治疗癌症的方法与流程

1.本披露总体上涉及治疗癌症的方法。


背景技术：

2.wee1是一种核激酶，属于蛋白激酶的丝氨酸/苏氨酸家族。wee1通过在两个不同位点(tyr15和thr14)磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)来抑制cdk。因此，wee1在调节有丝分裂进入和dna复制起始、细胞大小和dna损伤检查点方面发挥作用。已经测试了wee1的抑制剂作为单一疗法以及与其他癌症治疗组合用于治疗癌症。
3.施拉芬(schlafen)11(slfn11)属于施拉芬蛋白质家族，并且仅在人类和一些灵长类动物中表达。已经发现癌细胞中slfn11的失活导致对引起dna损伤和复制应激(replication stress)的抗癌剂产生抗性。因此，slfn11是对不同种类的dna损伤剂和parp抑制剂具有敏感性的决定因素。参见zoppoli等人，pnas 2012；109：15030-35；murai等人，oncotarget[肿瘤靶标]2016；7：76534-50；murai等人，mol.cell[分子细胞]2018；69：371-84。
[0004]
已经开发并批准了许多癌症治疗方法。然而，一些癌症治疗仅对部分患者有效。此外，部分癌症患者对某些癌症治疗产生抗性。因此，对用于鉴定对癌症治疗有响应的患者的方法存在需求，这些方法使得癌症治疗可以靶向合适的患者。另外，对用于逆转在一些患者中观察到的对癌症治疗的抗性的方法存在需求。


技术实现要素：

[0005]
本文所述的方法满足上述需求。特别地，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞是否是slfn11缺陷型；以及，c)如果该患者的癌细胞是slfn11缺陷型，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0006]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达是否较低；以及，c)如果相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达较低，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0007]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，c)如果slfn11的表达水平＜10％，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，slfn11的表达水平为0％。
[0008]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞是否是slfn11缺陷型；以及，b)如果该患者的癌细胞是slfn11缺陷型，则向该患者共同施用wee1抑制剂与dna损伤剂。在一些实施例
中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0009]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达是否较低；以及，b)如果相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达较低，则向该患者共同施用wee1抑制剂与dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0010]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，b)如果slfn11的表达水平＜10％，则向患者共同施用wee1抑制剂与dna损伤剂。在一些实施例中，slfn11的表达水平为0％。
[0011]
在一些实施例中，slfn11的表达水平通过免疫组织化学、质谱法、原位杂交、nanostring、逆转录定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)、微阵列分析、亚硫酸氢盐测序、或定量甲基化特异性聚合酶链式反应(q-msp)确定。在具体实施例中，slfn11的表达水平通过免疫组织化学确定。
[0012]
在本文披露的方法的一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、颈脑癌、食管癌、甲状腺癌、胃癌、胆囊癌、肝癌、绒毛膜癌、子宫体癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤和头颈癌。
[0013]
在本文披露的方法的一些实施例中，dna损伤剂选自由以下组成的组：吉西他滨、依托泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、吡铂、甲氨蝶呤、阿霉素、柔红霉素、5-氟尿嘧啶、伊立替康、丝裂霉素、替莫唑胺、拓扑替康、喜树碱、表柔比星、伊达比星、曲贝替定、卡培他滨、苯达莫司汀、氟达拉滨、羟基脲、曲妥单抗德卢替康(trastuzumab deruxtecan)、和其药学上可接受的盐。
[0014]
在本文披露的方法的一些实施例中，wee1抑制剂是阿达沃替尼(adavosertib)或其药学上可接受的盐。
附图说明
[0015]
图1a分别示出了du145异种移植物(slfn11完善型(slfn11-proficient))和ht29异种移植物组织(slfn11缺陷型)中slfn11免疫组织化学(ihc)分析的阳性和阴性染色。
[0016]
图2a示出了slfn11野生型(wt)和敲除(ko)du145同基因细胞中slfn11和gapdh的免疫印迹。ko 1和ko 2是两个不同的crispr-ko克隆。
[0017]
图2b示出了用吉西他滨(gem.)和阿达沃替尼的组合处理野生型slfn11(wt)或slfn11敲除du145细胞系(ko1和ko2)产生的协同作用得分(loewe)。
[0018]
图2c示出了用依托泊苷(etp)和阿达沃替尼的组合处理野生型slfn11(wt)或slfn11敲除du145细胞系(ko1和ko2)产生的协同作用得分(loewe)。
[0019]
图2d示出了在du145同基因细胞中在不存在或存在0.36μm阿达沃替尼的情况下，指明的dna损伤剂(吉西他滨、依托泊苷、喜树碱、顺铂和羟基脲)的存活曲线。
[0020]
图3a示出了吉非他滨单一疗法在一组slfn11缺陷型或slfn11完善型的胰腺细胞
系中的log ic
50
值。
[0021]
图3b示出了阿达沃替尼单一疗法在一组slfn11缺陷型或slfn11完善型的胰腺细胞系中的log ic
50
值。
[0022]
图3c示出了吉非他滨和阿达沃替尼的组合在一组slfn11缺陷型或slfn11完善型的胰腺细胞系中的协同作用得分。
具体实施方式
[0023]
虽然在本文示出并描述了本发明的实施例，但是对本领域技术人员而言应当清楚的是此类实施例仅以示例性的方式提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员能想到众多变化、改变和取代。应该理解，可以采用本文所述的实施例的各种替代方案。本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
[0024]
定义
[0025]
如本文所使用的，术语“治疗(treat、treating或treatment)”和其他语法等同物，包括缓解、消除或减轻疾病或病症或其一个或多个症状，减轻症状的基础代谢病因，抑制疾病或病症，减轻疾病或病症，引起疾病或病症的消退，减轻由疾病或病症引起的状况，或终止疾病或病症的症状。
[0026]
如本文所使用的，术语“施用(administer、administering、administration)”和它们的语法等同物是指用于将本文披露的药物组合物递送至所希望的生物作用位点的方法。
[0027]
如本文所使用的，术语“共同施用”、“组合施用”和它们的语法等同物意在涵盖将活性剂施用至单一个体，并且(除非另外说明)包括如下治疗方案，其中通过相同或不同的施用途径或在相同或不同的时间施用这些药剂。它们包括以分开的组合物同时施用、以分开的组合物在不同的时间施用、或以一种组合物(其中存在一种或多种活性剂)施用。
[0028]
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指不消除活性剂的生物学活性或性质且相对无毒的物质，例如载体或稀释剂，即可以向个体施用所述物质，而不会引起不希望的生物效应或者不会引起以有害的方式与包含所述物质的组合物的任何组分相互作用。
[0029]
如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指保留了活性剂的游离酸或碱的生物有效性且不是在生物学上或其他方面所不希望的盐。活性剂可以与无机或有机碱，或无机或有机酸反应，以形成药学上可接受的盐。这些盐可以在最终分离和纯化期间原位制备，或通过使纯化的化合物与合适的无机或有机碱、或无机或有机酸单独反应并且分离因此形成的盐来制备。
[0030]
术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中也可互换使用。如本文所使用的，他(她)们是指患有癌症的人。
[0031]
如本文所使用的，术语“slfn11的表达水平是”某个量(例如，0％)意指患者癌症组织中陈述的量的癌细胞表达slfn11。类似地，如本文所使用的，术语“slfn11的表达水平＜”某个量(例如，10％)意指患者癌症组织中小于陈述的量的癌细胞表达slfn11。
[0032]
如本文所用，术语“slfn11缺陷型”是指在相关患者、动物、组织、细胞等中slfn11的表达水平，其不足以表现与基因相关的正常表型，或不足以表现蛋白质的生理功能。在临床前模型背景下，敲除(ko)slfn11基因的细胞或动物是“slfn11缺陷型”的实例。
[0033]
如本文所用，术语“slfn-11完善型”是指在相关患者、动物、组织、细胞等中slfn11的表达水平，其足以表现与基因相关的正常表型，或足以表现蛋白质的生理功能。在临床前模型背景下，slfn11基因以正常水平表达的细胞或动物，即野生型(wt)细胞或动物，是“slfn11完善型”的实例。
[0034]
治疗方法
[0035]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞是否是slfn11缺陷型；以及，c)如果该患者的癌细胞是slfn11缺陷型，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0036]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达是否较低；以及，c)如果相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达较低，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0037]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，c)如果slfn11的表达水平＜25％，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，c)如果slfn11的表达水平＜20％，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，c)如果slfn11的表达水平＜15％，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该方法包括：a)选择被诊断为患有癌症的患者；b)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，c)如果slfn11的表达水平＜10％，则向该患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜9％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜8％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜7％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜6％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜5％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜4％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜3％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜2％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜1％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平为0％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。
[0038]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞是否是slfn11缺陷型；以及，b)如果该患者的癌细胞是slfn11缺陷型，则向该患者共同施用wee1抑制剂与dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0039]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达是否较低；以及，b)如果相对于该患者的表达slfn11的非癌细胞，该患者的癌细胞中slfn11的表达较低，则向该患者共同施用wee1抑制剂与dna损伤剂。在一些实施例中，患者的癌细胞是slfn11表达阴性的。
[0040]
在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，b)如果slfn11的表达水平＜25％，则向患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，b)如果slfn11的表达水平＜20％，则向患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，b)如果slfn11的表达水平＜15％，则向患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，本文披露了治疗患者的癌症的方法，该患者对dna损伤剂的治疗具有抗性，该方法包括：a)确定该患者的癌细胞中slfn11的表达水平；以及，b)如果slfn11的表达水平＜10％，则向患者共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜9％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜8％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜7％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜6％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜5％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜4％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜3％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜2％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平＜1％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。在一些实施例中，如果slfn11的表达水平为0％，则共同施用wee1抑制剂和dna损伤剂。
[0041]
在本文披露的方法中，slfn11的表达水平可以通过本领域普通技术人员熟知的任何合适的方法来确定。在一些实施例中，slfn11的表达水平通过mrna转录物水平或dna启动子超甲基化确定。在一些实施例中，slfn11的表达水平通过免疫组织化学、质谱法、原位杂交、nanostring、逆转录定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)、微阵列分析、亚硫酸氢盐测序、或定量甲基化特异性聚合酶链式反应(q-msp)确定。在具体实施例中，slfn11的表达水平通过免疫组织化学(ihc)确定。
[0042]
疾病
[0043]
本文所述的方法可用于治疗多种癌症。在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、脑癌、颈脑癌、食管癌、甲状腺癌、胃癌、胆囊癌、肝癌、绒毛膜癌、子宫体癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、睾丸癌、皮肤癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤和头颈癌。在一些实施例中，癌症是胰腺癌。在一些实施例中，癌症是卵巢癌。在一些实施例中，癌症是抗铂性卵巢癌。在一些实施例中，癌症是子
宫内膜癌。在一些实施例中，癌症是乳腺癌。
[0044]
wee1抑制剂
[0045]
阿达沃替尼的化学名称为2-烯丙基-(1-[6-(1-羟基-1-甲基乙基)吡啶-2-基]-6-{[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]氨基}-1，2-二氢-3h-吡唑并[3，4-d]嘧啶-3-酮，并且具有以下化学结构：
[0046][0047]
阿达沃替尼作为wee1抑制剂的活性、治疗多种癌症的效用和合成描述于美国专利号7,834,019中。阿达沃替尼的多种晶型描述于美国专利号8,703,779和8,198,281中。在一些实施例中，在本文所述的方法中施用的wee1抑制剂是阿达沃替尼或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，在本文所述的方法中施用的wee1抑制剂是阿达沃替尼。
[0048]
3-(2，6-二氯苯基)-4-亚氨基-7-[(2
′‑
甲基-2
′
，3
′‑
二氢-1
′
h-螺[环丙烷-1，4
′‑
异喹啉]-7
′‑
基)氨基]-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1h)-酮是wee1抑制剂，其具有以下化学结构：
[0049][0050]
3-(2，6-二氯苯基)-4-亚氨基-7-[(2
′‑
甲基-2
′
，3
′‑
二氢-1
′
h-螺[环丙烷-1，4
′‑
异喹啉]-7
′‑
基)氨基]-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1h)-酮作为wee1抑制剂的活性、治疗癌症的效用和合成描述于美国专利号8,436,004中。在一些实施例中，在本文所述的方法中施用的wee1抑制剂是3-(2，6-二氯苯基)-4-亚氨基-7-[(2
′‑
甲基-2
′
，3
′‑
二氢-1
′
h-螺[环丙烷-1，4
′‑
异喹啉]-7
′‑
基)氨基]-3，4-二氢嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2(1h)-酮。
[0051]
dna损伤剂
[0052]
如本文所使用的，“dna损伤剂”或“dda”是通过引起癌细胞的dna损伤而发挥癌症治疗功能。dda通过多种机制起作用，包括dna交联、干扰dna复制和抑制dna合成。可以在本文所述的方法中使用的dda的非限制性实例包括吉西他滨、依托泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、吡铂、甲氨蝶呤、阿霉素、柔红霉素、5-氟尿嘧啶、伊立替康、丝裂霉素、替莫唑胺、拓扑替康、喜树碱、表柔比星、伊达比星、曲贝替定、卡培他滨、苯达莫司汀、氟达拉滨、羟基脲、曲妥单抗德卢替康、和其药学上可接受的盐。
[0053]
组合疗法
[0054]
在一些实施例中，在本文披露的方法中共同施用的wee1抑制剂和dda与一种或多种另外的癌症疗法共同施用。医师能够根据患者的特定特征和所治疗的癌症来确定一种或多种另外的癌症疗法以共同施用于患者。可以根据本文所述的方法在施用wee1抑制剂和
dda的同时、之前或之后施用一种或多种另外的癌症疗法。在一些实施例中，一种或多种另外的癌症疗法选自电离辐射、微管蛋白相互作用剂、驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂、纺锤体检查点抑制剂、聚(adp-核糖)聚合酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、bcl-2抑制剂、热激蛋白调节剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、抗雌激素、选择性雌激素受体调节剂、抗雄激素、lhrh激动剂、5α-还原酶抑制剂、细胞色素p450 c17裂解酶抑制剂、芳香化酶抑制剂、egfr激酶抑制剂、erbb1和erbb2双重抑制剂、abl激酶抑制剂、vegfr-1抑制剂、vegfr-2抑制剂、polo样激酶抑制剂、极光激酶抑制剂、jak抑制剂、c-met激酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、pi3k抑制剂和mtor抑制剂。
[0055]
实例
[0056]
以下提供的实例进一步说明和例证了本披露，并不以任何方式限制权利要求的范围。
[0057]
实例1：特异性针对slfn11的ffpe ihc分析的开发和du145slfn11 ko细胞系的表征。
[0058]
方法
[0059]
通过crispr/cas9进行du145前列腺癌细胞中slfn11的敲除。使用内部crispr3软件设计靶向外显子4(前间区序列邻近基序加粗)中slfn11的sgrnas，通过dna集成技术公司(integrated dna technology)(idt)合成，并克隆到含有cas9和gfp盒的载体(azpge02-cas9-t2a-gfp)中。随后使用脂质体3000(lipofectamine3000，赛默飞世尔科技公司(thermofisher scientific))将载体转染到du145前列腺癌细胞中。48小时后，将具有最高绿色荧光蛋白(gfp)表达的细胞池单细胞分选到96孔板中。对已失去野生型等位基因的克隆进行扩增，以从单一克隆中获得细胞系。描绘并选择了两个slfn11缺陷型克隆，用于药理研究(克隆ko1和克隆ko2)。制备来自slfn11完善型(wt)和来自slfn11缺陷型(ko1和ko2)的细胞裂解液，并通过标准sds-page免疫印迹进行分析。用于免疫印迹检测的抗体是：抗slfn11抗体(ab121731，1∶1000，艾博抗公司(abcam))，和作为上样对照的抗gapdh抗体(14c10，1∶2000，cst)。
[0060]
根据英国内政部立法和动物科学程序法1986(aspa)阿斯利康全球生物伦理政策(astrazeneca global bioethics policy，uk home office legislation and the animal scientific procedures act 1986(aspa))，培养了du145(slfn11完善型)和ht29(slfn11缺陷型)异种移植物。对福尔马林固定的石蜡包埋的组织的4μm厚肿瘤切片进行slfn11免疫组织化学，并使用er1抗原修复在bond rx(徕卡显微系统公司(leica microsystems))上实施。用初级兔多克隆抗slfn11抗体(艾博抗公司，ab121731)以0.5μg/ml对异种移植物组织切片的载玻片进行染色，并以2.5μg/ml对人组织切片的载玻片进行染色。使用20倍物镜，使用aperio at2扫描仪(莱卡公司)获取数字载玻片。
[0061]
结果
[0062]
slfn11阳性du145和slfn11阴性ht29组织的slfn11免疫组织化学证实了在这两个模型中分别存在和不存在slfn11(图1a)。
[0063]
实例2：可以通过与wee1抑制剂组合治疗来逆转du145 slfn11 ko细胞中对dda的抗性。
[0064]
方法
[0065]
阿达沃替尼在阿斯利康公司(astrazeneca)合成。吉西他滨、顺铂、羟基脲(hu)和依托泊苷获得自托克利斯公司(tocris)，喜树碱获得自西格玛公司(sigma)。在水溶液中制备吉西他滨(50mm)、顺铂(1.67mm)和hu(1m)的储备溶液；将所有其他药物以10mm的浓度溶解在二甲亚砜(dmso)(10mm)中。
[0066]
将du145同基因细胞(wt和slfn11 ko)接种在384孔板中，并使其沉降过夜。图2a示出了在实验中使用的slfn11 wt和ko du145同基因细胞的免疫印迹。ko 1和ko 2是两个不同的crispr-ko克隆。使用echo 555(labcyte公司)，用在6x6浓度矩阵中化合物溶液(含最高剂量的3μm阿达沃替尼、0.1μm吉西他滨和1μm依托泊苷)对细胞给药。连续处理五天后，通过活-死sytox绿色测定(生命科技公司(life technologies)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)测定细胞活力。活细胞数通过减去死细胞数和总读数来计算。使用这种方法，还可以在治疗点(第0天)确定每孔的细胞数。对于ti≥tz的值，使用公式[1-(ti-tz)/(c-tz)]x 100表示数据；对于ti＜tz，x 100的浓度，则使用[1-(ti-tz)/tz]x 100表示数据，其中ti＝经化合物处理的细胞；tz＝0h时间点的细胞，并且c＝对照细胞。这给出了0％-200％等级的活细胞数量，其中0％-100％表示生长抑制，而100％-200％表示细胞杀死。
[0067]
在genedata screener(genedata公司，瑞士巴塞尔)软件中使用loewe剂量加和模型来计算组合活性(协同作用)。如果两种化合物的效果在这两种单一疗法的基础上是累加的，则该模型计算出预期结果。超出得分反映了实验结果比预期的累加效果高出多少。该程序为组合提供了协同作用得分，既反映了超出得分的强度，又反映了剂量依赖性。得分＞5被认为具有协同作用。
[0068]
对于在96孔板中进行的细胞存活实验，在使用hp分配器进行化合物给药后，将细胞接种在96孔板中。72小时后，通过终点celltiter-glo发光测定(普洛麦格公司(promega))测定细胞活力。使用公式(t-t0)/(c-to)x 100计算生长百分比，其中t＝经化合物处理的细胞；t0＝0h时间点的细胞，并且c＝对照细胞。在graphpad prism中绘制剂量响应曲线。
[0069]
结果
[0070]
当与野生型、slfn11完善型细胞相比时，用阿达沃替尼和吉西他滨或依托泊苷的组合治疗在slfn11 ko细胞中始终产生更高的协同作用得分(分别为图2b和2c)。更高的协同作用得分表明，相对于野生型细胞，用wee1抑制剂和dda组合治疗(相对于用两种试剂中任一种的单一疗法的作用)在slfn11 ko细胞中更有效。通过较低通量的测定形式验证了组合协同作用实验。图2d中示出了指明的不同dda(吉西他滨、依托泊苷、喜树碱、顺铂和羟基脲)与阿达沃替尼的组合的结果。在所有情况下，当与野生型细胞(连续的灰线)相比，发现slfn11 ko细胞(灰色虚线)对每种dda都具有抗性。dda与阿达沃替尼的组合在slfn11完善型细胞(黑色实线)中未增加显著的抗增殖作用。然而，在slfn11 ko细胞中，与slfn11缺陷型细胞(以黑色虚线显示)中的dda单一疗法相比，相同的组合导致明显的曲线偏移，这证实了可以通过共同施用阿达沃替尼使这些细胞完全对dda治疗重新敏化。
[0071]
实例3：可以通过与wee1抑制剂组合治疗来逆转slfn11缺陷型细胞系中对吉西他滨的抗性。
[0072]
方法
[0073]
slfn11 rna seq数据(log2 rpkm值)从癌细胞系百科全书(ccle)(barretina j.
等人，nature[自然]，2012；483：603-607)下载，并且药物响应数据(log(ic
50
)及剂量响应曲线下面积(auc))从癌症数据库中药物敏感性(yang w等人，nucleic acids res[核酸研究]，2013；41：d955-61)下载。将ccle rna seq log2 rpkm值低于1的细胞系定义为slfn11缺陷型，并将log2 rpkm值大于1的细胞系定义为slfn11完善型。使用echo 555(labcyte公司)，在6x6浓度矩阵中用浓度递增的阿达沃替尼和吉西他滨对384孔板中的19个胰腺细胞系给药。阿达沃替尼的剂量范围为0-3μm，并且吉西他滨的剂量范围为0-0.3μm；在这两种情况下，均从最高剂量进行1∶3稀释。连续处理五天后，通过活-死sytox绿色测定(生命科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)测定细胞活力。如上所述，在genedata screener软件中使用loewe剂量加和模型来分析协同作用。
[0074]
结果
[0075]
在一组胰腺癌细胞系中证实了实例2中提出的结果。在该组中，在吉西他滨单一疗法的剂量响应治疗后，发现slfn11缺陷型细胞系的敏感性平均比slfn11完善型细胞低100倍(图3a)。slfn11缺陷型和slfn11完善型胰腺癌细胞系显示出对阿达沃替尼单一疗法治疗的相同响应(图3b)。然而，吉西他滨和阿达沃替尼的组合治疗在slfn11缺陷型胰腺癌细胞中比在slfn11完善型胰腺癌细胞中具有更显著的协同作用(图3c)。结果表明，与wee1抑制剂或dda的单一疗法相比，预期使用wee1抑制剂和dda的组合疗法在具有slfn11缺陷型癌细胞的患者中更有效。