用于声学过程的颗粒的制作方法

用于声学过程的颗粒


背景技术：

1.声泳至少部分是指使用声学例如声驻波或声行波分离材料。当颗粒和流体的可以被声学影响的参数存在差异时，包括驻波或行波在内的声波可以对流体中的颗粒施加力，所述参数包括密度和/或可压缩性，也称为声学对比因子(acoustic contrast factor)。驻波中的压力分布包含驻波波节处压力幅度局部减小和驻波波腹处压力幅度局部增加的区域。例如，取决于它们的密度和可压缩性，颗粒可以被驱动到驻波的波节或波腹。一般来说，声驻波的频率越高，可以操纵的颗粒越小。
2.在微观尺度，例如具有微米量级的结构尺寸，传统声泳系统使用宽度尺寸为一半或四分之一波长的声室，其在几兆赫的频率下厚度通常小于一毫米，并以非常低的流速(例如μl/min)运行。这种系统不可扩展，因为它们受益于极低的雷诺数、层流操作和最小的流体动力学优化。
3.在宏观尺度上，平面声驻波已用于分离过程。然而，单个平面波倾向于捕获颗粒或二次流体(secondary fluid)，从而通过关闭或去除平面驻波来实现与一次流体(primary fluid)的分离。由于能量耗散到与产生平面波和平面波能量本身有关的流体中，平面波还倾向于加热波在其中传播的介质。平面驻波的去除可能会阻碍连续操作。此外，用于产生声学平面驻波的功率量倾向于通过浪费能量来加热一次流体，这可能对正在加工的材料不利。
4.细胞选择/分离已经通过提供对靶细胞或细胞材料具有亲和力的功能化珠实现。所述珠具有允许它们与通常含有其它细胞或细胞材料的流体分离的特性。一种方法使用具有铁磁特性的珠，使得用磁场将它们分离。
5.在生命科学研究和治疗中，寻求对细胞进行操作以用于这种分开或分离的目的。例如，嵌合抗原受体(car)t细胞被开发用于治疗某些类型的癌症。已经开发了car t细胞疗法，其中使用基于磁力、电力、重力、微流体等的各种技术从细胞群中分离修饰的细胞。在一些应用中，感兴趣的细胞(在阳性选择中)与被功能化而具有对特定细胞的亲和力的颗粒例如珠连接。细胞-珠复合物暴露于可以影响珠的力下。例如，细胞-磁性颗粒复合物可以暴露于磁力，所述磁力可以影响磁性颗粒以允许复合物与和细胞-磁性颗粒复合物混合的其它材料分离。在细胞阳性选择的情况下，细胞-磁性颗粒复合物或靶材料可以被磁力保留，而其它非靶材料不保留。在细胞阴性选择的情况下，靶细胞以外的其它材料与珠结合，从而靶细胞不被磁力保留，因此可以与其它材料分离。
6.使用力的方式分离细胞材料的目的是获得高纯度并增加所需细胞的回收率。现有技术具有挑战，因为这些方法很难或不能实际地扩大规模。此外，一些技术已知会对细胞的健康产生不利影响。例如，一种技术使用磁珠将所需细胞与其它材料(通常是其它类型的细胞)分离。在这种方法中，细胞和细胞-磁珠复合物的混合物通过直径小于1mm的非常窄的柱/通道，柱中的珠暴露于强磁场。由于通道的尺寸相对小，自由流动的细胞会暴露于非常高的剪切流体力，这可能对细胞的健康是破坏的和损害的。由于暴露于强磁场而保持在柱壁上的细胞-珠复合物由于通常垂直于柱中流动方向的高磁力而经受甚至更高的剪切应
力。这种方法的另一个缺点是流速受到严格限制，这增加了处理时间并限制了该技术的放大能力。此外，一种这样的技术使用纳米大小的磁珠，它可能被细胞内化，这对于细胞疗法治疗可能是个问题。
7.发明概述
8.在本文的各种实例中，公开了用于声学响应颗粒的材料和方法，这些颗粒可以连接到细胞材料并受声场影响。公开了用于制造所述颗粒的材料和方法，包括功能化所述颗粒以连接特定的细胞类型或细胞材料。如本文所用，术语“颗粒”通常可与术语“珠”和/或“液滴”互换使用。所述颗粒被置于在声泳装置内，并且使用超声换能器来产生声场，该声场可以根据需要阻挡、集中、捕获、移动和/或一般地操纵所述颗粒。
9.如本文所讨论的，微米或纳米范围的颗粒用声场来操纵，该声场可以通过超声波产生，包括行波和/或驻波。声场影响颗粒以实现阻挡、捕获、集中、转运和/或声场可以施加在颗粒上的任何其它类型的操纵。通过流体动力学和粒子物理学可以增强声场对颗粒的影响。例如，使用声场将颗粒集中在某个区域可以产生边界状况，在所述边界状况形成压力差。这种压力差可以增强由声场产生的集中或分离效果。
10.本文讨论的颗粒可用于细胞分离。例如，这些颗粒可用于分离t细胞或嵌合抗原受体(car)t细胞以用于car t细胞治疗应用。所述颗粒还可用于其它类型的细胞和基因治疗应用，例如遗传修饰的cd34 细胞治疗。
11.在一些实施方案中，珠由具有脂质涂层的全氟碳液滴组成。通过制备脂质化合物、将全氟碳与脂质化合物混合并搅动该组合来制造珠。在一些实例中，使用该组合的离心来进行搅动以获得珠。通过功能化珠以具有可以将珠与还带有其它细胞或细胞材料的流体中的所需细胞结合的亲和力或连接，珠可用于细胞选择方法。珠-细胞复合物暴露于声场以操纵所述复合物，例如将复合物保留在特定区域中。
12.颗粒可以被构造成包括液体核心；和包裹液体核心的脂质壳。液体核心中的液体可以由全氟碳组成。全氟碳可以是全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷、全氟辛基溴、全氟二氯辛烷或全氟萘烷。
13.脂质壳可由二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、1,2-棕榈酰-磷脂酸(dppa)、脂质-聚乙二醇缀合物或脂质与白蛋白的复合物形成。脂质壳可以用例如链霉抗生物素蛋白、生物素、抗生物素蛋白、脱硫生物素、适体、寡核苷酸和/或抗体(在本文中统称为接头)部分或全部官能化。脂质壳可以完全或部分包裹液体核心。
14.已知为声学液滴汽化(adv)的方法可用于使用声波产生这种颗粒的液体核心从液体到气体的相移。液体的蒸气压是温度的函数，不一定基于液体化学。任何具有接近或低于体温的正常沸点的液体都可以用于这些方法。全氟碳因其低毒性和高对比因子而可用于这些方法。
15.间隔物可以置于颗粒和接头之间。间隔物可以是聚乙二醇(peg)分子。当材料与颗粒表面上的官能化分子结合时，peg分子可允许来自颗粒的较少电荷干扰。
16.在一些示例实施方案中，提供了使用声波进行细胞分离所用的声学响应珠/颗粒/液滴。颗粒可以具有由全氟碳例如正全氟己烷/正全氟戊烷/正全氟庚烷/全氟辛基溴或这些全氟碳的组合组成的液体核心。液体核心全部或部分用脂质化合物包封。可以为脂质化合物提供可以靶向细胞、抗体、病毒或适体的接头或配体。这些脂质化合物可以由如下一或
多种组成：peg 40硬脂酸酯、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、1,2-棕榈酰-磷脂酸(dppa)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)、dspc 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、dspc、pbs缓冲液、丙二醇、甘油、dspe-mpeg(2000)1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)生物素1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[生物素(聚乙二醇)-2000](铵盐)、dspe-peg(2000)脱硫生物素1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[脱硫生物素(聚乙二醇)-2000](铵盐)、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、dspe-peg(2000)马来酰亚胺1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](铵盐)或功能化脂质-甘油缀合物，作为例子，此处标记为dspe-peg5000-生物素。配体或接头可以由中性抗生物素蛋白(neutravidin)、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、生物素、脱硫生物素、适体、寡聚物如寡核苷酸和/或抗体组成。
[0017]
颗粒可以通过将脂质水溶液和全氟碳混合来制造，其可以被均质化/超声处理/膜乳化/机械搅动(小瓶混合)以产生所需的尺寸分布(基于应用)。下游离心可用于缩小颗粒分布的尺寸或用于洗涤目的。颗粒尺寸分布取决于用于制造液滴/珠/颗粒的方法。制造的颗粒尺寸可以在约400nm至约300微米的范围内。
[0018]
根据应用，液滴/颗粒/珠可以与一或多种不同类型的配体或接头例如中性抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/captavidi一起温育。最终的液滴/颗粒/珠用于进一步的应用，例如在声学设备中进行细胞选择或分选。最终的液滴/珠/颗粒溶液可以在溶液的水性部分中含有bsa/hsa或一些稳定剂/表面活性剂。
[0019]
液滴/颗粒/珠可用于细胞的阳性或阴性选择。在一些实例中，在封装中用脱硫生物素功能化的液滴/颗粒/珠用于细胞的阳性选择。通过添加生物素缓冲液，可以从复合物中洗脱液滴/颗粒/珠。液滴/颗粒/珠的功能化可以形成为与细胞结合的可逆连接。例如，可以分离生物素-中性抗生物素蛋白键以将液滴/颗粒/珠与细胞分离。
[0020]
根据示例性实施方式，提供了一种用于制造颗粒的方法，该方法包括制备脂质化合物、将全氟碳与液体化合物混合，以及搅动该组合。搅动可以通过离心、超声、均质或机械搅动中的一种或多种的组合来实现。可以实施搅动以获得预定的颗粒尺寸分布。颗粒尺寸分布可以在约400nm至约300微米的范围内。可以通过基于每种脂质的特性顺序组合不同的脂质来制造颗粒，例如制备具有脂质溶剂的溶液、加热溶液并按溶解度的顺序将不同的脂质添加到溶液中。
[0021]
脂质化合物可以包括dppa、dppc、dspc、peg40硬脂酸酯、dspe-mpeg(2000)、dspe-peg(2000)-生物素、dspe-peg-5000-生物素、dspe-peg(2000)-脱硫生物素、pbs缓冲液、甘油、丙二醇或dspe-peg(2000)-马来酰亚胺中的一或多种。全氟碳可以是全氟戊烷、全氟己烷、全氟辛烷、全氟辛基溴、全氟二氯辛烷或全氟萘烷中的一种或多种。颗粒可以用接头功能化，例如可逆接头，包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、生物素、脱硫生物素、抗体、适体或寡聚物中的一种或多种。颗粒可包括稳定剂或表面活性剂，其可在液体核心部分中。
[0022]
颗粒可用于从流体中分离靶颗粒的方法中，其中该方法包括在腔室中接收流体中的功能化颗粒，在腔室中接收靶颗粒，使靶颗粒与功能化颗粒结合，向腔室施加声波以影响功能化颗粒被声波收集或阻挡。
[0023]
开发的颗粒产生非常高的细胞纯度和回收率。声场存在下的声亲和性颗粒(acoustic affinity particle)在合理的时间内在所有规模都表现良好，不会损害细胞的输出和健康。
[0024]
在这项工作中，为了分离细胞的目的开发了声亲和性颗粒。由于细胞分离是基于声力的，因此选择具有高压缩性的生物相容性液体如全氟己烷(pfh)作为颗粒/液滴的核心。磷脂被用作乳化剂。对于细胞靶向，一种磷脂是生物素化的以及生物素-中性抗生物素蛋白相互作用用于靶向。在需要从全氟己烷液滴中洗脱细胞的应用中，封装中的常规生物素分子被脱硫生物素取代。设计液滴制造方法以实现响应声波的尺寸分布，同时应具有足够的表面积以与细胞结合。针对阴性和阳性选择应用研究了使用pfh液滴结合和分离细胞。在测试情况中，pfh液滴在声波存在下产生了靶细胞的高纯度和回收率。脱硫生物素可以与液滴缀合。在细胞的阳性选择中，液滴被修饰以从细胞-抗体-液滴复合物中洗脱，并且洗脱技术产生高洗脱效率，而对细胞没有任何不利影响。
[0025]
为了分离细胞的目的开发了声亲和颗粒。声响应液体如全氟己烷(pfh)用作核心，磷脂用作乳化剂。设计液滴制造方法以实现适合结合和良好声学响应的尺寸分布。生物素-中性抗生物素蛋白相互作用用于靶向。对于需要洗脱的细胞的阳性选择，封装中的常规生物素分子被脱硫生物素取代。在声波存在下进行阴性和阳性选择细胞分离，它产生了靶细胞的高纯度和回收率。
[0026]
所开发的颗粒旨在用于在各种嵌合抗原受体(car)t细胞治疗应用以及细胞和基因治疗应用如遗传修饰的cd34 细胞治疗中使用声波进行细胞分离。
[0027]
这些和其它非限制性特征在下面更具体描述。
[0028]
附图简述
[0029]
以下是附图的简要描述，其呈现的目的是为了说明本文公开的示例性实施方案，而不是为了限制它们。
[0030]
图1是显示在驻波场中施加在颗粒上的力的图。
[0031]
图2是显示在行波场中施加在颗粒上的力的图。
[0032]
图3是包含液体核心和脂质壳的颗粒的示意图。
[0033]
图4和图5是显示颗粒的尺寸分布的图。
[0034]
图6和图7是显示荧光强度对颗粒计数的图。
[0035]
详细描述
[0036]
通过参考以下希望的实施方案和其中包括的实施例的详细描述可以更容易地理解本公开。在以下说明书和所附权利要求书中，将提及许多术语，这些术语应定义为具有以下含义。
[0037]
尽管为了清楚起见在以下描述中使用了特定术语，但这些术语仅意在指代选择用于在附图中说明的实施方案的特定结构，而不是旨在定义或限制本公开的范围。在下面的附图和描述中，应当理解，类似数字指定是指具有类似功能的组件。
[0038]
单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
[0039]
如在说明书和权利要求书中使用的，术语“包含”可以包括实施方案“由
…
组成”和“基本上由
…
组成”。如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体是开放式的过渡性短语、术语或词，其允许存在除具体指明以外的其它成分/组分/步骤。然
而，这样的描述应该被解释为也描述组合物、制品或方法为“由”和“基本上由”所列举的成分/组分/步骤“组成”，其使得仅存在指定的成分/组分/步骤，以及具有任何可能由此产生的杂质，不包括其它成分/组分/步骤。
[0040]
本技术的说明书和权利要求书中的数值应理解为包括与减少到相同数目的有效数字时相同的数值以及与所述值相差小于本技术中描述的类型的用于确定该值的常规测量技术的实验误差的数值。
[0041]
本文公开的所有范围都包括所述端点并且可独立组合(例如，“从2克到10克”的范围包括端点2克和10克以及所有中间值)。
[0042]
术语“约”可以用于包括可以变化而不改变该值的基本功能的任何数值。当与范围一起使用时，“约”还公开了由两个端点的绝对值定义的范围，例如“约2到约4”也公开了“从2到4”的范围。术语“约”可以指指定数字的正负10％。
[0043]
一个值超过(或大于)第一阈值的陈述等价于该值满足或超过略大于第一阈值的第二阈值的陈述，例如，第二阈值是在相关系统的分辨率中比第一阈值高的一个值。一个值小于第一阈值(或在第一阈值内)的陈述等价于该值小于或等于略低于第一阈值的第二阈值的陈述，例如，第二阈值是在相关系统的分辨率中比第一阈值低的一个值。
[0044]
应注意，本文使用的许多术语是相对术语。例如，术语“上”和“下”在位置上是相对的，例如，在给定方向上，上部组件位于比下部组件更高的高度，但如果设备翻转，这些术语可能会发生变化。术语“入口”和“出口”是指相对于流过给定结构的流体，例如，流体通过入口流入结构并通过出口流出结构。术语“上游”和“下游”与流体流过不同组件的方向有关，例如，流体在流过下游组件之前先流过上游组件。应注意，在循环中，第一组件可以被描述为在第二组件的上游和下游。
[0045]
术语“水平”和“垂直”用于指示相对于绝对参照物例如地面水平的方向。然而，这些术语不应被解释为要求结构彼此绝对平行或绝对垂直。例如，第一垂直结构和第二垂直结构不一定彼此平行。术语“顶部”和“底部”或“基底”用于指相对于绝对参照物例如地球表面而言顶部始终高于底部/基底的表面。术语“向上”和“向下”也是相对于绝对参照物；向上总是对抗地球引力。
[0046]
本技术涉及“同一数量级”。如果较大数除以较小数的商的值至少为1且小于10，则两个数的数量级相同。
[0047]
术语“病毒”是指只能使用活细胞复制的感染物质，另外以由围绕并包含dna或rna的衣壳形成的病毒粒子的形式存在，在某些情况下衣壳周围还有脂质包膜。
[0048]
术语“晶体”是指用作压电材料的单晶或多晶材料。
[0049]
本公开涉及“微粒”。这个术语是指平均粒径为1微米(μm)至1000μm的颗粒。
[0050]
本公开涉及“纳米颗粒”。这个术语是指平均粒径为1纳米(nm)至小于1000nm的颗粒。
[0051]
本文讨论的一些材料被描述为具有平均粒径。平均粒径定义为达到颗粒总数的50％(以体积计)的累积百分比的粒径。换言之，50％的颗粒具有高于平均粒径的直径，50％的颗粒具有低于平均粒径的直径。颗粒的尺寸分布可以包括高斯分布，上四分位数和下四分位数分别为所述平均颗粒大小的25％和75％，并且所有颗粒小于所述平均颗粒大小的150％。可以提供或使用任何其它类型的分布。注意，颗粒不必是球形的。对于非球形颗粒，
粒径是具有与非球形颗粒相同体积的球形颗粒的直径。
[0052]
颗粒在本文中可被描述为具有“核”和“壳”结构。术语“颗粒”是指可以悬浮在流体例如液体或气体中并且可以处于任何相例如固体、液体或气体及其组合中的任何类型的单独结构。
[0053]
本文提及“有机”和“无机”材料。出于本公开的目的，“有机”材料由碳原子(通常具有其它原子)制成，而“无机”材料不包含碳原子。
[0054]
本公开可涉及某些方法步骤的温度。在本公开中，温度通常是指所提及的材料达到的温度，而不是指热源(例如炉子、烘箱)设置的温度。术语“室温”是指从68
°
f(20℃)到77
°
f(25℃)的范围。
[0055]
在细胞处理中，如可能用于开发car t细胞疗法，使用基于磁力、电力、重力或微流体等仅举几例的各种技术将所需细胞从主群中分离出来。在一些应用中，使用抗体或适体或寡聚物将感兴趣的细胞(在阳性选择中)附着于颗粒/珠上，并且将细胞-珠复合物流过暴露于基于颗粒性质的力的区域/腔室。例如，细胞-磁性颗粒复合物可以通过暴露于磁力的腔室/柱。在细胞的阳性选择的情况下，腔室中保留的细胞是所需的细胞，而在阴性选择中，未保留在腔室中的细胞是所需的细胞。
[0056]
在声学细胞处理中，所需细胞与从中寻求分离或分开所需细胞的液体中的其它细胞材料或细胞一起被夹带。使用可包括抗体、适体、寡聚物或任何其它合适的细胞-珠连接机制的连接机制将感兴趣的细胞(在阳性选择中)附着或结合于声学响应珠。将细胞-珠复合物和与其一起被夹带的材料一起流过将它们暴露于影响珠的声场的区域/腔室。在细胞阳性选择的情况下，所需细胞被声场保留(通过珠)，而在阴性选择的情况下，所需细胞不被声场保留。
[0057]
使用本文讨论的珠对细胞进行声学分开/分离技术优于其它技术，因为可以获得高纯度结果以及所需细胞的高百分比回收率，同时保持细胞健康和完整性。此外，声学细胞处理可以按比例扩大，同时对细胞的健康几乎没有或没有有害影响。例如，由于声场的操纵，细胞和细胞-珠复合物很少或没有经历额外的剪切应力。此外，由于本文讨论的声学细胞处理是宏观过程，因此其在流速上没有严格限制，并且可以具有比传统技术更高的通量和更短的处理时间。进一步地，本文讨论的珠对人体无毒，因此在治疗性制造过程中的使用比传统的磁珠更具吸引力。
[0058]
本公开涉及与包括超声换能器的声泳装置联合使用的颗粒。超声换能器产生声波，可用于以各种方式操纵颗粒。例如，声波可用于阻止颗粒移动到特定区域，可用于移动颗粒到和/或保留颗粒在期望的位置或轨道。根据需要，所述颗粒可以是微粒或纳米颗粒。所述颗粒是声学响应性的。所述颗粒可以称为珠或液滴，每个术语在本文中可以互换使用。
[0059]
如上所述，颗粒通常是微粒或纳米颗粒。所述颗粒的形状可以是球形的或可以变化的，例如颗粒可以是椭圆形的或沿纵轴伸长的。例如，由多个不同层制造颗粒可用于获得所需的密度和所需的声学对比因子，或获得颗粒的所需行为或相互作用。所述颗粒可能由高度声学响应性的全氟碳(pfc)组成。
[0060]
等式1给出了平面驻波中对流体悬浮液中颗粒的声辐射力fr的解析表达式。pfc液滴的声学对比因子x(等式2)为负，这意味着它将进入压力波腹，这与大多数市售珠不同，后者进入声学驻波场中的压力波节。全氟己烷(pfh)、cospheric珠、promega珠和plga的声学
对比因子分别为-0.97、0.18、0.18和0.3。图1显示了关于pfh液滴，对不同材料的珠的力的大小比较。图1示出，对于相同大小和激发参数，pfh液滴在声学上比其它市售珠更具响应性。高声学响应可归因于pfh中的低声速。
[0061][0062][0063]
其中：p0是压力幅度，v
p
是颗粒的体积，βf是流体的可压缩性，λ是波长，k是波数，ρ
p
是颗粒密度，ρf是流体密度，及x是声学对比因子。
[0064]
等式3呈现了平面行波中对流体悬浮液中颗粒的声辐射力fr的解析表达式。在行波中，所述力沿波传播方向作用。该表达式表明所述力主要取决于颗粒的密度。
[0065][0066]
图2显示了根据标准化pfh液滴，声学行波场中对由不同材料制成的珠的声力大小比较。图2示出对于相同的大小和激发参数，pfh液滴在声学上比市售的珠更具响应性。这里的高声学响应性可归因于液体全氟己烷的高密度。
[0067]
一般而言，本公开的颗粒可以用可以由声波产生的声场来操纵，声波可以是驻波或行波。可以产生声场以在界面区域附近形成压力升高，从而对颗粒产生屏障。
[0068]
本文讨论的声学装置可以以多模式或平面模式操作。多模式是指由声学换能器产生声波，在三个维度上产生声力。多模式声波，可以是超声波，由一个或多个声学换能器产生，并且在本文中有时被称为多维或三维声驻波。平面模式是指由声学换能器产生声波，其基本上在一维中例如沿传播方向产生声力。这种以平面模式产生的声波，可以是超声波，在本文中有时被称为一维声驻波。
[0069]
所述声学装置可用于在流体/颗粒混合物中产生声体波。声体波在一定体积的流体中传播，并且不同于倾向于在换能器的表面上工作而不在一定体积的流体中传播的表面声波。
[0070]
声学换能器可以由压电材料构成。这种声学换能器可以被电激发以产生平面或多模式声波。由多模式声波产生的三维声力包括与声波传播方向不对齐的径向力或侧向力。侧向力可以在两个维度上起作用。侧向力是多模式声波中轴向力的补充，轴向力基本上与声波传播方向对齐。对于这种多模声波，侧向力可以与轴向力具有相同数量级。在多模操作中激发的声换能器可以在其表面上呈现驻波，从而产生多模声波。换能器表面的驻波可能与多模声波的工作模式有关。当声学换能器被电激发以产生平面声波时，换能器的表面可以表现出类似活塞的作用，从而产生一维声驻波。与平面声波相比，多模声波在相同输入功率的情况下连续表现出明显更大的颗粒捕获活性。一个或多个声学换能器可用于生成平面和/或多维声学驻波。在某些操作模式中，多模声波产生界面效应，可以阻止或保留一定大
小的颗粒，而较小的颗粒可以流过多模声波。在某些操作模式中，平面波可用于以某些角度偏转颗粒，这是颗粒大小的特征。
[0071]
本文讨论的是pfc珠、其制造方法和使用该珠进行细胞选择的方法。使用全氟己烷(pfh)珠的实施例介绍了使用生物素-中性抗生物素蛋白非共价相互作用实现的细胞靶向技术。液体全氟己烷(pfh)核心液滴被结合了中性抗生物素蛋白的生物素化脂质包裹。图3显示了全氟己烷核心液滴的示意图。
[0072]
基于声学的细胞分选在声学驻波场中进行，例如在lipkens等人的美国专利号9,822,333中由flodesign sonics,inc.开发的多维声学驻波技术。用于在液滴中合成核心的pfc液体具有独特的物理性质。pfc液体的显著特性包括：比水密度大、粘度低、表面张力低、吸氧能力高、相对于水的声速低、化学惰性高、生物相容性。表1显示了用于液滴制造的pfc液体的物理和声学性质。
[0073]
表1：在室温pfc的物理和声学性质
[0074]
化合物分子式(kg/m3)(m/s)b.p(℃)可压缩性pfob(全氟辛基溴)c8f
17
br192063014113.12
×
10
10
pfh(全氟己烷)c6f
14
16705485719.93
×
10
10
pfp(全氟戊烷)c5f
12
16004772927.46
×
10
10
细胞 10601600 3.68 10
10
[0075]
全氟碳(pfc)液体具有高可压缩性，因此其是设计声学响应颗粒的合适候选物。全氟碳(pfc)是化学惰性化合物，具有多种生物医学应用。其乳液被用作人工血液替代品(biro,blais,&rosen,1987；moore&clark jr,1978；yokoyama,yamanouchi,murashima,&tsuda,1981)、分子成像中的声学造影剂(lambert&jablonski,1997)和mri造影剂(d
í
az-l
ó
pez,tsapis,&fattal,2010)等。碳氟化合物的其它生物医学应用包括肺表面活性剂替代物(clark jr,1998；sekins,shaffer,&wolfson,1996)和眼科辅助物(vidne et al.,2018)。全氟碳也被用于促进为细胞供应呼吸气体(goh,gross,simpson,&sambanis,2010；ju&armiger,1992)，并且在某些系统中用于改良商业上重要的细胞产品的生物质生产和产量。动物(包括人类)和植物细胞也已在pfc液体和水性培养基之间的界面进行培养。pfc液体溶解呼吸气体的能力引起了临床医生和生物技术专家的极大兴趣。
[0076]
基于pfc的这些特性的一些商业产品是fluosol(fluosol-da,green cross corp.,osaka,japan及alpha therapeutic,los angeles,ca,usa)、oxypherol(fluosol-43,green cross corp.及alpha therapeutic)、perftoran(ftorosan,ojcs spf perftoran russian,moscow,russia)、oxygent(af0144,alliance pharmaceutical corporation,san diego,ca,usa)、oxyfluor(hemagen/pfc,st.louis,mo,usa)和oxycyte(oxygen biotherapeutics,inc.,formerly synthetic blood int.,costa mesa,ca,usa)。definity(lantheus medical imaging,n.billerica,ma)是美国食品和药物管理局(fda)批准的具有脂质封装和全氟丁烷气核心的超声造影剂。其在美国用于心血管成像。
[0077]
在一些实示例实施方式中，所述颗粒具有核-壳结构，其中液体核心被脂质壳包裹。例如，液体核心中的液体是全氟碳(pfc)。如本公开所使用的，术语“全氟碳”是指其中所有氢原子已被卤素取代且大部分卤素原子是氟原子的分子。出于本公开的目的，“卤素”是指氟、氯和溴。pfc的具体实例包括全氟戊烷(pfp)、全氟己烷(pfh)、全氟二氯辛烷(pfdco，
c8f16cl2)、全氟辛烷(pfo)、全氟辛基溴(pfob，c8f17br)或全氟萘烷(pfd，c10f18)。
[0078]
这些pfc液体具有独特的性质。pfc液体比水更致密，具有低表面张力和低粘度。pfc液体还具有很高的吸收氧气和氮气的能力。全氟碳液体具有低声速、高化学惰性且是生物相容的。下表2显示了可用于颗粒的各种pfc液体以及用于比较的其它聚合物的各种物理和声学性质。应注意的是，与生物细胞相比，pfc液体的可压缩性非常高。
[0079]
表2
[0080][0081]
可用于形成脂质壳的脂质的具体实例包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、1,2-棕榈酰-磷脂酸(dppa)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dspe)。这些脂质也可用于脂质-聚乙二醇缀合物，或脂质与白蛋白(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)的复合物。脂质壳可以用链霉抗生物素蛋白、生物素、脱硫生物素、抗生物素蛋白、抗体、适体、寡核苷酸和/或其它功能化部分进行官能化。脂质壳用于将颗粒附着于另一分子，并用于保护液体核心。
[0082]
这种结构在图3中说明。颗粒300由围绕液体核心304的脂质壳302制成，在该示例中是液体核心全氟己烷。壳可以由dppa、dppc、dspc、dspe-peg2000或功能化的脂质-乙二醇缀合物制成，此处标记为dspe-peg5000-生物素。还示例说明了中性抗生物素蛋白，这是一种与脂质壳的生物素结合的抗生物素蛋白衍生物306。
[0083]
本文介绍了许多制造或合成技术。根据一种示例实施方式，产生脂质混合物，并且根据应用所需的液滴/珠的大小，通过不同的方法将全氟己烷(pfh)液体分散在其中。脂质混合物可包括dspc、peg40硬脂酸酯、dspe-mpeg-2000、dspe-peg-2000-生物素、dspe-peg-5000-生物素、pbs缓冲液、丙二醇和甘油。将pfh和脂质溶液使用均质器混合以产生液滴。均化后获得的液滴是高多分散的。执行下游离心方案以获得所需的液滴大小。在制造液滴后，将其与所需量的中性抗生物素蛋白一起温育并进行两步洗涤以去除游离的中性抗生物素蛋白。
[0084]
在另一个示例实施方式中，磷脂被用作乳化剂/表面活性剂。此处使用的脂质配制物的亲水-亲油平衡值(hlb)为13.53。hlb值表明此处形成的乳液应该是水包油乳液。由于液滴将附着在细胞上，因此脂质配制物中包含生物素化脂质。在这个实例中，液滴与细胞的附着是通过非共价连接的中性抗生物素蛋白完成的。本文描述了其它方法和技术以制造不同大小范围的液滴。脂质的确切组成和细节在下面的表3和4中提供。产生所需的脂质混合物，并根据应用所需的液滴/珠的大小通过不同的方法分散pfc液体。为了产生小尺寸液滴，使用超声搅动。为了制造更大的液滴，使用均质器来搅动液体混合物。脂质溶液的制备是合成过程的重要组成部分。
[0085]
在一些实例中，将获得的脂质储存在-20℃的冰箱中。对于液滴的合成，将脂质从冰箱中取出并在室温放置20分钟。在室温解冻20分钟以使脂质从固态冷冻状态变为凝胶状态。建议在乳化过程中使脂质变为液态。脂质不溶于水，因此使用丙二醇来溶解脂质。建议不要一次将所有脂质溶解在丙二醇中。一次混合所有脂质可能会导致溶液中形成白色团块，这些团块可能难以溶解。使用脂质的溶解度顺序，例如将溶解度最小的脂质首先溶解在丙二醇中等等。需要注意的是，溶解度与溶液温度成函数。将溶液理想地保持在高于脂质转变温度的温度。在转变温度，脂质相从凝胶状态变为液态。将适量的丙二醇加热至脂质混合物所需或最高转变温度。例如，在本发明配制物中，dspc是溶解度最低的脂质，最高转变温度为60℃(在所用脂质中最高)。首先将溶解度较低或可能最低的脂质加入热丙二醇中，然后将烧杯置于超声浴中温和混合。相继将脂质加入在超声浴中的烧杯中。同时，制备甘油和缓冲液溶液的混合物并将其加热至所需或可能最高转变温度。一旦丙二醇-脂质溶液在超声仪中是半透明的(没有白色团块)，将其与甘油-缓冲液溶液混合。将所得溶液在带有温度控制水浴的磁性平台上混合。水浴的温度优选不超过所需或可能最高的脂质转变温度5℃。温度的升高不利地影响膜刚性。脂质溶液包含按体积计15％丙二醇、5％甘油和80％pbs缓冲液。根据主要脂质，可以增加丙二醇的量。例如，如果主要脂质是dppc，即使在10％丙二醇溶液中也可以实现脂质溶解。
[0086]
在所需温度下混合脂质溶液可以进行一小时或更长时间。之后，可以通过将脂质溶液从水浴中取出来将其置于室温。所述溶液可在4℃储存以备进一步使用。
[0087]
也可以使用均质器来混合脂质-丙二醇-甘油-缓冲液溶液混合物。均质器可以例如以3000rpm运行。均质优选进行1小时或更长时间，同时温度保持在所需的或可能最高的脂质转变温度之上。
[0088]
过滤制备的脂质溶液以去除灰尘颗粒、未溶解的脂质团块等。亲水性针头式过滤器用于这个程序。将过滤器在使用前浸泡在相同的温度浴中。依次使用2微米、0.8微米和0.45微米过滤器过滤脂质溶液。
[0089]
表3：液滴壳中的脂质
[0090][0091]
表4：给定体积的脂质溶液(ml)的单个脂质的质量(mg)
[0092]
[0093][0094]
开发了许多脂质包被/壳的配制物。在一些配制物中，将dspe-mpeg-2000用dspe-mpeg-5000替代，相应的生物素化脂质改为dspe-peg-5000-生物素。dspc也可以用dppc代替。还改变生物素化脂质的比例以检测其对与细胞结合的影响。在其中一种所述配制物中，将dspc的部分进行生物素化并且还导入间隔物以在生物素与细胞之间具有更好的结合。导入聚乙二醇化脂质以为液滴提供空间稳定性。还使用了乳液稳定剂/助表面活性剂如peg40硬脂酸酯。在此使用的所有脂质都是生物相容的，过去其已用于各种fda批准的基于脂质体的药物中。
[0095]
上述配制物(表3)基于生物素-中性抗生物素蛋白非共价缀合。开发了一些脂质配制物，其中中性抗生物素蛋白直接与液滴表面缀合。在此类配制物中，dspe-peg-2000-生物素由dspe-peg-2000-马来酰亚胺替代，均质化后制造的液滴具有马来酰亚胺用于进一步缀合。含有马来酰亚胺的液滴与硫醇化的中性抗生物素蛋白缀合，在表面上与中性抗生物素蛋白形成稳定的硫醚键。尽管可以不是优选的，但马来酰亚胺和硫醇化的中性抗生物素蛋白之间的反应也可以在脂质制备阶段进行。使用这种方法，用于液滴制备的高剪切力可以使中性抗生物素蛋白变性。应保持ph～7以避免脂质马来酰亚胺的水解。缀合应在氮气或氩气气氛中进行。
[0096]
在另一个实例中，在脂质配制物中，dspe-peg-2000-生物素替代为dspe-peg-2000-脱硫生物素。这种修饰使液滴可以在阳性选择过程结束时洗脱。
[0097]
在另一个实例中，在液滴制造中，中性抗生物素蛋白用链霉抗生物素蛋白替代。从孔板实验中观察到，当脱硫生物素液滴与链霉抗生物素蛋白非共价连接时，其更快洗脱。这种修饰可以显著减少洗脱时间并可以提高洗脱效率。
[0098]
在另一个实例中，阳离子脂质如dotap、dotma可以包括在脂质配制物中，以将其非共价连接至生物素化的ss-dna或ds-dna，使液滴具有dna或rna修饰。液滴中的dna修饰可用于通过使用链置换剂或benzonase进行洗脱。
[0099]
在另一个实例中，dspe-peg-2000-生物素可以用dspe-peg-2000-马来酰亚胺替代，马来酰亚胺脂质可以与硫醇化的dna链缀合。这可以导致脂质具有共价dna修饰。随后可以通过优选的混合方法制备液滴。
[0100]
在另一个实例中，阳离子脂质如dotap、dotma可以包括在脂质配制物中，这可以允许pfh液滴用于需要将dna转染到细胞膜的应用中。
[0101]
在另一个实例中，可以通过具有不同全氟碳(pfc)的混合物修饰液滴的核心。混合较高分子量的pfc可延长pfc乳液的保质期(davis&wotton,1989)。例如，可以将全氟己烷
(pfh)与全氟萘烷(pfd)以90:10的比例混合，该混合物可以用作液滴核心。
[0102]
在另一个实例中，乳液稳定剂如peg40硬脂酸酯可以大量使用以增加最终液滴溶液的粘度。溶液的高粘度降低了溶液中液滴的运动，进而降低了聚结速率。这种修饰可能对pfh液滴的保质期产生显著的积极作用。
[0103]
小尺寸液滴的制备
[0104]
在一些实例中，pfh、pfob和pfd用于制造液滴。此处介绍了由pfh制成的液滴的详细结果。在狭窄容器中将脂质溶液与pfh液体混合。密度较大的pfh液体倾向于下降到容器底部，而脂质溶液倾向于上升到顶部。脂质溶液和pfh液体都是透明的，但可以看到鲜明的界面。为了制造小尺寸液滴，容器中的pfh液体的量优选是有限的，例如最小。例如，随着pfh体积与脂质溶液体积之比增加，液滴的大小增加，直到达到给定超声功率的平台。pfh液体强度低，因为它具有低表面张力值。因此，适当地选择超声幅度以克服表面张力值。可以以脉冲模式提供超声波的输入。在一些实例中，可以避免超声波的连续模式。喇叭的尖端可以置于pfh和脂质溶液的界面处。尖端在界面处的放置会影响液滴大小分布的一致性，并且在某些实例中对液滴大小分布的一致性是至关重要的。如果使用不同尺寸容器进行超声处理，所述大小分布可能变化。为避免形成气泡/泡沫，将喇叭充分放置在溶液内。在这个实例中，目的是制备液滴溶液而不是气泡溶液，因此将窄容器浸没在透明的低温浴中。所述透明低温浴是通过制备过饱和的盐溶液，然后将盐溶液储存在-20℃的冰箱中制成的。这些实验中使用的喇叭超声仪的尖端直径为0.5英寸。
[0105]
小液滴方案
[0106]
1.对脂质-pfh溶液进行超声处理，
[0107]
a.喇叭超声仪：0.5英寸探头和750瓦最大功率；
[0108]
2.在透明小容器中，倒入2ml全氟己烷；
[0109]
3.将4ml脂质溶液倒入相同透明小容器中(使用前轻轻摇动脂质溶液原液)；
[0110]
4.将超声仪的尖端放在全氟己烷和脂质溶液的界面处；
[0111]
5.使用透明低温浴冷却样品架；
[0112]
6.超声处理参数(pfh)：13％振幅，2秒开:8秒关，总处理时间10秒；
[0113]
7.离心(使用含2％bsa的缓冲溶液)。
[0114]
大液滴方案
[0115]
1.在15ml离心管中，混合4ml pfh和6ml脂质溶液；
[0116]
2.轻轻混合后，将溶液倒入30ml烧杯中；
[0117]
3.使用均质器(ika t25 ultra turrax)以10,000rpm均质45秒；
[0118]
4.离心(使用含2％bsa的缓冲溶液)。
[0119]
使用beckman coulter multisizer进行液滴大小测量。对于小液滴，使用20微米的孔径，而对于较大的液滴，使用50微米的孔径。小液滴的大小分布具有240亿/ml的颗粒浓度，直径大于约0.9μm，体积百分比约为50％。大液滴的大小分布具有12.2亿/ml的颗粒浓度，直径大于约2μm，体积百分比约为50％。
[0120]
在上述实例中，将pfc液体和脂质溶液组合以制成具有脂质壳的液体核心。将pfc液体分散在另一溶液中形成液滴。可以将乳化剂加入溶液中，以防止液滴聚结。在一些实施方案中，磷脂用作乳化剂/表面活性剂。根据应用所需的液滴大小，通过不同的方法分散pfc
液体。为产生纳米级小液滴，可以使用超声搅动。为产生更大的液滴，可以使用小瓶摇动器来搅动液体混合物。
[0121]
在一些实施方案中，脂质溶液由在溶液中的几种不同脂质材料组成。将获得的脂质储存在约-20℃的冰箱中。在此温度，脂质处于固态。在使用前，可以将脂质从冰箱中取出并在室温放置约20分钟。这样做是为了使脂质达到凝胶状态。由于脂质通常不溶于水，因此可以使用丙二醇将其溶解。优选不要一次将所有脂质溶解在丙二醇中，因为同时放入所有脂质可能会导致溶液中形成白色团块。比较每种脂质材料的溶解度，溶解度最大的脂质材料首先溶解在丙二醇中，其次是溶解度次最高的脂质材料等等。由于脂质的溶解度与溶液温度成函数，所以将溶液保持在高于脂质转变温度的温度。表5是脂质组合物的一个实例。
[0122]
表5
[0123][0124]
用于产生脂质溶液的示例过程如下。将丙二醇被加热至混合脂质混合物的最高转变温度。将具有最大溶解度的脂质材料加入加热的丙二醇中。将所述脂质材料和丙二醇在超声浴中混合。随后，将溶解度较低的脂质加入在超声波浴中的丙二醇混合物中。
[0125]
可以同时制备甘油和缓冲溶液的混合物。将甘油和缓冲溶液加热至最高转变温度。一旦脂质-丙二醇溶液在超声仪中是半透明的(没有白色团块)，则将脂质-乙二醇溶液与甘油-缓冲溶液混合。使用以3000rpm运行的均质器将所得混合物均质化。均质化进行约一小时。在均质化期间，温度保持在脂质的最高转变温度。
[0126]
过滤制备的脂质溶液以去除任何可能的污染物，例如灰尘、未溶解的脂质团块等。过滤程序可以用亲水针头式过滤器进行。将过滤器在使用前浸泡在相同温度的批次中。在一些实施方案中，使用2.0微米过滤器。在其它实施方案中，使用0.8微米过滤器。在又一些
实施方案中，使用0.45微米过滤器。在一些实施方案中，可以使用过滤器的组合。
[0127]
将脂质溶液与pfc液体在狭窄容器中混合以产生核心-壳颗粒。将pfc液体放入容器中并将脂质溶液倒在上面。为制造更小尺寸的液滴，减少容器中pfc液体量。随着pfc液体体积与脂质溶液体积之比增加，形成的液滴的大小会增加，直到达到给定超声功率的平台。pfc液体强度低，因为其具有低表面张力值。因此，应该适当地选择超声幅度并且应以脉冲模式而不是连续模式进行超声波的输入。喇叭超声仪组件的尖端应放置在两种液体溶液的界面处。为避免形成气泡/泡沫，喇叭应充分位于溶液内。在此，目的是制备液滴溶液，因此将狭窄容器浸没在透明的低温浴中。例如，通过制备过饱和盐溶液，然后将盐溶液储存在-20℃的冰箱中来制备透明低温浴。超声产生更小的珠。
[0128]
在一个实例中，脂质溶液可包含约1ml丙二醇 1ml甘油 8ml缓冲溶液 10mg脂质混合物。可将9ml脂质溶液与约1ml的pfc溶液混合。可以对脂质-pfc溶液进行超声处理。对于0.5英寸探头和750w超声仪，对使用30％pfp的pfc溶液进行超声处理约3秒开启和约10秒关闭，直到达到约15秒的总超声处理时间。对使用40％pfh的pfc溶液进行超声处理约3秒开启和约10秒关闭，直到达到约15秒的总超声处理时间。对使用50％pfob的pfc溶液进行超声处理约3秒开启和约10秒关闭，直至达到约15秒的总超声处理时间。超声处理产生液滴溶液。
[0129]
为制备更大尺寸的液滴，增加pfc液体量并急剧降低超声仪的功率输入。在另一个非限制性示例性实施方案中，可以将500μl的pfc和2ml脂质溶液置于3ml小瓶中。然后可以将小瓶在小瓶混合器中以4800rpm摇动30秒。制备的液滴悬浮液可能有一些微泡。在存在微泡的情况下，可以将溶液离心。
实施例
[0130]
实施例1：用于阴性选择的全氟己烷液滴
[0131]
小液滴制造方案(超声处理)：将脂质-pfh溶液使用喇叭超声仪(0.5英寸探头，最大功率750瓦)进行超声处理。在透明小容器中，倒入2ml全氟己烷和4ml脂质溶液。超声仪的尖端放置在全氟己烷和脂质溶液的界面处。透明低温浴用于冷却样品架。使用13％的超声振幅并以脉冲模式操作。使用2秒开启和8秒关闭的脉冲波进行5次以获得10秒的有效超声处理时间。超声处理产生高多分散群，因此进行多次离心洗涤以去除非常小的液滴。在离心期间使用2％bsa-dpbs缓冲液进行洗涤和稀释。图4显示了在离心步骤后的最终大小分布。使用beckmann计数器(multisizer)进行样品大小测量。
[0132]
大液滴方案(均质化)：将4ml pfh和6ml脂质溶液倒入30ml烧杯中并进行均质化。ika t25 ultra turrax均质器以10,000rpm使用45秒。均质化后，进行多次离心洗涤以达到所需大小。图5显示了在离心步骤后的最终大小分布。
[0133]
实施例2：用于阳性选择的全氟己烷液滴
[0134]
目的：从leukopak中分离cd4 和cd8 t细胞
[0135]
液滴制造：使用均质器大量制备pfh液滴。所述工艺被修改为以工业规模生产液滴。将480ml脂质溶液与320ml全氟己烷液体在烧杯中以25000rpm混合4分钟。将烧杯用冰冷的水夹套。均质化导致非常多分散群，进行了多个离心步骤以获得所需群。目的是获得直径在5至8微米之间的平均大小。
[0136]
离心：目的是去除非常小的液滴，因为它们可能无法以所需的声功率保持在柱中。
使用500ml的大离心杯进行离心。这项研究中使用的所有速度是针对rmin＝100mm和rmax＝205mm的离心机计算的。以下是每个离心步骤的详细信息。
[0137]
c1：将300ml缓冲液装入离心杯中，然后将200ml初始液滴溶液轻轻倒入离心杯中。以500rpm离心3分钟。
[0138]
c2：去除上一步的上清液，将沉淀收集在烧杯中。清洁离心杯并再次填充300ml缓冲液并将沉淀(重新配制为200ml)轻轻倒入其中。以500rpm离心3分钟。
[0139]
c3：去除上一步的上清液，将沉淀收集在烧杯中。清洁离心杯并再次填充300ml缓冲液并将沉淀(重新配制为200ml)轻轻倒入其中。以450rpm离心3分钟。
[0140]
c4：去除上一步的上清液，将沉淀收集在烧杯中。清洁离心杯并再次填充具有2％bsa的300ml缓冲液并将沉淀(重新配制为200ml)轻轻倒入其中。以450rpm离心2分钟。
[0141]
c5：在4个离心步骤后收集沉淀。将液滴溶液与足量的中性抗生物素蛋白在4℃温育1小时。中性抗生物素蛋白的量取决于在4个离心步骤后液滴溶液的平均大小和浓度。
[0142]
c6：将温育的中性抗生物素蛋白液滴溶液倒入装有2％bsa溶液的500ml离心杯中以洗涤未结合的中性抗生物素蛋白。以450rpm离心3分钟(bsa溶液300ml 温育的液滴溶液200ml)。
[0143]
c7：去除上一步的上清液并重新配制为200ml，倒入已装有2％bsa溶液(300ml)的离心杯中。以450rpm离心2分钟。
[0144]
c8：从离心杯中去除上清液并将液滴样品收集在小瓶中用于大小分布测量。
[0145]
作为另一个实例，颗粒的外层可用于引起颗粒的生物相互作用/反应。例如，外层可以允许颗粒用于亲和性结合。
[0146]
针对给定大小和浓度计算中性抗生物素蛋白的量：将pfc液滴与中性抗生物素蛋白缀合，使其准备好与用生物素化抗体生物功能化的细胞结合。一旦液滴被合成并离心以获得所需大小的群，将其与足量的中性抗生物素蛋白溶液混合。中性抗生物素蛋白的量取决于壳中生物素化脂质、dspe-peg-2000-生物素或dspe-peg-2000-脱硫生物素的量。中性抗生物素蛋白应过量添加，使其覆盖液滴上的所有生物素位点。如果液滴溶液没有用中性抗生物素蛋白饱和，那么它可能会导致液滴之间的交联。在此我们介绍了针对给定液滴大小和浓度计算中性抗生物素蛋白。
[0147]
所述计算假设所有生物素都可用于结合并且没有液滴交联。计算中性抗生物素蛋白时考虑了液滴群的平均大小。根据每种类型脂质分子的摩尔比和表面积，可以针对给定大小的液滴计算可用生物素位点的数量。根据生物素位点的数量，可以计算给定液滴群的中性抗生物素蛋白的总质量。表6显示了所有脂质的单分子拓扑平面面积。表7和表8分别显示了针对1ml小液滴和大液滴的中性抗生物素蛋白计算。将液滴与中性抗生物素蛋白溶液在4℃温育30分钟。温育后，应将液滴-中性抗生物素蛋白溶液洗涤两次以去除任何未结合的中性抗生物素蛋白。溶液中任何未结合的中性抗生物素蛋白都会在温育期间阻断(用生物素化抗体生物功能化的)细胞上的结合位点。
[0148]
表6：单个脂质分子的拓扑平面面积
[0149]
[0150][0151]
表7：实施例：用于1ml小液滴的中性抗生物素蛋白
[0152][0153]
表8:实施例:用于1ml大液滴的中性抗生物素蛋白
[0154][0155]
实施例3：用于阳性选择和适合洗脱的全氟己烷液滴
[0156]
目的：从leukopak中分离cd4 和cd8 t细胞并从细胞中洗脱液滴。
[0157]
液滴制造：pfh液滴使用生物素中性抗生物素蛋白键靶向细胞。由于目的不仅是分离细胞，而且最终洗脱液滴，因此在脂质制备中使用了修饰形式的生物素。将实施例2中的dspe-peg 2000-生物素替换为dspe-peg-2000-脱硫生物素以实现洗脱。与常规生物素分子中两个环相比，脱硫生物素分子只有一个环，并且与常规生物素液滴相比，脱硫生物素对中性抗生物素蛋白的亲和性较低(hirsch et al.,2002)。在用脱硫生物素脂质制造液滴后，将液滴与中性抗生物素蛋白温育。为实现洗脱，将脱硫生物素液滴细胞复合物在50mm生物素缓冲溶液中在37℃温育2小时。由于缓冲液中存在的游离生物素对中性抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白具有更高的亲和性，它取代了与中性抗生物素蛋白非共价连接的脱硫生物素液滴。微滴制造中的其它步骤如实施例2中提供的那样进行。脱硫生物素液滴的大小分布类似于实施例2中制造的常规生物素液滴。
[0158]
通过流式细胞术测量液滴的生物素结合能力
[0159]
将用于声亲和性细胞选择(aacs)的液滴用中性抗生物素蛋白包被，中性抗生物素蛋白是链霉抗生物素蛋白的去糖基化形式。中性抗生物素蛋白对生物素具有非常高的亲和
力(kd＝10-15)。计算液滴上中性抗生物素蛋白可结合的每单位表面积的生物素量(生物素结合能力)，以改善aacs柱中的成功结合。将荧光生物素(生物素-apc缀合物)标记具有中性抗生物素蛋白的液滴。校准荧光并使用流式细胞术测量生物素结合。图6显示了常规生物素液滴的生物素结合能力。图7显示了脱硫生物素液滴的结合能力。两种类型的液滴具有相似的生物素结合能力。生物素结合能力在6-12pmol生物素/cm2液滴表面之间因批次而异。图6和图7在y轴示出计数和在x轴示出平均荧光强度。与常规生物素液滴中的单个图相比，脱硫生物素液滴结合能力图有两个峰。脱硫生物素液滴图中的第二个峰可能归因于使用了用于测量的生物素-apc。生物素apc可能已将脱硫生物素液滴从中性抗生物素蛋白中置换出来，第二个峰可能是来自此类簇的信号。
[0160]
在细胞选择实例中，液滴用于进行细胞分离测试。对于这个测试，可以用脱硫生物素制造液滴。将细胞(靶细胞和非靶细胞)与抗cd4生物素和抗cd8生物素抗体温育并将液滴加载到声分离柱中。一旦柱加载了液滴，则1％bsa-pbs缓冲液冲洗该柱并开启声学。几分钟后，在产生的声场边缘下方形成了一个液滴悬浮区。在形成稳定边缘后，将细胞悬浮液加载到柱中，随后带有抗体的细胞附着在液滴上。冲洗缓冲液流继续，它会冲洗去掉游离的未结合的细胞。在游离细胞离开柱的时间间隔后，可以实施洗脱过程。洗脱过程可以包括为柱提供生物素洗脱缓冲液以从细胞中洗脱脱硫生物素液滴。可以再循环流动，在此期间柱的温度可以升高到37℃。较高的温度和剪切力可以加速洗脱。在洗脱阶段，声学关闭。再循环1小时后，打开声学并使用冲洗缓冲液将洗脱的细胞与液滴分开。由于所述细胞与pfh液滴的声学响应不一样，因此它们不会被声学保留在柱中，而pfh液滴则保留在声学边缘下方。这一整体过程产生了高洗脱效率。
[0161]
在其它实例中，使用全氟己烷(pfh)液滴进行细胞的阳性和阴性选择并实现了靶细胞的高纯度和高回收率。为了比较，进行了tcr细胞的阴性选择并使用了pfh液滴和promega珠。pfh液滴的纯度和回收率明显高于promega珠。全氟碳和磷脂均是生物相容的，过去它们已用于各种药物中。全氟己烷液滴不仅利于细胞分离，而且可以对其进行修饰以实现洗脱。存在于液滴上的生物素可被修饰为脱硫生物素，含有游离生物素分子的洗脱缓冲液可用于从细胞复合物中洗脱pfh液滴。
[0162]
pfh液滴产生靶细胞的更高纯度和回收率。pfh和磷脂均是生物相容的。它们在用于fda批准的药物方面有着良好的记录。
[0163]
商用平台受限于其规模和处理复杂输入如leukopak的能力，其中大多数旨在使用pbmc作为输入。pfh液滴有助于分离细胞的连续过程。为放大该过程，可以相应地改变柱的体积、声学输入、流速和pfh液滴数量。我们已经证明可以在不同声学柱体积和腔室中处理数百万个细胞到数十亿个细胞。
[0164]
使用pfh液滴的细胞分离时间总共不到4小时，明显低于最接近的竞争者所用的时间。由于柱的设计限制，市售的miltenyi产品无法在单个柱中以更高的流速运行。它们受到球体之间通道宽度的限制(淋巴细胞大小的约20倍)。高强度磁场存在于球体边界附近，并且在大部分通道中量级低。增加宽度可能会损害附着在磁珠上的细胞的捕获。pfh液滴则不受任何此类操作流速限制。
[0165]
由于miltenyi珠的大小为100至200nm，因此它们在此过程期间可能会内化到细胞中。此处使用的pfh珠的平均大小在5至7μm，因此内化的机会很小。
[0166]
氟化液滴与中性抗生物素蛋白结合，使其准备好与由生物素化抗体生物功能化的细胞结合。一旦液滴被合成并离心以获得所需大小的群，将其与所需数量的中性抗生物素蛋白溶液混合。中性抗生物素蛋白的量取决于壳中生物素化脂质dspe-peg-2000-生物素的数量。可以过量加入中性抗生物素蛋白，使其覆盖液滴上的所有生物素位点。如果液滴溶液没有被中性抗生物素蛋白饱和，那么它可能会导致液滴之间的交联。在这里，我们介绍了给定液滴大小和浓度的中性抗生物素蛋白的计算。
[0167]
将leukopak与适量的抗体温育30分钟，然后加样于声学亲和柱上。在柱中发生细胞-抗体与液滴之间的结合。非靶细胞通过声室，因为其不是声学响应性的，而靶细胞-液滴复合物被保留在柱中。用缓冲液冲洗柱子以从柱中去除非靶细胞。在一定时间后(取决于细胞数量、柱体积)，停止冲洗过程，并根据靶向机制的种类使用相应的洗脱技术开始从液滴中洗脱靶细胞。靶向机制可以基于抗体、适体或抗体-寡核苷酸缀合物。使用等式1和2计算靶细胞的纯度和回收率。需要注意的是，下一节中介绍的纯度和回收率是基于细胞计数的守恒，而不是基于洗脱。
[0168][0169][0170]
计数方法：血液分析仪计数乘以流式细胞术百分比。
[0171]
样品细胞类型抗体类型细胞浓度流速ml/min液滴浓度c单采血pdtcd4&cd81x115％b单采血pdtcd4&cd81x115％a单采血pdtcd4&cd81x115％d单采血pdtcd4&cd81x115％e单采血pdtcd4&cd81x115％
[0172]
样品功率柱类型温度洗涤总靶细胞数c0.5w5mlrtp是300mb0.5w5mlrtp是600ma0.5w5mlrtp是1200md0.5w5mlrtp是1800me0.5w5mlrtp是2400m
[0173]
抗体：cd4抗体每百万个靶细胞1kd量，cd8抗体每百万个靶细胞1kd量。
[0174]
保留测量中的不确定性百分比
[0175][0176][0177]
靶纯度测量中的不确定性百分比
[0178]
柱靶输入％不确定性c300m0.84b600m0.99a1200m0.92d1800m1.92e2400m1.76
[0179]
结果：细胞分离在声学亲和流化床柱中进行。下面报告的结果是从不同的三天实验中收集的，每天在相同条件下测试三种不同类型的颗粒。测试的颗粒是小液滴、大液滴和promega珠。每天将液滴以大约20％固体的浓度加样于5ml柱。在实验期间将柱冷却，该实验由100m总细胞的单次通过和初始10ml样品和30ml冲洗缓冲液组成。所有柱的流速均为1ml/min，对于含有小液滴的柱的功率为1w，对于含有大液滴或promega珠的柱的功率为0.6w。
[0180]
对于每个实验，使用以下公式计算tcr细胞的纯度和回收率：
[0181][0182][0183]
也可以使用各种颗粒进行细胞的阳性和阴性选择。例如，tcr阳性t细胞的阴性选择是这样的过程，其中功能化颗粒与tcr阳性t细胞结合，从而将tcr阳性t细胞从系统中去除。tcr阳性t细胞不利于嵌合抗原受体t细胞疗法(car-t)等方法。
[0184]
阳性选择过程也可用于特定细胞，其中通过适当功能化的颗粒选择修饰的t细胞，从而将其从细胞培养物中选出，然后用于随后的细胞疗法。
[0185]
下面报告的结果是从不同的三天实验中收集的，每天在相同操作条件下测试三种不同类型的颗粒。测试的颗粒是小液滴、大液滴和promega珠。每天将液滴以约20％体积的浓度加样于5ml柱。将柱在实验期间冷却，所述柱由单次通过初始100m总细胞的10ml样品及30ml冲洗缓冲液组成。所有柱的流速均为1ml/min，对于包含小液滴的柱的功率为1w，对于包含大液滴或promega珠的柱的功率为0.6w。三天之间的一个小区别是第三天使用了较小直径的管道。这个改变显著降低了系统的持液量并由于样品稀释程度较低而允许在第三天分析初始流出样品。然而，出于本报告的目的，流出样本将不会用于分析，因此分析在所有日期之间是一致的。
[0186]
对于每个实验，计算三个指标并将其用于颗粒类型比较。总纯度、tcr-细胞回收率和tcr 细胞耗竭效率均使用以下公式计算：
[0187]
总纯度：
[0188]
tcr-细胞回收率：
[0189]
tcr 细胞耗竭效率：
[0190]
测试1
[0191]
表9a：测试1结果
[0192]
测试纯度回收率耗竭效率小液滴98.4％46.9％94.2％大液滴95.7％55.6％87.8％promega珠90.4％30.1％70.5％
[0193]
表9b：测试1结果
[0194][0195]
测试2
[0196]
表10a：测试2结果
[0197]
测试纯度回收率耗竭效率小液滴98.2％21.5％93.0％大液滴97.0％20.6％88.9％promega珠83.5％13.6％49.5％
[0198]
表10b：测试2结果
[0199][0200][0201]
测试3
[0202]
表11a：测试3结果
[0203]
测试纯度回收率耗竭效率小液滴99.4％31.2％98.5％大液滴96.9％79.6％92.0％promega珠86.5％44.4％59.9％
[0204]
表11b：测试3结果
[0205][0206]
结合和洗脱实例(中性抗生物素蛋白与脱硫生物素液滴)：将leukopak与适量的抗体温育，30分钟后加样于声学亲和柱。在柱中发生细胞-抗体与液滴之间的结合。非靶细胞通过声室，因为其不是声学响应性的，而靶细胞-液滴复合物被保留在柱中。将柱用缓冲液冲洗以从柱中去除非靶细胞。一段时间后(取决于细胞数量)，停止冲洗，通过在柱中流动50mm生物素缓冲液开始从液滴中洗脱靶细胞。生物素缓冲液以更高的流速再循环以产生高剪切力。在高剪切力下，脱硫生物素中性抗生物素蛋白相互作用显著降低，这可以减少总洗脱时间并可以提高洗脱效率。在生物素缓冲液再循环1小时后，降低流速，在声学边界处形成边缘。边缘形成有利于冲洗出洗脱的cd4和cd8 t细胞，而裸露的液滴则被阻挡。在具有大
小为1
×
1英寸的声室的50ml柱中进行结合。液滴与细胞抗体复合物的结合在室温进行，流速为12.5ml/min。该柱加样有按体积计15％的液滴。使用35ml leukopak，其产生24亿个t细胞。对于这个流速，功率保持在14w，以避免将不需要的细胞捕获在声室中。洗脱机制基于脱硫生物素液滴。如果考虑洗脱，纯度和回收率的公式会变化。
[0207]
结合和洗脱实例(链霉抗生物素蛋白与脱硫生物素液滴)：将leukopak与适量的抗体温育，30分钟后加样于声学亲和柱。在柱中发生细胞抗体与液滴之间的结合。非靶细胞通过声室，因为其不是声学响应性的，而靶细胞-液滴复合物被保留在柱中。将柱用缓冲液冲洗以从柱中去除非靶细胞。一定时间后(取决于细胞数量)，停止冲洗，通过在柱中流动100mm生物素缓冲液开始从液滴中洗脱靶细胞。使用振荡流再循环生物素缓冲液。振荡流增强混合并可以增加生物素向洗脱位点的扩散，从而降低洗脱时间和洗脱效率。在生物素缓冲液再循环1小时后，降低流速，在声学边界处形成边缘。边缘形成有利于冲洗出洗脱的cd4和cd8 t细胞，而裸露的液滴则被阻挡。在具有大小为1.5
×
1.5英寸的声室的50ml柱中进行结合。液滴与细胞抗体复合物的结合在室温进行，流速为20ml/min。该柱加样有按体积计15％的液滴。使用了35ml leukopak，其产生44.5亿个t细胞。对于这个流速，功率保持在20w，以避免将不需要的细胞捕获在声室中。洗脱机制基于脱硫生物素液滴。如果考虑洗脱，纯度和回收率的公式会变化。
[0208]
在这个实施例中，回收率＝洗脱产物中的cd4/进料的cd4。纯度＝(cd4 cd8)/cd45。效率＝洗脱中的cd4 cd8/柱中的cd4 cd8。回收率＝洗脱中的cd4 cd8/进料的cd4 cd8。阳性选择中cd4和cd8 t细胞的纯度和回收率基于数量守恒和洗脱。通过优化温度、温育时间和游离生物素缓冲液浓度可以提高洗脱效率。
[0209]
上文讨论的方法、系统和装置是示例。各种配置可以酌情省略、替换或添加各种程序或组件。例如，在备选配置中，可以以不同于所描述的顺序执行所述方法，并且可以添加、省略或组合各种步骤。此外，关于某些配置所描述的特征可以组合在各种其它配置中。所述配置的不同方面和元素可以以类似方式组合。此外，技术不断发展，因此许多元素只是示例，并不限制本公开或权利要求书的范围。
[0210]
在描述中给出了具体细节以提供对示例配置(包括实施方式)的透彻理解。然而，可以在没有这些具体细节的情况下实施配置。例如，熟知的过程、结构和技术已在没有不必要的细节的情况下显示，以避免混淆所述配置。这个描述仅提供示例配置，并且不限制权利要求书的范围、适用性或配置。相反，关于所述配置的先前描述提供了用于实现所述技术的描述。在不脱离本公开的精神或范围的情况下，可以对元素的功能和布置进行各种改变。
[0211]
此外，配置可以被描述为以流程图或框图描述的过程。尽管每个均将操作描述为顺序过程，但许多操作可以并行或同时执行。此外，可以重新排列操作的顺序。一个过程可能具有图中未包括的其它阶段或功能。
[0212]
已经描述了若干示例配置，在不背离本公开的精神的情况下，可以使用各种修改、替代构造和等价物。例如，上述元素可以是更大系统的组件，其中其它结构或过程可以优先于或以其它方式修改本发明的应用。此外，可以在考虑上述元素之前、期间或之后进行许多操作。因此，以上描述不限制权利要求书的范围。