落形态照片。
[0022]
图2为挥发油提取器结构示意图。
[0023]
图3为对硝基苯酚浓度—a
400
标准曲线。
(五)具体实施方式
[0024]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0025]
本发明实施例所述的迷迭香叶，是唇形科(lamiaceae)植物迷迭香(rosmarinus officinalis)的叶片。所述的迷迭香叶粉是迷迭香叶，经自然晾干或50℃烘干，粉碎后，过40目筛的细粉。
[0026]
实施例1：发酵产酶菌株的分离和筛选
[0027]
发酵产酶酶解迷迭香叶的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
[0028]
(1)250-ml三角瓶中加入10g的迷迭香叶粉，再加入15ml无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1
×
10-7
、1
×
10-8
、1
×
10-9
倍后，分别吸取0.1ml稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(pda)上，于28℃恒温培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜pda平板培养基，置于28℃恒温培养60h，得纯培养菌株12株，各菌株的编号见表1。
[0029]
(2)12个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10ml无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液4ml(接种量为2％的体积百分数)，分别接入200ml产酶培养基中(12瓶)，于28℃、200r/min恒温振荡培养4d后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。
[0030]
(4)50g迷迭香叶粉于500-ml三角瓶中，再加入步骤(3)制备的粗酶液200ml，搅拌均匀后于30℃、80r/min振荡水浴中酶解8h，得迷迭香叶酶解物。同样条件下，用200ml的未接种微生物的产酶培养基滤液代替粗酶液做未经酶解的对照。
[0031]
(5)参照《中国药典》2020版四部中的“2204挥发油测定”，分别将步骤(4)获得的各菌株粗酶液酶解的全部迷迭香叶酶解物转移到1-l的圆底烧瓶中，加入200ml去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管(图2)，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3h)，停止加热，放置2h，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出迷迭香精油，无水硫酸钠脱水后称重。
[0032]
经不同菌株发酵制备的粗酶液酶解的迷迭香叶以及未经酶解的对照，水蒸气蒸馏法提取精油的得率见表1。
[0033]
表1不同菌株发酵制备的粗酶液酶解的迷迭香叶精油提取得率
[0034]
[0035][0036]
由表1数据可以看出，迷迭香叶经hy-8菌株发酵制备的粗酶液酶解后，精油提取得率为2.08％，较未经酶解的对照1.63％相比，精油提取得率提高的幅度最高(27.6％)。有些菌株，如hy-4、hy-6和hy-12等发酵制备的粗酶液酶解迷迭香叶后，精油的提取得率有所下降，说明用于产酶酶解迷迭香以提高精油提取得率的微生物菌株有特异性。本发明选定hy-8菌株作为提高迷迭香精油提取得率的产酶菌种。
[0037]
所述pda平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000ml，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000ml，加入20g葡萄糖和20g琼脂，ph自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15
–
20ml。
[0038]
所述产酶培养基终浓度组成和配制方法为：麸皮20g/l，蛋白胨10g/l，kh2po43 g/l，mgso
4 0.5g/l，cacl
2 0.2g/l，溶剂为自来水，ph 6.0。500-ml三角瓶装200ml产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0039]
所述迷迭香精油提取得率按以下公式计算：
[0040][0041]
实施例2：产酶菌株hy-8的诱变选育
[0042]
对菌株hy-8进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
[0043]
(1)孢子液的制备：菌株hy-8经pda平板培养基28℃活化培养48h后，加5ml无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45ml无菌生理盐水的三角瓶中(加有20
–
30粒玻璃珠)，振荡20min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部放一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.35
×
106个/ml。
[0044]
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.0ml上述孢子悬液于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15w紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5ml上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1ml涂布pda平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的pda平板用黑布包裹，倒置于28℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
[0045]
(3)筛选：挑取致死率在90％以上pda平板上的菌落转接新鲜pda平板培养基上，获得45个菌株。各个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10ml无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。吸取各菌株的孢子液1ml，接入50ml产酶培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡培养4d后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力。筛选获得酶活较野生菌株提高25％以上的菌株7株，再按实施例1方
法，用这7个菌株发酵的粗酶液酶解迷迭香叶，再用水蒸气蒸馏法提取精油，复筛的突变菌株发酵制备的粗酶液酶解的迷迭香叶精油提取得率见表2。
[0046]
表2复筛突变菌株发酵制备的粗酶液酶解的迷迭香叶精油提取得率
[0047][0048]
从表2数据可以看出，在复筛的7个菌株中，编号为hy-8-25的菌株，发酵产β-葡萄糖苷酶的活力为41.0u/ml，较野生菌株hy-8的26.7u/ml提高了53.5％，虽然产β-葡萄糖苷酶活力不是最高，但用该菌株发酵制备的粗酶液酶解迷迭香叶后，精油提取得率为2.46％，较野生菌株hy-8的2.08％提高了18.3％，较未经酶解的对照1.63％提高了50.9％。
[0049]
所述pda培养基和产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。
[0050]
所述β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8ml、5mmol/l的对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)0.2ml(ph 6.0、0.2mol/l的磷酸缓冲液配制)，于35℃下反应15min后，加入2ml的1mol/l na2co3水溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于400nm波长下测定吸光度(a
400
)。由对硝基苯酚(pnp)浓度—a
400
标准曲线(图3)计算出反应体系中pnp浓度。
[0051]
β-葡萄糖苷酶活力单位(u)的定义：35℃下、ph 6.0缓冲体系中，l min内水解pnpg生成1μmolpnp的酶量为1个酶活单位。
[0052]
酶活按以下公式计算：
[0053][0054]
式(2)中，c1：pnp浓度；v1：反应体系总体积；v2：粗酶液体积；t：反应时间。
[0055]
对硝基苯酚浓度—a
400
标准曲线的制作：用蒸馏水配制浓度为1mmol/l的pnp标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml至l0-ml容量瓶中，用l mol/l的na2co3水溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度为10、20、30、40、50μmol/l。以蒸馏水为空白，测定在400nm波长处的吸光值，以对硝基苯酚浓度为横坐标，a
400
为纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—a
400
标准曲线(图3)。
[0056]
实施例3：菌株hy-8-25的分类鉴定
[0057]
菌株hy-8-25接种在pda平板培养基上，28℃培养48h后，长出紫褐色菌落，菌丝稀疏，表面有大量黑褐色小颗粒状物，无渗出液，菌落背面浅黄色；分生孢子梗直立或稍弯曲，
顶囊幼时稍长形，成熟后呈球形或近球形，单层小梗；分生孢子球形或近球形，表面周生小刺，直径3
–
4μm。菌株hy-8-25在pda平板培养基上划线接种后，28℃培养48h的菌落照片见图1。
[0058]
测得菌株hy-8-25的rdna-its核苷酸序列为seq id no.1所示，该序列在ncbi(national center for biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast比对，与日本曲霉(aspergillus japonicus)的典型菌株cbs 114.51有99.8％的同源性。根据菌株hy-8-25菌落的形态特征和rdna-its核苷酸序列比对结果，可以确定菌株hy-8-25的生物学分类位置为(参考mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(fungi)，子囊菌门(ascomycota)，盘菌亚门(pezizomycotina)，散囊菌纲(eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(eurotiomycetidae)，散囊菌目(eurotiales)，曲霉科(aspergillaceae)，曲霉属(aspergillus)，日本曲霉(aspergillus japonicus)。
[0059]
its区rdna序列为：
[0060]
gggcccaacctcccacccgtgcttaccgtaccctgttgcttcggcgggcccgccttcgggcggcccggggcctgcccccgggaccgcgcccgccggagaccccaatggaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgataccaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctcccctccagccccgctggttgttgggccgcggccccccgggggcgggcctcgagagaaacggcggcaccgtccggtcctcgagcgtatggggctctgtcacccgctctatgggcccggccggggcttgcctcgacccccaatcttctcagattgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagc。
[0061]
综上，从迷迭香叶粉的微生物富集物中分离的菌株hy-8，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株hy-8-25，即日本曲霉(aspergillus japonicus)hy-8-25，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:62230，保藏日期2022年1月11日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
[0062]
实施例4：日本曲霉hy-8-25应用于迷迭香精油的提取
[0063]
日本曲霉hy-8-25应用于迷迭香精油的提取，按以下步骤操作：
[0064]
(1)冷冻干燥保存的日本曲霉hy-8-25孢子粉，接种于新鲜pda平板培养基，于28℃恒温培养60h，加10ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得日本曲霉hy-8-25的孢子液。所述pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
[0065]
(2)取步骤(1)制备的孢子液1ml(接种量为2％的体积百分数)，接种50ml种子培养基中，于28℃、150r/min恒温振荡培养40h，得干菌体浓度为2.52g/l的种子液。所述种子培养基终浓度组成和配制方法为：葡萄糖15g/l，蛋白胨5g/l，kh2po
4 3g/l，mgso
4 0.5g/l，cacl
2 0.2g/l，溶剂为自来水，ph 6.0；250-ml三角瓶装50ml种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0066]
(3)取步骤(2)制备的种子液6ml(接种量为4％的体积百分数)，接种150ml产酶培养基，于28℃、200r/min恒温振荡培养4d，得干菌体浓度为4.67g/l的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为42.1u/ml。所述产酶培养基终浓度组成和配制方法为：麸皮25g/l，蛋白胨12g/l，kh2po45 g/l，mgso41.0 g/l，cacl
2 0.5g/l，溶剂为自来水，ph 6.0。500-ml三角瓶装150ml产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0067]
(4)50g迷迭香叶粉于500-ml三角瓶中，再加入取步骤(3)方法制备的粗酶液250ml，搅拌均匀后于30℃、100r/min水浴振荡酶解8h，得迷迭香叶酶解物。
[0068]
(5)步骤(4)获得的全部迷迭香酶解物转移到1-l的圆底烧瓶中，加250ml的去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(4h)，停止加热，放置2h，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出迷迭香精油，无水硫酸钠脱水后称重。
[0069]
按上述步骤，从50g迷迭香叶中提取得到精油1.27g，提取得率为2.54％，精油为无色透明的液体。
[0070]
实施例5：日本曲霉hy-8-25应用于迷迭香精油的提取
[0071]
(1)4℃冰箱保藏的日本曲霉hy-8-25pda平板培养物，接种于新鲜pda平板培养基，于30℃恒温培养48h，加10ml的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得日本曲霉hy-8-25的孢子液，所述pda平板培养基成分和配制方法同实施例1。
[0072]
(2)取步骤(1)制备的孢子液2ml(接种量为4％的体积百分数)，接种50ml种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡培养36h，得干菌体浓度为2.38g/l的种子液，所述种子培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
[0073]
(3)取步骤(2)制备的种子液7.5ml(接种量为5％的体积百分数)，接种150ml产酶培养基，于30℃、250r/min恒温振荡培养3d，得干菌体浓度为4.13g/l的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为45.4u/ml。所述产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
[0074]
(4)75g迷迭香叶粉于500-ml三角瓶中，再加入取步骤(3)方法制备的粗酶液300ml，搅拌均匀后于35℃、100r/min的水浴摇床中酶解6h，得迷迭香叶酶解物。
[0075]
(5)步骤(4)获得的全部迷迭香叶酶解物转移到1-l的圆底烧瓶中，加300ml的去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(5h)，停止加热，放置2h，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出迷迭香精油，无水硫酸钠脱水后称重。
[0076]
按上述步骤，从75g迷迭香叶中提取得到精油1.92g，提取得率为2.56％，精油为无色透明的液体。
[0077]
对比例1：水蒸气蒸馏法直接提取迷迭香精油
[0078]
75g迷迭香叶粉于1-l的圆底烧瓶中，加600ml的去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(5h)，停止加热，放置2h，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出迷迭香精油，无水硫酸钠脱水后称重。
[0079]
按上述方法，75g的迷迭香叶粉提取获得精油1.24g，提取得率为1.65％，精油为无
色透明的液体。
[0080]
比较实施例5和对比例1方法可以看出：在水蒸气蒸馏法提取迷迭香叶精油前，增加日本曲霉hy-8-25发酵的粗酶液酶解预处理，较不采用酶解预处理的常规方法相比，精油的得率从1.65％提高到2.56％，提高了55.2％。