菌株和酶在制备保健酱油中的应用及制备方法与流程

1.本发明涉及食品领域，尤其涉及菌株和酶在制备保健酱油中的应用及制备方法。


背景技术：

2.传统的酿造酱油，是以大豆或脱脂大豆、小麦或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品。目前，为提高改善酱油的质量及风味，国内出现了大量的各种特色化的风味酱油，如虫草酱油、铁强化酱油、加碘酱油等。
3.β-1,3-葡寡糖具有广泛的生理活性，能够诱导植物对病原菌产生抗性，调节人和动物的免疫反应、具有降血糖、抗炎和抗肿瘤等功能。因此，β-1,3-葡寡糖的制备具有十分重要的意义。
4.β-1,3-葡寡糖的制备，目前最常用方法有：化学降解、物理降解及生物降解。化学降解和物理降解，操作简单、反应速度快且成本低，专利cn101434974b一种利用酵母制备可溶性β-1,3-葡聚寡糖的方法，就是利用碱预处理和酸水解，再通过分离纯化制备酵母来源的β-1,3-葡寡糖。但化学降解和物理降解反应过程不易控制、降解产物复杂、分子量分布范围广等缺点限制了在规模化生产的应用。生物酶解法制备寡糖技术具有底物专一性强、反应条件温和可控、对环境无污染等优点，已逐渐取代了传统化学、物理降解法，但是β-1,3-葡聚糖酶分为外切β-1,3-葡聚糖酶和内切β-1,3-葡聚糖酶，外切β-1,3-葡聚糖酶水解产物主要是葡萄糖，而内切β-1,3-葡聚糖酶才能制备低聚合度的功能性寡糖。目前市场上已经有β-葡聚糖酶的产品，主要是外切β-1,3-葡聚糖酶。
5.国内酱油生产用米曲霉菌种主要有as3.863、as3.951(沪酿3.042)、ue328、ue336、渝3.811和一些日本引进的酱油曲霉等菌株，这些菌株酶系丰富，但是还没有分泌内切β-1,3-葡聚糖酶的米曲霉的报道。
6.灰树花是一种大型珍稀食药用菌，又名舞茸、贝叶多孔菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、灰树花属，菌丝香味浓郁、味道鲜美、营养丰富。灰树花多糖是灰树花的主要功能物质之一，有生物活性的灰树花多糖的基本结构为带有β-(1-6)侧链的β(1-3)-d-葡聚糖。现在山东滨州人工培养灰树花，收割灰树花子实体后，剩下的培养残基只是用作饲料或肥料，而没有很好的利用其中的有益成份。事实上，灰树花培养残基含有大量的菌丝，有丰富的灰树花多糖、糖蛋白等生理活性物质，还含有丰富的蛋白和淀粉类成份，可被酱油曲中的酶类分解成营养成份。经检测，灰树花培养残基含有蛋白质2.5～3.1％，总糖10.8～15.2％，灰树花多糖0.42～0.66％，因此，灰树花培养残基，有丰富的营养，具有极高的利用价值，制备含有灰树花来源的β-1,3-葡寡糖的保健酱油更是影响深远。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了菌株和酶在制备保健酱油中的应用及制备方法。该菌株具有内切β-1,3-葡聚糖酶高产能力，成曲生长过程温度相对均衡产热慢而少、孢子产量少，能够明显降低制曲阶段的原料消耗率，蛋白酶系丰富，包括朊酶、肽酶、谷氨酰胺酶、植物细
胞破坏酶系等，能快速有效分解原料，酱醅滤过性增强，酱油谷氨酸含量高。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了菌株，该菌株的保藏编号为：cgmccno.40042。
10.本发明还提供了微生物菌剂，包括该菌株以及可接受的助剂。
11.本发明还提供了该菌株和/或上述微生物菌剂产生的酶。
12.本发明还提供了该菌株、上述微生物菌剂和/或上述酶在制备食品、调味品、发酵物、成曲中的一种或多种应用。
13.在本发明的一些实施方案中，食品包括：酱油、压片糖果中的一种或多种。
14.本发明还提供了酱油的制备方法，包括如下步骤：
15.s1：取该菌株或上述微生物菌剂接种培养，得到种子液；
16.s2：取上述述种子液接种培养，翻曲，得到种曲；
17.s3：取大豆和/或炒麦与上述种曲混合，翻曲，得到成曲；
18.s4：取上述成曲与灰树花培养残基、盐水混合，发酵后，压榨；
19.上述灰树花培养基包括：蛋白质2.5％～3.1％，总糖10.8％～15.2％，灰树花多糖0.42％～0.66％。
20.在本发明的一些实施方案中，制备方法的s2中上述接种的介质为含水量50～55％，颗粒不大于5目的熟料麸皮；
21.上述培养的条件为：取上述种子液在28～30℃培养16～20h后，在温度为26～28℃，湿度为90～100％下培养40～46h后，在温度为30～32℃，湿度为40～50％下培养6～10h；
22.上述翻曲的次数不少于1次。
23.在本发明的一些实施方案中，制备方法s3中上述大豆和炒麦的重量比为50～60：40～50；
24.上述培养的条件为：取上述成曲在温度为30～32℃，湿度为90～100％，培养12～16h后，在温度为32～35℃，湿度为90～100％，培养30～35h；
25.上述翻曲的次数不少于2次。
26.在本发明的一些实施方案中，制备方法s4中上述盐水为无碘食盐和水，上述无碘食盐和水的重量比为18～21：79～82。
27.在本发明的一些实施方案中，制备方法s4中上述成曲、上述灰树花培养残基、上述盐水的重量比为：100：20～30：250～300；
28.上述发酵分为：前期、中期和后期；
29.上述前期发酵温度为10～15℃，发酵时间30～40d，上述中期发酵温度25～30℃，发酵时间120～150d，上述后期发酵温度15～30℃，发酵时间30～60d。
30.本发明提供了菌株和酶在制备保健酱油中的应用及制备方法，该菌株的保藏编号为：cgmcc no.40042。
31.该菌株具有内切β-1,3-葡聚糖酶高产能力，成曲生长过程温度相对均衡产热慢而少、孢子产量少，能够明显降低制曲阶段的原料消耗率，蛋白酶系丰富，包括朊酶、肽酶、谷氨酰胺酶、植物细胞破坏酶系等，能快速有效分解原料，酱醅滤过性增强，酱油谷氨酸含量高。应用该菌株于添加灰树花培养残基的酱醪中，能生产含有β-1,3-葡寡糖等生理活性成
1.0g，茯苓多糖(含量≥90％)30.0g，feso4·
7h2o 0.01g，mgso4·
7h2o 0.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml,ph6.0；
49.内切β-1,3-葡聚糖酶复筛培养基为：茯苓多糖(含量≥90％)30g，牛肉膏5g，k2hpo
4 1.0g，cacl
2 0.4g，mgso
4 0.25g，mandels 1ml，蒸馏水1000ml，ph6.0；
50.4％(w/v)茯苓多糖制备方法：称取4g茯苓多糖(含量≥90％)溶于100ml缓冲液(50mm醋酸-醋酸钠缓冲液，ph5.0)，形成4％(w/v)茯苓多糖；
51.灰树花培养基配方：杂木屑34％，棉籽壳34％，麦麸10％，玉米粉10％，山表土10％，石膏粉1％，红糖1％，含水量60％，采一潮菇后。
52.本发明提供的菌株的分离和鉴定和保健酱油的制备中，所用原料及试剂均可由市场购得。
53.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
54.实施例1菌株的分离和鉴定
55.本发明的米曲霉菌株是以米曲霉as3.951为出发菌株，采用常规诱变方法，结合artp，反复多次诱变，得到粗酶液后，先经过产内切β-1,3-葡聚糖酶初筛、复筛，再经过酪蛋白平板和大豆蛋白平板筛选高产蛋白酶、菌丝生产快的菌落，最后筛选成曲产热少、孢子数少，中性蛋白酶、谷氨酰胺酶活力高的菌株，并对其生理生化特性、遗传稳定性深入研究后，最终筛选出一株米曲霉、利用该菌株酿造酱油成曲、易培养且具有遗传稳定性的菌株；
56.茯苓多糖分为水溶性多糖，其结构是50个β-(1,3)结合的葡萄糖单位，每个β-(1,5)结合的葡萄糖基支链与l至2个β-(1,6)结合的葡萄糖基间隔。初筛培养基选用以β-(1,3)结合的葡萄糖单位的茯苓多糖为唯一碳源培养基，初筛培养基上分离筛选，挑菌落周围能形成较大透明圈和菌丝生产较快的菌落；
57.发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为cgmcc no.40042，命名为yjy22-02，经检测其为存活状态。
58.该菌株形态特征如图1所示：在pda培养基上菌落形成较快，菌落呈圆形，质地绒状、菌落较厚、菌丝生长旺盛，孢子细密、色泽黄绿色，菌落背面浅褐色。
59.发明人同时对菌株yjy22-02进行了16srdna测序，其序列如seq id no：1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列。
60.将所测得的16srdna序列进行blast比对，比对结果显示，菌株yjy22-02的16srdna的核苷酸序列与曲霉属(aspergillus sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为米曲霉(aspergillus oryzae)的菌株有100％的同源性；鉴定其为米曲霉(aspergillus oryzae)。
61.实施例2β-1,3-葡聚糖酶活力和菌株遗传稳定性的测定
62.β-1,3-葡聚糖酶的定义为：在55℃每分钟β-1,3-葡聚糖水解释放出1.0μmol/l还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(u)；
63.取两只5ml离心管，两只离心管中分别加入2ml 4％茯苓多糖，55℃预热5min，然后一只管中加入2ml稀释后的实施例1中的粗酶液，混合均匀后55℃准确反应15min，取出后另一支管加入2ml实施例1中的粗酶液，然后两只管同时放入沸水中水浴5min。
64.冷却后离心，取上清2ml，加入25ml比色管中，然后加入1.5mldns，沸水浴5min，冷却后定容至25ml，测od
540
,根据标准曲线计算还原糖含量。
65.将初筛5株菌种按5％的接种量、活菌数105～106接入液体内切β-1,3-葡聚糖酶复筛培养基中，30℃，150r/min摇瓶培养7d后，测定β-1,3-葡聚糖酶活力，如表1所示；
66.表1初筛菌株复筛酶活测定
67.菌株编号β-1，3-葡聚糖酶活(u/ml)11562.7521894.1331202.9241756.48yjy22-022759.97as3.9510
68.从初筛菌株中筛选酶活最高的yjy22-02，在pda培养基上传代10代，将第1代、第5代、第10代菌种按5％的接种量、活菌数105～106接入液体内切β-1,3-葡聚糖酶复筛培养基中，30℃，150r/min摇瓶培养7d后，测定β-1,3-葡聚糖酶活力如表2所示，判断其遗传稳定性。
69.表2遗传稳定性的检测结果
70.菌株编号β-1，3-葡聚糖酶活(u/ml)yjy22-02第1代2834.15yjy22-02第5代2746.18yjy22-02第10代2794.86
71.由检测结果可得，筛选菌株yjy22-02遗传稳定性良好；
72.实施例3保健酱油的制备
73.1)将4℃条件下保存在豆汁琼脂培养基上的试管斜面菌种yjy22-02移至室温条件下活化4h；在无菌操作台上，用10ml灭菌后的蒸馏水从活化的试管斜面制成孢子悬浮液，冲洗装入100ml灭菌的pd液体培养基中，1支试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养28h得到种子液；
74.2)取制备好的种子液75ml，按照15％(v/w)的接种量，活菌数为105～106个接种于颗粒≤5目、含水量50％的熟料麸皮(干料麸皮0.5kg)中，搅拌均匀，种曲室控制温度30℃，16h，然后调整温度26℃，46h，连续通风，湿度90％；最后调整温度32℃，6h，连续通风，湿度50％，期间进行1次翻曲；
75.3)蒸煮后的大豆和炒麦，按照干基重量份60：48(大豆干基5.56kg、炒麦干基4.44kg)混合，按照5％(v/w)的接种量，活菌数为105～106个接入种曲0.5kg后，搅拌均匀，成曲室控制温度31℃，12h，连续通风，湿度100％；然后调整温度35℃，30h，连续通风，湿度96％，期间进行2次翻曲；
76.4)无碘食盐和水，按照重量份18：82混合均匀，即为质量浓度为18％(w/w)的盐水25kg；
77.5)将制备的成曲10kg、灰树花培养残基和盐水，按照重量份100：30：250，称取灰树花培养残基3kg、盐水25kg，混合均匀；前期发酵温度12℃，发酵时间40d，中期发酵温度30℃，发酵时间120d，后期常温发酵，发酵时间55d；
78.6)用压榨机压榨发酵后的产物，提取保健酱油18l，β-1,3-葡寡糖含量25.67mg/
100ml，体态澄清为鲜红褐色，有浓郁的酯香味和酱香味，口感鲜美醇厚，具有保健效果。
79.实施例4保健酱油的制备
80.1)将4℃条件下保存在豆汁琼脂培养基上的试管斜面菌种yjy22-02移至室温条件下活化8h；在无菌操作台上，用10ml灭菌后的蒸馏水从活化的试管斜面制成孢子悬浮液，冲洗装入100ml灭菌的pd液体培养基中，1支试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养25h得到种子液；
81.2)取制备好的种子液600ml，按照12％(v/w)的接种量，活菌数为105～106个接种于颗粒≤5目、含水量55％的熟料麸皮(干料麸皮5kg)中，搅拌均匀，种曲室控制温度29℃，20h，然后调整温度28℃，42h，连续通风，湿度96％；最后调整温度31℃，10h，连续通风，湿度40％，期间进行1次翻曲；
82.3)蒸煮后的大豆和炒麦，按照干基重量份52：40(大豆干基28.26kg、炒麦干基21.74kg)混合，按照10％(v/w)的接种量，活菌数为105～106个接入种曲5kg后，搅拌均匀，成曲室控制温度32℃，16h，连续通风，湿度97％；然后调整温度32℃，34h，连续通风，湿度100％，期间进行2次翻曲；
83.4)无碘食盐和水，按照重量份21：79混合均匀，即为质量浓度为21％(w/w)的盐水135kg；
84.5)将制备的成曲50kg、灰树花培养残基和盐水，按照重量份100：20：270，称取灰树花培养残基10kg、盐水135kg，混合均匀；前期发酵温度15℃，发酵时间35d，中期发酵温度25℃，发酵时间140d，后期常温发酵，发酵时间60d；
85.6)用压榨机压榨发酵后的产物，提取保健酱油102l，β-1,3-葡寡糖含量18.34mg/100ml，体态澄清为鲜红褐色，有浓郁的酯香味和酱香味，口感鲜美醇厚，具有保健效果。
86.实施例5保健酱油的制备
87.1)将4℃条件下保存在豆汁琼脂培养基上的试管斜面菌种yjy22-02移至室温条件下活化6h；在无菌操作台上，用10ml灭菌后的蒸馏水从活化的试管斜面制成孢子悬浮液，冲洗装入100ml灭菌的pd液体培养基中，1支试管菌种接种1个三角瓶，振荡培养24h得到种子液；
88.2)取制备好的种子液1.4l，按照10％(v/w)的接种量，活菌数为105～106个接种于颗粒≤5目、含水量52％的熟料麸皮(干料麸皮14kg)中，搅拌均匀，种曲室控制温度28℃，18h，然后调整温度27℃，40h，连续通风，湿度100％；最后调整温度30℃，7h，连续通风，湿度47％，期间进行1次翻曲；
89.3)蒸煮后的大豆和炒麦，按照干基重量份50：50(大豆干基100kg、炒麦干基100kg)混合，按照％(v/w)的接种量，活菌数为105～106个接入种曲14kg后，搅拌均匀，成曲室控制温度30℃，13h，连续通风，湿度90％；然后调整温度33℃，35h，连续通风，湿度90％，期间进行2次翻曲；
90.4)无碘食盐和水，按照重量份19：81混合均匀，即为质量浓度为19％(w/w)的盐水600kg；
91.5)将制备的成曲200kg、灰树花培养残基和盐水，按照重量份100：26：300，称取灰树花培养残基52kg、盐水600kg，混合均匀；前期发酵温度10℃，发酵时间30d，中期发酵温度27℃，发酵时间150d，后期常温发酵，发酵时间30d；
92.6)用压榨机压榨发酵后的产物，提取保健酱油524l，β-1,3-葡寡糖含量15.25mg/100ml，体态澄清为鲜红褐色，有浓郁的酯香味和酱香味，口感鲜美醇厚，具有保健效果。
93.实施例6保健酱油的理化指标和感官指标
94.将实施例3提取的酱油与菌株采用米曲霉as3.951、酿造条件同实施例3提取的酱油进行对比分析，分析酱油理化指标如表3、感官指标如表4：
95.表3酱油理化指标
[0096][0097]
与as3.951相比，*p＜0.05，**p＜0.01；
[0098]
表4酱油感官指标
[0099]
菌株体态色泽香气鲜味甜味苦涩味咸味酸味综合口感评分yjy22-024.013.903.473.893.423.563.613.283.82as3.9513.853.613.293.503.163.333.123.053.21
[0100]
备注：表中数据为10名鉴评人员鉴评结果的平均值。各单项指标评分分值为1～5分，分数越高，该项指标越好。
[0101]
由表3可得，将本发明的米曲霉yjy22-02应用于酱油生产比菌株as3.951酿制的酱油，不仅氨基氮、全氮、可溶性无盐固形物、谷氨酸含量高，且呈极显著性差异，还含有β-1,3-葡寡糖25.67mg/100ml，具有保健效果。由表4可得，经专业鉴评人员评定，将本发明的米曲霉yjy22-02酿制的酱油具备酱香浓郁、鲜甜突出、滋味醇厚持久的特征。
[0102]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。