一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用。


背景技术：

2.有机磷化合物是人工合成的含磷高毒物质，包括磷酸酯类、磷酸硫醇酯类、膦酸或氨基磷酸酯类、v和g型神经毒剂等，被广泛应用于农药、阻燃剂、增塑剂、化学武器等农业、工业和国防领域。有机磷能够与昆虫和哺乳动物体内的乙酰胆碱酯酶不可逆结合，导致神经系统紊乱，致人死亡。由于自然界对此类化合物的降解能力有限，大量使用的有机磷化合物逐渐积累，造成了严重的食品和环境问题。有机磷水解酶(organic phosphorus hydrolase，oph)是一种将有机磷化合物作为底物的酶，可以高效水解有机磷化合物中的p-o、p-s、p-f和p-cn，并且水解产物是无毒的。因此用oph来解决环境中有机磷化合物污染问题是一种绿色环保的方法。oph能安全又彻底去除新鲜蔬菜、瓜果等农产品上残留农药的产品，从根本上不同于市场上的化学洗涤剂采用化工原料用物理方法去除农药残留的方式，也避免了化学洗涤剂去除农药残留不彻底而且会形成二次污染的弊端。
3.oph的广泛需求使其成为重要的研究课题。由于从自然界得到的原始oph常常不具有高活性或热稳定性差，此外分离纯化较为困难，增加生产初始成本，酶活也会有损失的问题。使得有机磷水解酶的实际应用受到限制。微生物的代谢途径多，生长周期短，使得生物降解方式具有降解效率高、条件温和、价格低廉的优点，显示出了较好的应用潜力。而酶在微生物降解有机磷农药的过程中起主要作用，oph催化醋鍵的断裂，所得的低毒产物可以通过微生物进一步代谢成二氧化碳和水。通过酶法工程开发出耐高温易纯化的的有机磷水解酶成为研究的热点之一。目前，固定化金属离子亲和色谱(imac)已成为含组氨酸标签(his-tag)酶的分离纯化和固定化常用的技术。该利用imac材料中的过渡金属离子(ni
2
、co
2
、cu
2
等)与目标蛋白中组氨酸残基之间的亲和作用，实现his-tag蛋白的分离纯化和固定化。但操作复杂、耗时、效率低，不能增加酶的热稳定，而且制备imac的螯合剂会影响金属酶活性。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种重组有机磷水解酶及其构建方法和应用。在本发明中，通过将有机磷水解酶oph和树脂素模拟蛋白(resilin-mimetic protein，rnp)通过柔性刚性复合连接肽linker连接，构建出重组有机磷水解酶，记为oph-linker-rnp；所述重组有机磷水解酶能够在大肠杆菌原核表达系统表达，并且其能够自我高效纯化且耐稳定性好。
5.本发明中首先提供了一种重组有机磷水解酶，所述重组有机磷水解酶记为oph-linker-rnp，其氨基酸序列如seq id no:1所示，对应的核苷酸序列如seq id no:2所示。
6.本发明中还提供了上述重组有机磷水解酶的构建方法，包括：将黄杆菌属(flavobacterium)的有机磷水解酶与rnp通过接头linker连接，得到重组有机磷水解酶
oph-linker-rnp。
7.其中，重组有机磷水解酶的氨基酸序列如seq id no:3，对应的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述rnp(resilin-mimetic protein，rnp)为12个肽(psssygapgggn)的30个重复序列组成的模拟树脂蛋白的人工多肽，其氨基酸序列如seq id no:5所示；所述接头linker为连接肽ggggsggggseaaakeaaakggggsggggs，其核苷酸序列如seq id no:7所示。
8.本发明中还提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包含编码上述重组有机磷水解酶的核苷酸，记为pet22b( )-oph-linker-rnp。
9.本发明中还提供了一种重组菌，所述重组菌包括上述重组表达质粒。
10.本发明中还提供了所述重组有机磷水解酶纯化的方法，所述纯化方法为盐析加热法。
11.本发明还提供了上述重组有机磷水解酶、重组表达质粒或重组菌在降解有机磷农药中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
13.本发明中，在oph上连接了rnp，使得oph具有的热稳定性，这种特性使蛋白只需经过盐析加热简单的纯化过程就能获得目标蛋白，避免了亲和色谱层析法繁琐的实验过程。通过该特性可以实现oph的纯化，70-80℃纯化倍数和回收率分别可达到9.39、9.51倍和81.12％、79.23％。此外，该方法能增加oph酶稳定性，60℃时，oph-linker酶活性只有28.81％，但是oph-linker-rnp仍可以保持80.43％活性；80℃时，oph-linker酶活性只有8.81％，oph-linker-rnp仍可以保持59.56％活性。
14.本发明通过基因修饰技术构建了oph-linker-rnp重组有机磷水解酶，相比有机磷水解酶，重组有机磷水解酶具有热稳定性，只需经过盐析加热离心等简单的过程就能获得目标蛋白，该方法简单快速，在效率上优于传统的镍柱亲和层析纯化方式。
15.本发明中构建的重组oph-linker-rnp可以在更大的温度(80℃)有效工作，有利于提高酶催化工艺的效率。本发明得到的融合蛋白更适合于生物催化工艺的应用，更能满足社会生产的要求，有广阔的市场前景。
附图说明
16.图1为重组质粒pet22b( )oph-linker-rnp构建示意图。
17.图2为25℃下oph-linker-rnp诱导表达和纯化sds-page图；图中，m：标准蛋白分子量marker；1：空载体诱导表达破碎的上清；2：oph-linker-rnp诱导0h表达全菌；3：oph-linker-rnp酶诱导8h表达全菌；4：含oph-linker-rnp的沉淀；5：含oph-linker-rnp的上清溶液；6：空载体诱导表达破碎的全菌；7-10：(nh4)2so4在50、60、70、80℃加热纯化的上清液。
18.图3为不同温度加热后的oph-linker-rnp回收率与纯化倍数情况图。
19.图4为实施例4中oph-linker-rnp和oph-linker的热稳定性情况图。
20.图5为实施例4中oph-linker-rnp和oph-linker的储存稳定性情况图。
具体实施方式
21.下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
22.下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。
23.实施例1：重组表达质粒的构建
24.以来自黄杆菌属(flavobacterium)的oph基因(genbank登录号cm29593.1)为模板，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成oph核苷酸序列，所述oph基因核苷酸序列如seq id no:4所示，编码的氨基酸序列如seq id no:3所示。将上述的oph基因序列的5’和3’端分别修饰ecor i和hind iii，得到带有ecor i和hind iii酶切位点的oph核苷酸序列，然后将全基因合成好的带有ecor i和hind iii酶切位点的oph核苷酸序列构建到pet22b( )(novagen公司，美国)质粒上，命名为pet22b( )-oph。
25.生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成linker-rnp核苷酸序列，rnp其氨基酸序列如seq id no:5所示，核苷酸序列如seq id no:6所示。linker核苷酸序列如seq id no:7所示。在linker的5’带有hind iii酶切位点，rnp的3’带有xho i酶切位点。然后将上述合成的linker-rnp核苷酸序列构建在puc18质粒(stratagene,la jolla,ca,usa)上，将的得到的重组质粒记为为puc18-linker-rnp质粒。
26.seq id no:3：
27.mqtrrvvlksaaaagtllgglagcasvagsigtgdrintvrgpitiseagftlthehicgssagflrawpeffgsrkalaekavrglrraraagvrtivdvstfdigrdvsllaevsraadvhivaatglwfdpplsmrlrsveeltqfflreiqygiedtgiragiikvattgkatpfqelvlkaaaraslatgvpvtthtaasqrdgeqqaaifeseglspsrvcighsddtddlsyltalaargyligldhiphsaiglednasasallgirswqtrallikalidqgymkqilvsndwlfgfssyvtnimdvmdrvnpdgmafiplrvipflrekgvpqetlagitvtnparflsptlras
28.seq id no:4：
29.atgcaaacgagaagggttgtgctcaagtctgcggccgccgcaggaactctgctcggcggcctggctgggtgcgcgagcgtggctggatcgatcggcacaggcgatcggatcaataccgtgcgcggtcctatcacaatctctgaagcgggtttcacactgactcacgagcacatctgcggcagctcggcaggattcttgcgtgcttggccagagttcttcggtagccgcaaagctctagcggaaaaggctgtgagaggattgcgccgcgccagagcggctggcgtgcgaacgattgtcgatgtgtcgactttcgatatcggtcgcgacgtcagtttattggccgaggtttcgcgggctgccgacgttcatatcgtggcggcgaccggcttgtggttcgacccgccactttcgatgcgattgaggagtgtagaggaactcacacagttcttcctgcgtgagattcaatatggcatcgaagacaccggaattagggcgggcattatcaaggtcgcgaccacaggcaaggcgaccccctttcaggagttagtgttaaaggcggccgcccgggccagcttggccaccggtgttccggtaaccactcacacggcagcaagtcagcgcgatggtgagcagcaggccgccatttttgagtccgaaggcttgagcccctcacgggtttgtattggtcacagcgatgatactgacgatttgagctatctcaccgccctcgctgcgcgcggatacctcatcggtctagaccacatcccgcacagtgcgattggtctagaagataatgcgagtgcatcagccctcctgggcatccgttcgtggcaaacacgggctctcttgatcaaggcgctcatcgaccaaggctacatgaaacaaatcctcgtttcgaatgactggctgttcgggttttcgagctatgtcaccaacatcatggacgtgatggatcgcgtgaaccccgacgggatggccttcattccactgagagtgatcccattcctacgagagaagggcgtcccacaggaaacgctggcaggcatcactgtgactaacccggcgcggttcttgtcaccgaccttgcgggcgtca
30.seq id no:5：
31.psssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygap
gggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapggg npsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggn
32.seq id no:6：
33.ccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaac
34.seq id no:7：
35.ggcggaggtgggagcggaggtggcgggagcgaagcggcagctaaggaggcggctgccaaaggcggaggtgggagcggaggtggcgggagc
36.使用hind iii和xho i双酶切pet22b( )-oph和puc18-linker-rnp，所述双酶切体系为：
37.hind iii：1μl；
38.xho i：1μl；
39.10
×
buffer：2μl；
40.puc18-linker-rnp或pet22b( )-oph：5μl；
41.无菌水：补齐至20μl。
42.将上述体系加入离心管中并混合混匀，在37℃下酶切2-3h。然后按照胶回收试剂盒(宝生物工程有限公司，大连)方法回收linker-rnp基因片段和线性化的pet22b( )-oph。把胶回收得到的linker-rnp基因片段和pet22b( )-oph通过t4连接酶(宝生物工程有限公司，大连)连接。所述连接体系为：
43.10
×
t4 ligase buffer：2μl；
44.pet22b( )-oph：依回收浓度而定；
45.puc18-linker-rnp：依回收浓度而定；
46.t4 dna ligase(10u/μl)：1μl；
47.无菌水：补齐至20μl。
48.上述连接反应在16℃的培养箱中反应18h，反应结束后得到重组质粒pet22b( )-oph-linker-rnp，命名oph-linker-rnp，所述oph-linker-rnp的氨基酸序列如seq id no:1所示，编码oph-linker-rnp的核苷酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列和限制酶位点如图1所示。
49.seq id no:1：
50.mqtrrvvlksaaaagtllgglagcasvagsigtgdrintvrgpitiseagftlthehicgssagflrawpeffgsrkalaekavrglrraraagvrtivdvstfdigrdvsllaevsraadvhivaatglwfdpplsmrlrsveeltqfflreiqygiedtgiragiikvattgkatpfqelvlkaaaraslatgvpvtthtaasqrdgeqqaaifeseglspsrvcighsddtddlsyltalaargyligldhiphsaiglednasasallgirswqtrallikalidqgymkqilvsndwlfgfssyvtnimdvmdrvnpdgmafiplrvipflrekgvpqetlagitvtnparflsptlrasggggsggggseaaakeaaakggggsggggspsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggnpsssygapgggn
51.seq id no:2
52.atgcaaacgagaagggttgtgctcaagtctgcggccgccgcaggaactctgctcggcggcctggctgggtgcgcgagcgtggctggatcgatcggcacaggcgatcggatcaataccgtgcgcggtcctatcacaatctctgaagcgggtttcacactgactcacgagcacatctgcggcagctcggcaggattcttgcgtgcttggccagagttcttcggtagccgcaaagctctagcggaaaaggctgtgagaggattgcgccgcgccagagcggctggcgtgcgaacgattgtcgatgtgtcgactttcgatatcggtcgcgacgtcagtttattggccgaggtttcgcgggctgccgacgttcatatcgtggcggcgaccggcttgtggttcgacccgccactttcgatgcgattgaggagtgtagaggaactcacacagttcttcctgcgtgagattcaatatggcatcgaagacaccggaattagggcgggcattatcaaggtcgcgaccacaggcaaggcgaccccctttcaggagttagtgttaaaggcggccgcccgggccagcttggccaccggtgttccggtaaccactcacacggcagcaagtcagcgcgatggtgagcagcaggccgccatttttgagtccgaaggcttgagcccctcacgggtttgtattggtcacagcgatgatactgacgatttgagctatctcaccgccctcgctgcgcgcggatacctcatcggtctagaccacatcccgcacagtgcgattggtctagaagataatgcgagtgcatcagccctcctgggcatccgttcgtggcaaacacgggctctcttgatcaaggcgctcatcgaccaaggctacatgaaacaaatcctcgtttcgaatgactggctgttcgggttttcgagctatgtcaccaacatcatggacgtgatggatcgcgtgaaccccgacgggatggccttcattccactgagagtgatcccattcctacgagagaagggcgtcccacaggaaacgctggcaggcatcactgtgactaacccggcgcggttcttgtcaccgaccttgcgggcgtcaggcggaggtgggagcggaggtggcgggagcgaagcggcagctaaggaggcggctgccaaaggcggaggtgggagcggaggtggcgggagcccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaaccc
aagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaacccgagcagcagttatggcgcgccgggcggtgggaacccaagcagtagttatggcgcgccggggggcggaaaccctagtagcagctatggcgcgccgggtggaggcaaccccagcagcagttatggcgcgccgggaggtggtaaccccagcagtagctatggcgcgccgggcggtggaaac
53.实施例2：扩大培养表达oph-linker-rnp的大肠杆菌
54.(1)采用标准热激法将实施例1中得到的重组质粒pet22b( )-oph-linker-rnp转化进入大肠杆菌bl21(de3)感受态中，得到转化的重组大肠杆菌bl21(de3)。然后将重组大肠杆菌bl21(de3)转移至补充有50μg/ml卡那霉素的固体lb培养基(琼脂粉15g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph7.4)中，并在37℃下过夜培养然后将过夜培养后的单个菌落转移至5ml含有50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph7.4)中，并在37℃、200rpm的轨道振荡器中培养过夜，接着取3ml过夜培养的大肠杆菌bl21接种在300ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基在37℃、200rpm下生长3小时，直至大肠杆菌bl21的od
600
达到0.4-0.6。
55.(2)将步骤(1)中得到的含有重组大肠杆菌bl21(de3)的lb液体培养基置于冰上20分钟，向其中添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)至终浓度0.4mm，然后分别在25℃和37℃以180rpm摇动培养16-20h来诱导重组有机磷水解酶oph-linker-rnp表达。诱导表达结束后，将液体培养基在3000rpm，4℃下离心20分钟弃上清，得到不同温度下培养的细胞沉淀物，将其保存在-80℃备用。
56.(3)将步骤(2)中25℃和37℃培养温度下得到的细胞沉淀物解冻，分别重悬于10ml tris-hcl(50mm，ph 8.0)中，并在3000rpm，4℃下离心20分钟后弃上清，收集菌体，菌体用50mm ph值为8.0的tris-hcl洗涤两次。然后将细胞重悬于含1mm苯甲基磺酰氟(pmsf，200μl)的20ml tris-hcl缓冲液中，并使用超声细胞破碎仪在冰上超声裂解30分钟，接着6s交替超声处理，并间歇冷却6s，整个反应保证在冰水浴下进行，得到裂解液。超声结束后，裂解液4℃，14,000rpm离心30min，得到上清液和沉淀，上清移至新的ep管中，保存上清和沉淀。
57.本实施例中为了确定表达的oph-linker-rnp是以什么形式存在的，将上述得到的裂解液、上清液和沉淀进行sds-page分析，分析结果如图2所示。图2为oph-linker-rnp诱导表达sds-page图，从图中可以看出，在25℃诱导条件下，oph-linker-rnp上清中目标大小75kda位置处明显增加一条条带，表明诱导成功，获得可溶性重组oph-linker-rnp，因此重组oph-linker-rnp是以可溶形式存在的。
58.实施例3：盐析加热纯化oph-linker-rnp
59.本实施例中利用盐析加热纯化oph，以此验证实施例2中制备的oph的纯化性能及其纯化效率。将适量浓度为0.3-2.0m的(nh4)2so4加到500μl澄清的样品裂解物中，4℃放置30min，使蛋白充分沉淀后15000g离心30min，取沉淀重新溶解于pbs溶液中。将溶解在pbs的溶液在磁力搅拌加热器上分别在50、60、70、80℃加热15min，室温下自然冷却后于4℃、15000g离心15min收集上清液，获得可溶性的蛋白溶液即目标蛋白oph-linker-rnp。将纯化样品进行sds-page电泳检测及后续酶活检测。
60.图3为将重悬的pbs缓冲液不同温度下(50、60、70、80℃)加热15min的sds-page图，从图中可以看出，70-80℃纯化效果最佳。图4是不同温度下加热15min的oph-linker-rnp回收率与纯化倍数，结果表明70-80℃纯化倍数和回收率分别可达到9.39、9.51倍和81.12％、79.23％，进一步表明70-80℃纯化效果最佳。与通过构建含有his标签的重组蛋白通过ni-nta affinity纯化相比，本发明中所述方法得到的蛋白纯化倍数相当，但是只需经过盐析、加热简单的纯化过程就能获得目标蛋白，操作简单，纯化时间短，同时避免了亲和色谱层析法繁琐的实验过程。
61.实施例4：oph-linker-rnp的热稳定性和储存稳定性实验
62.oph水解有机磷化合物的产物之一对硝基酚在400nm处有吸收，因此用吸光度法检测水解产物对硝基酚的浓度来计算有机磷水解酶的酶活。首先采用实施例3中获得oph-linker-rnp的方法，除不添加rnp外其他步骤均不变来获得oph-linker，并将其作为对照组。
63.1个oph酶活单位(u)定义为每分钟水解1μmol/l的对氧磷所需的酶量。oph水解底物(对氧磷)生成的副产物对硝基酚(p-nitrophenol，pnp)在400nm具有最大光吸收，因此oph通过测定反应体系中吸光值的变化来进行。所述测定方法为：在紫外可见光分光光度计(beckman du-800)上400nm处测定2min内酶活反应体系吸光值的变化。
64.酶活反应体系如下所示：445μl浓度为250mm的ches缓冲液(溶解1.244g ches于40ml灭菌去离子水中，用1m naoh调ph9.0，加入甲醇定容到100ml)、440μl灭菌去离子水、5μl浓度为10mm的cocl2、10μl浓度为20mm对氧磷以及100μl有机磷水解酶溶液组成，共计1000μl。
65.将等量oph-linker-rnp和oph-linker在无反应液情况(只含有oph-linker-rnp或oph-linker溶液，没有反应溶液)下分别在不同温度(20-80℃)中放置30分钟。然后将酶转移到室温调整酶温度，12000rpm离心10分钟，去除变性和沉淀的蛋白质。按上述方法测定oph酶活，以最高点酶活作为100％，其它酶活值与最高点酶活值作比较，绘制不同温度对相对活性的曲线。
66.图4为oph-linker-rnp和oph-linker的热稳定性图，从图中可以看出，oph-linker-rnp和oph-linker在不同温度下的相对酶活。当温度升高到50℃时，oph-linker酶活性只有44.68％，oph-linker-rnp仍可以保持82.20％活性；60℃时，oph-linker酶活性只有28.81％，oph-linker-rnp仍可以保持80.43％活性；80℃时，oph-linker酶活性只有8.81％，oph-linker-rnp仍可以保持59.56％活性。由此可以得出，本发明所制备的oph-linker-rnp具有良好的热稳定性。
67.本实施例中还考察了oph-linker-rnp和oph-linker的储存稳定性。将oph-linker-rnp和oph-linker酶25℃中保存，然后分别在储存0、6、12、24、36、42、48天时按照实施例4所述方法检测酶活，并以最高点酶活为100％，其它酶活与最高点酶活作比较，同时绘制时间对相对酶活的曲线。
68.图5为oph-linker-rnp和oph-linker的储存稳定性图，即oph-linker-rnp和oph-linker在储存不同天数时的相对酶活。从图中可以看出在25℃下条件下，oph-linker-rnp酶的活性高oph-linker酶活性。
69.综上，oph-linker-rnp酶的热和储存稳定性都明显高于oph-linker酶。本发明所
述的改造后的oph的热和储存稳定性显著提高，同时可以快速、高效地自我分离纯化。结果表明，这种策略可以广泛应用于酶学性质的改进，加速了酶在oph生产、生活中的应用，具有重要的社会和经济意义。
70.实施例5：oph-linker-rnp对有机农药降解效果
71.测定oph-linker-rnp对3种常见有机磷农药(甲基对硫磷、甲胺、毒死蜱)降解效率。测定方法为990ul tris-hcl缓冲液(50mm，ph 7.0)中加入10ul农药底物母液(终浓度2mm)以及1u纯化的oph-linker-rnp，30℃条件下反应30min。取反应液稀释过滤后进行高效液相色谱检测。
72.甲基对硫磷hplc分析条件为：c18柱；乙腈/水(70:30，v/v)；1.0ml/min；273nm。
73.甲胺hplc分析条件为：c18柱；乙腈/水(70:30，v/v)；1.0ml/min；225nm。
74.毒死蜱hplc分析条件为：c18柱；甲醇/水(90:10，v/v)；1.0ml/min；230nm。
75.结果显示oph-linker-rnp对所测试的甲基对硫磷、甲胺、毒死蜱的降解率分别为89.1％、64.2％、41.2％，表明对所测试的有机磷农药均能降解。
76.所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。