离体GAMMADELTAT细胞群的制作方法

离体gammadeltat细胞群
技术领域
1.本发明涉及与抗tcrdelta可变1(抗vδ1)抗体接触的γδt细胞群。


背景技术：

2.对癌症t细胞免疫治疗日益增长的兴趣集中在cd8 和cd4 alphabeta(αβ)t细胞亚组识别癌细胞和介导宿主保护功能潜力的明显能力上，特别是当通过临床介导的拮抗由pd-1、ctla-4和其他受体施加的抑制通路而解除抑制时。然而，αβt细胞是mhc限制性的，可导致移植物抗宿主病。
3.gammadeltat细胞(γδt细胞)代表t细胞的一个亚组，在其表面表达独特的、限定的γδt细胞受体(tcr)。该tcr由一条gamma(γ)和一条delta(δ)链组成，每条链都经历链重排，但与αβt细胞相比，具有有限的v基因数量。编码vγ的主要tgrv基因片段是trgv2、trgv3、trgv4、trgv5、trgv8、trgv9和trgv11以及非功能基因trgv10、trgv11、trgva和trgvb。最常见的trdv基因片段编码vδ1、vδ2和vδ3，以及几个同时具有vδ和vα命名的v片段(adams等人,296:30-40(2015)cellimmunol.)。人γδt细胞可以根据其tcr链大体分类，因为某些γ和δ类型在一种或多种组织类型中的细胞上更普遍存在，尽管不是专有的。例如，大多数血液驻留的γδt细胞表达vδ2tcr，通常是vγ9vδ2，而这在组织驻留的γδt细胞中并不太常见，例如在皮肤中的那些细胞，其更经常地使用vδ1tcr与gamma链配对，例如在肠道中通常与vγ4配对。
4.为了利用γδt细胞进行免疫治疗，需要原位扩增细胞、或者收获细胞并在离体扩增细胞然后重新输注的方法。之前已经描述了后一种方法，使用添加外源细胞因子，例如参见wo2017/072367和wo2018/212808。已经描述了扩增患者自身的γδt细胞的方法，使用药理学修饰形式的羟甲基丁-2-烯基焦磷酸盐(hmbpp)或临床批准的氨基双膦酸盐。通过这些方法，在250名癌症患者上进行了治疗，看起来是安全的，但完全缓解的情况很少见。然而，仍然需要已证明能够扩增大量γδt细胞的活化剂。
5.发明概述
6.根据本发明的第一方面，提供了一种调节vδ1t细胞的离体方法，所述方法包括向包含vδ1t细胞的细胞群施用与γδt细胞受体(tcr)的可变delta1(vδ1)链的表位结合的人抗tcrdelta可变1(抗vδ1)抗体或其片段，所述表位包含以下氨基酸区域内的一个或多个氨基酸残基：
7.(i)seqidno：1的3-20；和/或
8.(ii)seqidno：1的37-77。
9.根据本发明的另一方面，提供了一种离体调节vδ1t细胞的方法，所述方法包括向包含vδ1t细胞的细胞群施用抗vδ1抗体或其片段，其包含以下一项或多项：
10.cdr3，其包含与seqidno：2-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列；
11.cdr2，其包含与seqidno：26-37和sequences:a1-a12(表2)中任一者具有至少80％序列同一性的序列；和/或
12.cdr1，其包含与seq id no：38-61中任一者具有至少80％序列同一性的序列。
13.根据本发明的另一方面，提供了通过如本文限定的离体方法获得的vδ1t细胞群。
14.根据本发明的另一方面，提供了包含如本文限定的vδ1t细胞群的组合物。
15.根据本发明的另一方面，提供了包含如本文限定的vδ1t细胞群的药物组合物。
16.根据本发明的另一方面，提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文限定的vδ1t细胞群或药物组合物。
附图说明
17.图1：使用抗vδ1ab(rea173，miltenyi biotec)对直接包被的抗原进行elisa检测。检测仅见于那些含有vδ1结构域的抗原中。亮氨酸拉链(lz)格式似乎比fc格式更有效，这与基于细胞的流式竞争测定法一致(数据未显示)。
18.图2：用于dv1选择的多克隆噬菌体delfia数据。a)异二聚体选择：在第1轮和第2 轮中的异二聚体lz tcr格式，在两轮中均取消选择异二聚体lz tcr。b)同二聚体选择：使用同二聚体fc融合tcr进行第1轮，其中取消选择人igg1 fc，然后对异二聚体lz tcr 进行第2轮，其中取消选择异二聚体lz tcr。每副图针对每个靶标均包含两个条形，以表示来自不同库的选择。
19.图3：igg捕获：左)抗l1 igg与l1相互作用的传感图，右)稳态拟合(如果有)。所有实验均在室温下在mass-2仪器上进行。根据langmuir 1:1结合进行稳态拟合。
20.图4：克隆1245_p01_e07、1252_p01_c08、1245_p02_g04、1245_p01_b07和 1251_p02_c05(a)，或克隆1139_p01_e04、1245_p02_f07、1245_p01_g06、1245_p01_g09、 1138_p01_b09、1251_p02_g10和1252_p01_c08(b)的tcr下调测定法的结果。
21.图5：克隆1245_p01_e07、1252_p01_c08、1245_p02_g04、1245_p01_b07和 1251_p02_c05(a)，或克隆1139_p01_e04、1245_p02_f07、1245_p01_g06、1245_p01_g09、 1138_p01_b09和1251_p02_g10(b)的t细胞脱粒测定的结果。
22.图6：克隆1245_p01_e07、1252_p01_c08、1245_p02_g04、1245_p01_b07和 1251_p02_c05(a)，或克隆1139_p01_e04、1245_p02_f07、1245_p01_g06、1245_p01_g09、 1138_p01_b09和1251_p02_g10(b)的杀伤测定法(基于thp-1流式的测定法)的结果。
23.图7：1245_p01_e07的表位作图数据。seq id no:1上1245_p01_e07的表位结合位点的图示。
24.图8：1252_p01_c08的表位作图数据。seq id no:1上1245_p01_c08的表位结合位点的图示。
25.图9：1245_p02_g04的表位作图数据。seq id no:1上1245_p02_g04的表位结合位点的图示。
26.图10：1251_p02_c05的表位作图数据。seq id no:1上1251_p02_c05的表位结合位点的图示。
27.图11：1141_p01_e01的表位作图数据。seq id no:1上1141_p01_e01的表位结合位点的图示。
28.图12：实施例10的实验1期间的总细胞计数。用本文所描述的不同浓度的抗vδ1抗
体培养样品，并与用比较抗体或对照培养的样品进行比较。图显示(a)第7天、(b)第14天和(c) 第18天的总细胞计数。
29.图13：实施例10的实验1期间的vδ1t细胞分析。图显示第18天样品中的(a)vδ1t细胞百分比、(b)vδ1t细胞计数和(c)vδ1倍数变化。
30.图14：实施例10的实验2期间的总细胞计数。用本文所述的不同浓度的抗vδ1抗体培养样品，并与用比较抗体或对照培养的样品进行比较。图显示(a)第7天、(b)第11天、(c)第14 天和(d)第17天的总细胞计数。
31.图15：实施例10的实验2期间的vδ1t细胞分析。图显示第17天样品中的(a)vδ1t细胞百分比、(b)vδ1t细胞计数和(c)vδ1倍数变化。
32.图16：细胞组成分析。在实验2的第17天测量样品中存在的细胞类型(包括非vδ1细胞)。收获细胞并通过流式细胞术分析vδ1、vδ2和αβtcr的表面表达。百分比值也提供在表6中。
33.图17：sytox-流式杀伤测定法结果。使用sytox-流式杀伤测定法测试细胞功能，结果显示为(a)实验1的第14天，使用效靶(e:t)比为10:1的细胞，和(b)实验2的第17天(冻融后)，使用e:t比为1:1和10:1的细胞。
34.图18：冻融后的总细胞计数。图显示在冷冻前与b07、c08、e07、g04或okt-3抗体接触的培养物，在冻融后培养细胞7天后的总细胞计数。
35.图19：监测细胞扩增。监测冻融后培养的细胞的总细胞计数，直至第42天。
36.图20：抗vδ1抗体赋予人肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞(til)的调节和增殖。肾细胞癌 (rcc) /-抗体的研究。a)til vδ1 细胞的倍数增加。b)til vδ1 细胞总数。c)门控策略示例d)til vδ1 细胞的比较细胞表面表型谱。e)til vδ1阴性门控级分的分析。
具体实施方式
37.定义
38.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予它们的含义。
39.gamma delta(γδ)t细胞代表t细胞的一个小的亚群，其在细胞表面表达一种独特的、限定的t细胞受体(tcr)。该tcr由一条gamma(γ)和一条delta(δ)链组成。每条链包含可变(v) 区、恒定(c)区、跨膜区和胞质尾区。v区包含抗原结合位点。人γδt细胞有两种主要的亚型：一种在外周血中占优势，另一种在非造血组织中占优势。这两种亚型可以由细胞上存在的δ和/或γ的类型来定义。例如，在外周血中占优势的γδt细胞主要表达delta可变2链(vδ2)。在非造血组织中占优势的γδt细胞(即，组织驻留的γδt细胞)主要表达delta可变1(vδ1)链。提及“vδ1t细胞”是指具有vδ1链的γδt细胞，即，vδ1

t细胞。
40.提及“δ可变1”也可以指vδ1或vd1，而编码包含该区的tcr链的核苷酸可称为“trdv1”。与γδtcr的vδ1链相互作用的抗体或其片段都是与vδ1结合的有效抗体或其片段，并且可称为“抗tcrδ可变1抗体或其片段”或“抗vδ1抗体或其片段”。
41.本文另外提及了其他delta链，例如“delta可变2”链。这些链可以以类似的方式指代。例如，δ可变2链可以称为vδ2，而编码包含该区的tcr链的核苷酸可以称为“trdv2”。在优选实施方案中，与γδtcr的vδ1链相互作用的抗体或其片段不与其他delta链如vδ2相互作
用。
42.本文还提及“gamma可变链”。这些链可称为γ-链或vγ，而编码包含该区的tcr链的核苷酸可称为trgv。例如，trgv4是指vγ4链。在一个优选的实施方案中，与γδtcr的vδ1 链相互作用的抗体或其片段不与gamma链如vγ4相互作用。
43.术语“抗体”包括任何包含至少一个抗体可变结构域的抗体蛋白构建体，该抗体可变结构域包含至少一个抗原结合位点(abs)。抗体包括但不限于iga、igg、ige、igd、igm类型(及其亚型)的免疫球蛋白。免疫球蛋白g(igg)抗体的整体结构已在哺乳动物中充分确立并且是高度保守的，其由两条相同的重(h)链和两条相同的轻(l)链多肽组装而成(padlan(1994) mol.immunol.31:169-217)。
44.常规抗体或免疫球蛋白(ig)是包含四条多肽链的蛋白：两条重(h)链和两条轻(l)链。每条链分为恒定区和可变结构域。重(h)链可变结构域在本文中缩写为vh，轻(l)链可变结构域在本文中缩写为vl。这些结构域、与其相关的结构域和从其衍生的结构域在本文中可称为免疫球蛋白链可变结构域。vh和vl结构域(也称为vh和vl区)可以进一步细分为称为“互补决定区”(“cdr”)的区，其中散布着更保守的区，称为“框架区”(“fr”)。框架区和互补决定区已被精确定义(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest,fifth edition u.s. department of health and human services,(1991)nih publication number 91-3242)。对于 cdr序列，还存在一些可替代的编号规则，例如在chothia等人(1989)nature 342:877-883中列出的那些。在常规抗体中，每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的常规抗体四聚体由免疫球蛋白重链和轻链通过例如二硫键链间连接形成，重链以类似方式连接。重链恒定区包含三个结构域，ch1、ch2和ch3。轻链恒定区由一个结构域cl组成。重链的可变结构域和轻链的可变结构域是与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
45.如本文所用的抗体片段(其也可称为“抗体片段”、“免疫球蛋白片段”、“抗原结合片段”或“抗原结合多肽”)是指抗体的一部分(或含有所述部分的构建体)，其特异性结合靶标——γδt细胞受体的delta可变1(vδ1)链(例如，一种分子，其中一条或多条免疫球蛋白链不是全长的，但特异性结合靶标)。包含在术语抗体片段中的结合片段的示例包括：
46.(i)fab片段(由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段)；
47.(ii)f(ab')2片段(由在铰链区通过二硫键桥连接的两个fab片段组成的二价片段)；
48.(iii)fd片段(由vh和ch1结构域组成)；
49.(iv)fv片段(由抗体单臂的vl和vh结构域组成)；
50.(v)单链可变片段，scfv(由使用重组方法通过合成接头连接的vl和vh结构域组成，使它们能够制备为单条蛋白链，其中vl和vh区配对形成单价分子)；
51.(vi)vh(由vh结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
52.(vii)vl(由vl结构域组成的免疫球蛋白链可变结构域)；
53.(viii)结构域抗体(dab，由vh或vl结构域组成)；
54.(ix)微型抗体(minibody，由通过ch3结构域连接的一对scfv片段组成)；和
55.(x)双体抗体(diabody，由scfv片段的非共价二聚体组成，该scfv片段由来自一种抗体的vh结构域通过小肽接头与来自另一种抗体的vl结构域连接组成)。
[0056]“人抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。施用所述人抗体的人受试者不对所述抗体中包含的一级氨基酸产生跨物种抗体反应(例如，称为hama反应-人抗小鼠抗体)。所述人抗体可以，例如在cdr中，特别是在cdr3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机或位点特异性诱变或通过体细胞突变引入的突变)。但是，该术语不旨在包括这样的抗体，其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的cdr序列已嫁接到人框架序列上。通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体文库中分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体、或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体，也可称为“重组人抗体”。
[0057]
非人免疫球蛋白可变结构域的框架区中的至少一个氨基酸残基被来自人可变结构域的相应残基取代，称为“人源化”。可变结构域的人源化可以降低在人中的免疫原性。
[0058]“特异性”是指特定抗体或其片段可以结合的不同类型抗原或抗原决定簇的数量。抗体的特异性是抗体将特定抗原识别为独特分子实体并将其与其他抗原区分开来的能力。“特异性结合”抗原或表位的抗体是本领域熟知的术语。如果与可替代的靶标相比，一个分子与特定靶标抗原或表位的反应更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更强，则称其表现出“特异性结合”。如果与其他物质相比，抗体以更大的亲和力(affinity)、亲合性(avidity)、更容易和/或持续时间更长结合靶标抗原或表位，则抗体“特异性地结合”该靶标抗原或表位。
[0059]“亲和力(affinity)”由抗原与抗原结合多肽(kd)解离的平衡常数表示，是抗原决定簇与抗体(或其片段)上的抗原结合位点之间结合强度的量度：kd值越小，抗原决定簇与抗原结合多肽之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(ka)，即1/kd。亲和力可以通过已知方法确定，具体取决于特定目的抗原。
[0060]
任何小于10-6
的kd值均被认为指示结合。可以以任何合适的已知方式确定抗体或其片段与抗原或抗原决定簇的特异性结合，包括例如scatchard分析和/或竞争性结合测定法，例如放射免疫测定法(ria)、酶免疫测定法(eia)和夹心竞争测定法、平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、elisa、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定法)及本领域已知的其不同变化形式。
[0061]“亲合性(avidity)”是抗体或其片段与相关抗原之间结合强度的量度。亲合性与抗原决定簇与抗体上的其抗原结合位点之间的亲和力以及抗体上存在的相关结合位点的数量有关。
[0062]“人组织vδ1 细胞”、“造血和血液vδ1 细胞”和“肿瘤浸润淋巴细胞(til)vδ1 细胞”分别定义为人组织或造血系统或人肿瘤中包含或衍生的vδ1 细胞。所有所述细胞类型可以通过它们的(i)位置或它们的来源之处和(ii)它们的vδ1 tcr表达来识别。
[0063]“调节抗体”是当与表达抗体结合的靶标的细胞接触或结合时赋予可测量的变化的抗体，所述变化包括但不限于在细胞周期、和/或细胞数量、和/或细胞活力、和/或一种或多种细胞表面标志物、和/或在一种或多种分泌分子(例如，细胞因子、趋化因子、白三烯等)
的分泌、和/或功能(对靶细胞或患病细胞的细胞毒性)中的可测量的变化。
[0064]“调节”细胞或其群的方法是指一种方法，其中在所述一个或多个细胞中或其分泌物中触发至少一个可测量的变化，产生一个或多个“被调节的细胞”。
[0065]“免疫应答”是指在添加调节抗体时，免疫系统的至少一个细胞、或一个细胞类型、或一个内分泌通路、或一个外分泌通路中的可测量的变化(包括但不限于细胞介导的应答、体液应答、细胞因子应答、趋化因子应答)。
[0066]“免疫细胞”定义为免疫系统的细胞，包括但不限于cd34 细胞、b细胞、cd45 (淋巴细胞共同抗原)细胞、alpha-betat细胞、细胞毒性t细胞、辅助t细胞、浆细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞、血小板、树突状细胞、吞噬细胞、粒细胞、先天性淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞和gammadeltat细胞。通常，借助组合细胞表面分子分析(例如，通过流式细胞术)对免疫细胞进行分类，以识别或分组或聚类以将免疫细胞区分成亚群。然后可以通过另外的分析进一步细分这些亚群。例如，cd45 淋巴细胞可以进一步细分为vδ阳性群和vδ阴性群。
[0067]“模型系统”是旨在帮助理解如抗体或其片段的药物如何作为药物发挥改善疾病体征或症状的功能的生物学模型或生物学表征。此类模型通常包括使用体外、离体和体内患病细胞、未患病细胞、健康细胞、效应细胞和组织等，并在该模型中研究和比较所述药物的性能。
[0068]“患病细胞”表现出与疾病进展相关的表型，所述疾病例如癌症、感染例如病毒感染、或炎性疾患或炎性疾病。例如，患病细胞可以是肿瘤细胞、自身免疫组织细胞或病毒感染的细胞。因此，所述患病细胞可定义为肿瘤细胞、病毒感染细胞或炎性细胞。
[0069]“健康细胞”是指没有患病的正常细胞。它们也可以称为“正常”或“未患病”细胞。未患病细胞包括非癌性的、未感染的或非炎性细胞。所述细胞通常与相关患病细胞一起使用以确定药物赋予的患病细胞特异性和/或更好地理解药物的治疗指数。
[0070]“患病细胞特异性”是效应细胞或其群(例如，vδ1 细胞群)如何有效地区分和杀伤患病细胞(例如癌细胞)同时保留非患病或健康细胞的量度。这种潜力可以在模型系统中测量，并且可以包括比较效应细胞或效应细胞群选择性杀伤或裂解患病细胞的倾向与所述效应细胞杀伤或裂解非患病或健康细胞的潜力。所述患病细胞特异性可以告知药物的潜在治疗指数(therapeuticindex)。
[0071]“增强的患病细胞特异性”描述了效应细胞的表型，例如vδ1 细胞或其群，其已被调节以进一步增加其特异性杀伤患病细胞的能力。这种增强可以通过多种方式测量，包括患病细胞杀伤特异性或选择性的倍数变化或百分比增加。
[0072]
适当地，本发明的抗体或其片段(即，多肽)是分离的。“分离的”多肽是从其原始环境中去除的多肽。术语“分离的”可用于指基本上不含其他抗体的抗体，所述其他抗体具有不同的抗原特异性(例如，特异性结合vδ1的分离抗体或其片段基本上不含特异性结合除vδ1以外的抗原的抗体)。术语“分离的”也可用于指这样的制剂，当被配制成药物组合物的活性成分时，其中分离的抗体足够纯以用于治疗性施用，或至少70-80％(w/w)纯，更优选至少80-90％(w/w)纯，甚至更优选90-95％纯；并且最优选地，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。
[0073]
合适地，用于本发明的多核苷酸是分离的。“分离的”多核苷酸是从其原始环境中
去除的多核苷酸。例如，如果将天然存在的多核苷酸与天然系统中的一些或所有共存物质分离，则该天然存在的多核苷酸是分离的。例如，如果多核苷酸被克隆到不属于其天然环境一部分的载体中或如果其包含在cdna中，则认为该多核苷酸是分离的。
[0074]
抗体或其片段可以是“功能活性变体”，这还包括天然存在的等位基因变体、以及突变体或任何其他非天然存在的变体。如本领域已知的，等位基因变体是(多)肽的替代形式，其特征在于具有基本上不改变多肽生物学功能的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。作为非限制性示例，当包含cdr的框架被修饰时、当cdr本身被修饰时、当所述cdr被移植到替代框架上时、或者当n-或c-末端延伸被并入时，所述功能活性变体仍然可以发挥功能。此外，包含cdr的结合结构域可以与不同的配偶链配对，例如与另一抗体共有的那些配偶链。在与所谓的“共有”轻链或“共有”重链共有后，所述结合结构域可能仍然发挥功能。此外，所述结合结构域可以在多聚化时发挥功能。此外，“抗体或其片段”还可以包含功能变体，其中vh或 vl或恒定结构域已被修饰掉或朝向不同的规范序列修饰(例如，在imgt.org上列出的)并且仍然发挥功能。
[0075]
为了比较两个密切相关的多肽序列，可以使用ncbi blast v2.0、使用多肽序列的标准设置(blastp)来计算第一多肽序列和第二多肽序列之间的“序列同一性％”。为了比较两个密切相关的多核苷酸序列，可以使用ncbi blast v2.0、使用核苷酸序列的标准设置(blastn) 来计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性％”。
[0076]
如果多肽或多核苷酸序列在其整个长度上共有100％的序列同一性，则称多肽或多核苷酸序列与其他多肽或多核苷酸序列相同或“同一”。序列中的残基从左到右编号，即，多肽从n
‑ꢀ
末端到c-末端编号；多核苷酸从5'到3'末端编号。
[0077]
序列之间的“差异”是指与第一序列相比，在第二序列的某个位置插入、缺失或取代了单个氨基酸残基。两个多肽序列可以包含一个、两个或更多个这样的氨基酸差异。在与第一序列相同(100％序列同一性)的第二序列中的插入、缺失或取代导致降低的％序列同一性。例如，如果相同序列的长度为9个氨基酸残基，则第二序列中的一个取代导致88.9％的序列同一性。如果第一和第二多肽序列的长度为9个氨基酸残基并且共有6个相同的残基，则第一和第二多肽序列共有大于66％的同一性(第一和第二多肽序列共有66.7％同一性)。
[0078]
或者，为了比较第一参考多肽序列与第二比较多肽序列的目的，可以确定对第一序列进行的添加、取代和/或缺失的数量以产生第二序列。“添加”是将一个氨基酸残基添加到第一多肽的序列中(包括在第一多肽的任一末端添加)。“取代”是用一个不同的氨基酸残基取代第一多肽序列中的一个氨基酸残基。所述替代可以是保守的或非保守的。“缺失”是从第一多肽的序列中缺失一个氨基酸残基(包括在第一多肽任一末端的缺失)。
[0079]“保守”氨基酸取代是这样的氨基酸取代，其中一个氨基酸残基被另一个化学结构相似并且预期对多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有影响的氨基酸残基取代。此类保守取代适当地是以下取代，其中以下组中的一个氨基酸被同一组中的另一个氨基酸残基取代：
[0080][0081]
合适地，疏水性氨基酸残基是非极性氨基酸。更合适地，疏水性氨基酸残基选自v、i、 l、m、f、w或c。
[0082]
如本文所用，多肽序列的编号以及cdr和fr的定义根据kabat系统(kabat等人,1991, 以引用方式整体并入本文)限定。第一和第二多肽序列之间的“相应”氨基酸残基是根据kabat 系统与第二序列中的氨基酸残基共有相同位置的第一序列中的氨基酸残基，而第二序列中的氨基酸残基可以与第一序列的标识不同。合适地，如果根据kabat定义，框架和cdr的长度相同，则相应的残基将共有相同的数字(和字母)。可以手动或通过使用例如用于序列比对的已知计算机算法如ncbi blast v2.0(blastp或blastn)，使用标准设置来实现比对。
[0083]
本文提及的“表位”是指被抗体或其片段特异性结合的靶标部分。表位也可称为“抗原决定簇”。当抗体与另一种抗体都识别相同或空间重叠的表位时，那么该抗体与另一种抗体结合“基本上相同的表位”。确定两种抗体是否结合相同或重叠表位的常用方法是竞争测定法，使用标记的抗原或抗体，该测定法可以配置为多种不同的格式(例如，使用放射性或酶标记的孔板，或对表达抗原的细胞进行流式细胞术)。
[0084]
在蛋白靶标上发现的表位可定义为“线性表位”或“构象表位”。线性表位由蛋白抗原中的连续氨基酸序列形成。构象表位由在蛋白序列中不连续的氨基酸形成，但在蛋白折叠成其三维结构时它们在一起。
[0085]
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链dna环，其中可以连接其他dna区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他dna区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物和酵母载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的
基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，还包括噬菌体和噬菌粒系统。如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指已引入重组表达载体的细胞。此类术语旨在不仅指特定的受试细胞，而且还指此类细胞的后代，例如，当所述后代用于制备细胞系或细胞库时，该细胞系或细胞库随后任选地被储存、提供、出售、转移、或用于制造如本文所述的抗体或其片段。
[0086]
提及“受试者”、“患者”或“个体”是指待治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、农场动物(例如奶牛)、运动动物或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，受试者是人。在替代实施方案中，受试者是非人哺乳动物，例如小鼠。
[0087]
术语“足够量”是指足以产生所需效果的量。术语“治疗有效量”是有效改善疾病或疾患的症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
[0088]
如本文所用，术语“约”在本文中使用时包括比指定值高多达10％且包括10％、并且低多达10％且包括10％，适当地，比指定值高多达5％且包括5％、并且低多达5％且包括5％，特别是指定值。术语“之间”包括指定边界的值。
[0089]
如果疾病或疾患的体征或症状的严重性、受试者经历这种体征或症状的频率降低，或两者都降低，则疾病或疾患被“改善”。
[0090]
如本文所用，“治疗疾病或疾患”意指降低受试者经历的疾病或疾患的至少一种体征或症状的频率和/或严重性。
[0091]
如本文所用，“癌症”是指细胞的异常生长或分裂。通常，癌细胞的生长和/或寿命超过其周围正常细胞和组织的生长和/或寿命，并且与其不协调。癌症可以是良性的、癌变前的或恶性的。癌症发生在多种细胞和组织中，包括口腔(如口、舌、咽等)、消化系统(如食道、胃、小肠、结肠、直肠、肝脏、胆管、胆囊、胰腺等)、呼吸系统(例如，喉、肺、支气管等)、骨骼、关节、皮肤(例如，基底细胞、鳞状细胞、脑膜瘤等)、乳房、生殖系统(例如，子宫、卵巢、前列腺、睾丸等)、泌尿系统(如膀胱、肾脏、输尿管等)、眼、神经系统(如脑等)、内分泌系统(如甲状腺等)和造血系统(如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病等)。
[0092]
调节γδt细胞的方法
[0093]
根据本发明的第一方面，提供了一种调节delta可变1链(vδ1)t细胞的离体方法，包括向包含vδ1t细胞的细胞群施用如本文限定的抗vδ1抗体或其片段。应当理解，“施用”抗体或其片段包括“接触”vδ1t细胞。
[0094]
vδ1t细胞的调节可包括：
[0095]-vδ1t细胞的扩增，例如，通过选择性地增加vδ1t细胞的数量或促进vδ1t细胞的存活；
[0096]-刺激vδ1t细胞，例如，通过增加vδ1t细胞的效能，即，增加靶细胞杀伤；
[0097]-防止vδ1t细胞耗竭，例如，通过增加vδ1t细胞的持久性；
[0098]-vδ1t细胞的脱粒；
[0099]-vδ1t细胞的免疫抑制，例如，通过下调vδ1tcr细胞表面表达，即，通过引起vδ1tcr 内化或降低vδ1tcr蛋白的表达，或阻断vδ1tcr结合；
[0100]-降低vδ1t细胞数量，例如，通过抑制vδ1t细胞增殖或通过诱导vδ1t细胞死亡(即，杀伤vδ1t细胞)。
[0101]
vδ1t细胞的这种调节可以包括，例如，vδ1t细胞活化或vδ1t细胞抑制。在一个实施方案中，通过施用如本文限定的抗vδ1抗体或其片段来活化vδ1t细胞。在一个替代实施方案中，通过施用如本文限定的抗vδ1抗体或其片段来抑制vδ1t细胞。在一个替代实施方案中，在向患者施用如本文定义的抗vδ1抗体或其片段后，vδ1t细胞不被抑制。
[0102]
在一个实施方案中，vδ1t细胞的调节包括向培养物中的vδ1t细胞施用抗tcr delta 1 可变抗体或其片段(即，体外或离体)。vδ1t细胞可能存在于混合细胞群中，例如，在包含其他淋巴细胞类型(例如，αβt细胞或nk细胞)的细胞群中。
[0103]
在一个实施方案中，在施用抗vδ1抗体或其片段之前分离包含vδ1t细胞的细胞群(即，从如本文所描述的样品中)。在另一个实施方案中，在施用抗vδ1抗体或其片段之前，富集细胞群的t细胞。在又一个实施方案中，在施用抗vδ1抗体或其片段之前，富集细胞群的γδt 细胞。
[0104]
该方法也可以在包含纯化的γδt细胞级分的细胞群上进行。在这样的实施方案中，在施用抗vδ1抗体或其片段之前，从细胞群中耗尽样品中存在的γδt细胞以外的细胞类型，例如耗尽αβt细胞和/或nk细胞。在施用抗vδ1抗体或其片段之前，额外地或替代地，可以富集细胞群中可能含有vδ1的细胞类型，例如t细胞和/或γδ细胞。例如，在培养样品之前，可以富集样品的t细胞，或富集γδt细胞，或耗尽αβt细胞或耗尽非γδt细胞。在一个实施方案中，首先耗尽样品的αβt细胞，然后富集cd3 细胞。可以使用本领域已知的技术来实现富集或耗尽，例如使用包被抗体的磁珠，该抗体与细胞表面上与待富集/去除的表型相关的分子结合。
[0105]
细胞培养物中存在淋巴细胞以外的细胞类型可能抑制vδ1细胞的扩增。这样的细胞，例如，基质细胞、上皮细胞、肿瘤细胞和/或饲养层细胞，可以在培养前去除。因此，在一个实施方案中，细胞群在培养期间不与基质细胞直接接触。基质细胞的示例包括成纤维细胞、周细胞、间充质细胞、角质细胞、内皮细胞和非血液肿瘤细胞。优选地，淋巴细胞在培养期间不与成纤维细胞直接接触。在一个实施方案中，细胞群在培养期间不与上皮细胞直接接触。在一个实施方案中，细胞群在培养期间不与肿瘤细胞和/或饲养层细胞直接接触。
[0106]
在一个实施方案中，该方法包括在不存在大量基质细胞接触的情况下培养vδ1t细胞。在另一个实施方案中，该方法包括在不存在成纤维细胞实质性接触的情况下培养vδ1t细胞。
[0107]
在一个实施方案中，该方法包括在基本上不含血清(例如，无血清培养基或含有血清替代物(sr)的培养基)的培养基中培养vδ1t细胞。因此，在一个实施方案中，该方法包括在无血清培养基中培养。此类无血清培养基还可以包括血清替代培养基，其中血清替代基于化学上确定的成分以避免使用人或动物来源的血清。在一个替代实施方案中，该方法包括在含有血清的培养基中培养(例如，人ab血清或胎牛血清(fbs))。在一个实施方案中，培养基含有血清替代物。在一个实施方案中，培养基不含动物来源的产品。
[0108]
应当理解，在无血清培养基中培养的样品具有避免过滤、沉淀、污染和血清供应问题的优点。此外，动物来源的产品不适合用于临床级制备人治疗剂。与使用含有ab血清的培养基相比，对细胞(特别是vδ1t细胞)使用无血清培养基，显著增加了从样品中获得的细胞数量。
[0109]
在一个实施方案中，抗vδ1抗体或其片段是可溶的或固定的形式。例如，抗体或其片段可以以可溶形式施用于vδ1t细胞。或者，当抗体或其片段结合或共价连接至表面，例如珠子或板时(即，以固定形式)，可将抗体或其片段施用于vδ1t细胞。在一个实施方案中，抗体固定在表面上，例如fc包被的孔。或者，抗体或其片段与细胞表面结合(例如，固定在抗原呈递细胞(apc)的表面)。在另一个实施方案中，当细胞群与抗体接触时，抗体没有固定在表面上。
[0110]
与抗vδ1抗体或其片段接触的细胞群可获自多种样品类型(分离方法在下文进一步描述)。在一个实施方案例中，样品是非造血组织样品。本文提及的“非造血组织”或“非造血组织样品”包括皮肤(例如人皮肤)和肠道(例如人肠道)。非造血组织是血液、骨髓、淋巴组织、淋巴结组织或胸腺组织以外的组织。在一个实施方案中，非造血组织样品是皮肤(例如人皮肤)。在一些实施方案中，细胞群(例如γδt细胞)不是从特定类型的生物体液样品(例如血液或滑液)中获得的。在一些实施方案中，细胞群(例如γδt细胞)从皮肤(例如人皮肤)中获得，其可以通过本领域已知的方法获得。例如，可以通过在合成支架上培养非造血组织样品来从非造血组织样品中获得细胞群，所述合成支架被配置为促进细胞从非造血组织样品中离开(egress)。或者，这些方法可以应用于从胃肠道(例如，结肠或肠道)、乳腺、肺、前列腺、肝脏、脾脏、胰腺、子宫、阴道和其他皮肤、黏膜或浆膜获得的细胞群(例如γδt细胞)。
[0111]
在一个替代实施方案中，样品是造血样品或其级分(即，细胞群是从造血样品或其级分中获得的)。本文提及的“造血样品”或“造血组织样品”包括血液(例如外周血或脐带血)、骨髓、淋巴组织、淋巴结组织、胸腺组织及其级分或富集部分。样品优选是血液，包括外周血或脐带血或其级分，包括血沉棕黄层细胞、白细胞去除术的产物、外周血单个核细胞(pbmc)和低密度单个核细胞(ldmc)。在一些实施方案中，样品是人血液或其级分。可以使用本领域已知的技术例如密度梯度离心从血液样品中获得细胞。例如，可以将全血在等体积的 ficoll-hypaque上分层，然后在室温下以400xg离心15-30分钟。界面物质将包含低密度单个核细胞，可将其收集、在培养基中洗涤、并在室温下以200xg离心10分钟。
[0112]
可以从癌组织样品(例如，乳腺或前列腺肿瘤)中获得细胞群(即，γδt细胞也可驻留于癌组织样品中)。在一些实施方案中，细胞群可以来自人癌组织样品(例如，实体瘤组织)。在其他实施方案中，细胞群可以来自人癌组织以外(例如，没有大量肿瘤细胞的组织)的样品。例如，细胞群可以来自与附近或邻近的癌组织分开的皮肤区域(例如，健康皮肤)。因此，在一些实施方案中，细胞群不是从癌组织(例如，人癌组织)中获得的。
[0113]
细胞群可以从人或非人动物组织中获得。因此，该方法可以另外包括从人或非人动物组织获得细胞群的步骤。在一个实施方案中，已经从人获得样品。在一个替代实施方案中，已经从非人动物受试者中获得样品。
[0114]
γδt细胞的扩增
[0115]
在一个实施方案中，调节包括vδ1t细胞的活化，特别是vδ1t细胞的扩增。因此，根
据本发明的一个方面，提供了一种扩增vδ1t细胞的离体方法，包括向包含vδ1t细胞的细胞群施用如本文限定的抗vδ1抗体或其片段。vδ1t细胞的这种扩增可以通过选择性增加vδ1 t细胞的数量和/或通过促进vδ1t细胞的存活来实现。在一个实施方案中，vδ1t细胞的扩增包括向培养物中的vδ1t细胞施用抗tcr delta 1可变抗体或其片段(即体外或离体)。vδ1t 细胞可能存在于混合细胞群中，例如，在包含其他淋巴细胞类型(例如，αβt细胞或nk细胞) 的细胞群中。
[0116]
因此，本发明提供离体产生富集的γδt细胞(例如，vδ1t细胞)群的方法。通过以下方法可以从分离的混合细胞群(例如，从取自患者/供体的样品中获得)中产生富集的群：所述方法包括使混合细胞群或其纯化级分与抗体或其片段接触。所述抗体(或其片段)通过与对γδtcr的 vδ1链特异性的表位结合来选择性地扩增vδ1t细胞。
[0117]
还提供了根据本文定义的方法获得的扩增的vδ1t细胞群。根据本发明的这个方面，应当理解，可以在体外或离体获得和/或扩增这种扩增的vδ1t细胞的群。在一个方面，提供了根据如本文限定的方法获得的扩增的vδ1群，其中vδ1群在体外或离体分离和扩增。
[0118]
如本文所述的抗体或其片段可用于扩增γδt细胞(例如，vδ1t细胞)的方法中。这些方法可以在体外进行。如果在体外进行扩增方法，则可以将抗体(或其片段)应用于如上所描述获得的分离的γδt细胞(例如，vδ1t细胞)。在一些实施方案中，从已经从非造血组织样品中分离的细胞群中扩增γδt细胞。在一个替代实施方案中，从已经从造血组织样品(例如血液样品) 中分离的细胞群中扩增γδt细胞。
[0119]
γδt细胞(例如，vδ1t细胞)的扩增可以包括在存在如本文所述的抗体或其片段以及细胞因子的情况下培养样品。细胞因子可包括白细胞介素、淋巴因子、干扰素、集落刺激因子和趋化因子。在一个实施方案中，细胞因子选自白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-4(il-4)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-7(il-7)、白细胞介素-8(il-8)、白细胞介素-9(il-9)、白细胞介素
ꢀ‑
12(il-12)、白细胞介素-18(il-18)、白细胞介素-21(il-21)、白细胞介素-33(il-33)、胰岛素样生长因子1(igf-1)、白细胞介素-1β(il-1β)、干扰素-γ(ifn-γ)和基质细胞衍生因子-1(sdf-1)。应当理解，提及本文所述的细胞因子时，可以包括任何化合物，其在促进培养中的vδ1t细胞的类似生理作用的能力方面具有与所述细胞因子相同的活性，并且包括但不限于，其模拟物或任何功能等效物。
[0120]
在一个实施方案中，所述细胞因子是通常的细胞因子受体gamma链(γc)细胞因子家族。在另一个实施方案中，γ
c-细胞因子选自：il-2、il 4、il-7、il-9、il-12、il-15、il-21或其混合物。
[0121]
所使用的细胞因子(例如，白细胞介素)可以是人或动物来源的，优选是人来源的。其可以是野生型蛋白或任何生物活性片段或变体，也就是说，能够与其受体结合。这种结合可以在根据本发明方法的条件下诱导γδt细胞的活化。更优选地，细胞因子可以是可溶形式、与另一分子融合或复合，所述另一分子是，例如肽、多肽或生物活性蛋白。优选地，使用人重组细胞因子。更优选地，白细胞介素浓度范围可以在1-10000u/ml之间变化，甚至更优选在 100-1000u/ml之间。
[0122]
在进一步的实施方案中，细胞因子是趋化因子。还应理解，趋化因子将根据用于获得γδt 细胞的样品而变化和选择。
[0123]
在一个实施方案中，该方法包括在存在il-2、il-9和/或il-15的情况下培养细胞
群。在进一步的实施方案中，该方法包括在存在il-2和/或il-15的情况下培养细胞群(即，il-2、il-15 或其组合)。在替换的实施方案中，该方法包括在存在il-9和/或il-15的情况下培养细胞群(即， il-9、il-15或其组合)。在一个实施方案中，该方法包括在存在il-2、il-9和/或il-15以及另外的生长因子(例如，il-21)的情况下的细胞群。在其他实施方案中，该方法包括在不含il-2 和/或il-15以外的生长因子的培养基中培养细胞群。在替代实施方案中，该方法包括在不含 il-9和/或il-15以外的生长因子的培养基中培养细胞群。在另一个实施方案中，该方法包括在由基础培养基组成的培养基中培养细胞群，该基础培养基补充有il-2、il-9和/或il-15。在另一个实施方案中，该方法包括在由基础培养基组成的培养基中培养细胞群，该基础培养基补充有il-2和/或il-15。
[0124]
在一个实施方案中，该方法包括在存在il-21的情况下培养细胞群。
[0125]
在一个实施方案中，该方法包括在存在il-4的情况下培养细胞群。il-4促进vδ1t细胞的生理作用(如wo2016/198480中所述)包括降低nkg2d和ncr的表达水平、抑制细胞毒性功能和改善选择性存活。此外，先前已经表明，在培养后几天不存在il-4可以将细胞的生理特性改变为更适合用作抗肿瘤或抗病毒治疗的表型。因此，在一个实施方案中，扩增方法包括在不存在具有il-4样活性的生长因子(例如il-4)的情况下进一步培养样品。在一个实施方案中，扩增方法包括在不存在il-4的情况下培养样品。
[0126]
在一个实施方案中，细胞因子是具有白细胞介素-15样活性的生长因子，即，在促进对培养中的vδ1t细胞的类似生理作用方面具有与il-15相同活性的任何化合物，包括但不限于 il-15和il-15模拟物，或il-15的任何功能等效物，包括il-2和il-7。il-15、il-2和il-7 促进培养的vδ1t细胞的生理作用(如wo2016/198480中所述)基本相同，即诱导细胞分化为更具细胞毒性的表型。此外，之前已经表明，在培养的最初几天不存在il-2、il-7和il-15 导致污染细胞(包括tcrαβ t和vδ2 t细胞)的饥饿和凋亡，这些细胞非常依赖这些细胞因子生存。因此，在一个实施方案中，扩增方法包括首先在不存在具有il-15样活性的生长因子的情况下培养样品。
[0127]
因此，在一个实施方案中，该方法包括在包含il-4的第一培养基中培养细胞群，然后在包含il-15的第二培养基中培养细胞群。
[0128]
在一个实施方案中，第一培养基不存在il-15、il-2和/或il-7。在一个实施方案中，第二培养基不存在il-4。
[0129]
因此，在一个实施方案中，扩增方法包括：
[0130]
(1)在包含如本文所述的抗体或其片段和il-4；不存在il-15、il-2和il-7的第一培养基中培养样品中的细胞；以及
[0131]
(2)在包含如本文所述的抗体或其片段和il-15；不存在il-4的第二培养基中培养步骤(1) 中获得的细胞。
[0132]
如本文所述，培养基还可以包含其他生长因子，包括可以进一步增强vδ1t细胞扩增的细胞因子。此类细胞因子的示例包括但不限于：(i)ifn-γ和具有ifn-γ样活性的任何生长因子、 (ii)il-21和具有il-21样活性的任何生长因子和(iii)il-1β和具有il-1β样活性的任何生长因子。可以添加的其他生长因子的示例包括共刺激分子，例如人抗slam抗体、cd27的任何可溶性配体或cd7的任何可溶性配体。这些生长因子的任何组合都可以包含在培养基中。
[0133]
在一个实施方案中，第一或第二培养基或两种培养基包含一种或多种另外的细胞因子。第一和/或第二培养基可以包含第二、第三和/或第四细胞因子。在进一步的实施方案中，另外的细胞因子选自il-21、ifn-γ和il-1β。
[0134]
在一个实施方案中，该方法包括在存在il-15和选自il-2、il-4、il-21、il-6、il-7、il-8、 il-9、il-12、il-18、il-33、igf-1、il-1β、ifn-γ、人血小板裂解物(hpl)和基质细胞衍生因子-1(sdf-1)中的一种因子的情况下培养细胞群。
[0135]
γδt细胞的扩增可以包括在存在至少一种另外的t细胞有丝分裂原的情况下培养样品。术语“t细胞有丝分裂原”(也可称为“γδtcr激动剂”)是指可通过tcr信号传导刺激t细胞的任何试剂，包括但不限于植物凝集素，例如植物血凝素(pha)和刀豆球蛋白a(cona)和非植物来源的凝集素。在一个实施方案中，t细胞有丝分裂原是抗cd3单克隆抗体(mab)。其他有丝分裂原包括佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸(tpa)及其相关化合物，例如mezerein，或细菌化合物(例如，葡萄球菌肠毒素a(sea)和链球菌蛋白a)。t细胞有丝分裂原可以是可溶的或固定的，并且在扩增方法中可以使用多于一种的t细胞有丝分裂原。
[0136]
如本文所用，提及“扩增的”或“扩增的γδt细胞群”，包括比未扩增的群更大或包含更大数量的细胞的细胞群。这样的群可以是大数量、小数量或其中群内的一部分或特定细胞类型被扩增的混合群。应当理解，术语“扩增方法”是指导致扩增或扩增的群的方法。因此，与没有进行扩增步骤或在任何扩增步骤之前的群相比，扩增或扩增的群在数量上可能更大或包含更大数量的细胞。还应理解，本文中指定的任何表示扩增的数字(例如，增加倍数或扩增倍数) 说明细胞群的数量或大小增加、或细胞的数量增加，并指示扩增的量。
[0137]
在一个实施方案中，该方法包括将细胞群培养至少5天(例如，至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少18 天、至少21天、至少28天或更长，例如，5天至40天、7天至35天、14天至28天或约21 天)。在进一步的实施方案中，该方法包括将细胞群培养至少7天，例如至少11天或至少14 天。
[0138]
在一个实施方案中，该方法包括将细胞群培养一段时间(例如，至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少18天、至少21天、至少28天或更长，例如，5天至40天、7天至35天、14天至28天或约21天)，所述一段时间的量为有效产生扩增的γδt细胞群。
[0139]
在一个实施方案中，细胞群培养5至60天的期间，例如至少7至45天、7至21天或7 至18天。如果该方法包括分离培养期间(例如，1至40天，例如14至21天)，在一些实施方案中，分离和扩增步骤可以持续21至39天。
[0140]
该方法可以包括在培养期间定期添加抗vδ1抗体或其片段和/或生长因子。例如，可以每 2至5天添加抗vδ1抗体或其片段和/或生长因子，更优选每3至4天添加。在一个实施方案中，在培养7天后添加抗vδ1抗体或其片段和/或生长因子，然后每3至4天添加。
[0141]
扩增方法提供数量大于参考群的扩增的γδt细胞群。在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如vδ1t细胞)群的数量大于扩增步骤之前的分离的γδt细胞群(例如，相对于扩增步骤之前的分离的γδt细胞群，数量上至少2倍、数量上至少5倍、数量上至少10倍、数量上至少25倍、数量上至少50倍、数量上至少60倍、数量上至少70倍、数量上至少80倍、数量上至少90倍、数量上至少100倍、数量上至少200倍、数量上至少300倍、数量上至少400 倍、数量上至少500倍、数量上至少600倍、数量上至少1000倍、或更多)。在一个实施方案中，扩
增的γδt细胞(例如vδ1t细胞)群的数量大于在不存在抗体或其片段的情况下培养相同时间长度的群。在一个实施方案中，扩增的γδt细胞(例如vδ1t细胞)群的数量大于在存在 ts8.2或ts-1的情况下培养相同时间长度的群。
[0142]
扩增方法提供了扩增的vδ1t细胞群，其具有比参考群更高的vδ1t细胞百分比。在一些实施方案中，扩增的vδ1t细胞群包含大于约50％的vδ1t细胞，例如大于约55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的vδ1t细胞。在进一步的实施方案中，扩增的vδ1t细胞群包含大于约85％的vδ1t细胞，例如大于约90％的vδ1t细胞。
[0143]
在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如vδ1t细胞)群包含少于约10％的αβt细胞，例如少于约5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％或0.05％的αβt细胞。在另一个实施方案中，扩增的vδ1t细胞群包含少于约1％的αβt细胞。具有αβ受体的t细胞具有高反应性，因此在本发明的上下文中用于施用于患者的合适细胞群仅包含低水平的αβt 细胞。本文所述的抗体可用于选择性扩增vδ1t细胞群，从而降低了在扩增后为了去除αβt 细胞而对大量纯化方法的需要。
[0144]
在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如vδ1t细胞)群包含少于约10％的vδ2t细胞，例如少于约5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％、0.2％、0.1％或0.05％的vδ2t细胞。在另一个实施方案中，扩增的vδ1t细胞群包含少于约0.5％的vδ2t细胞。
[0145]
在一些实施方案中，扩增的γδt细胞(例如vδ1t细胞)群包含少于约10％的自然杀伤(nk) 细胞(也称为cd56 cd3-细胞)，例如少于约5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％的nk 细胞。在进一步的实施方案中，扩增的vδ1t细胞群包含少于约2％的nk细胞。
[0146]
细胞表面标志物表达的增加或降低可以另外或替代地用于表征一个或多个扩增的vδ1t 细胞群，包括cd27、cd69、tigit、pd-1和tim-3。在一些实施方案中，扩增的vδ1t细胞群表达高水平的cd27(cd27
高
)。例如，大于约70％，例如大于约80％、85％、90％的扩增的vδ1t细胞群表达cd27(即，cd27 )。在一些实施方案中，相对于，例如在扩增之前的分离的vδ1t细胞群，扩增的vδ1t细胞群具有更高的cd27的平均表达。在一些实施方案中，扩增的vδ1t细胞群表达低水平的cd69、tigit、pd-1和/或tim-3。例如，小于约40％，例如小于约30％的扩增的vδ1t细胞群表达cd69、tigit、pd-1和/或tim-3。在一些实施方案中，相对于分离的vδ1t细胞群，扩增的vδ1t细胞群具有较低的一种或多种选自cd69、 tigit、pd-1和tim-3中的标志物的平均表达。
[0147]
有许多适用于γδt细胞增殖的基础培养基，特别是培养基，例如aim-v、iscoves培养基和rpmi-1640(life technologies)、exvivo-10、exvivo-15或exvivo-20(lonza)，其中存在血清或血浆。培养基可以补充有本文定义的其他培养基因子，例如血清、血清蛋白和选择试剂，例如抗生素。例如，在一些实施方案中，rpmi-1640培养基含有2mm谷氨酰胺、 10％fbs、10mm hepes，ph 7.2、1％青霉素-链霉素、丙酮酸钠(1mm；life technologies)、非必需氨基酸(例如，100μm gly、ala、asn、asp、glu、pro和ser；1 x mem非必需氨基酸(life technologies))和10μl/lβ-巯基乙醇。在一个替代实施方案中，aim-v培养基可以补充有cts免疫血清替代物和两性霉素b。在某些实施方案中，培养基可以进一步补充有il-2、 il-4、il-9和/或il-15，如本文所述。方便地，在分离和/或扩增期间，细胞在37℃下在含有 5％co2的潮湿环境中在合适的培养基中培养。
[0148]
也可以使用在γδt细胞的扩增培养中添加其他因子。在一个实施方案中，这些因子用于选择性地促进γδt细胞扩增的扩增中。例如，扩增可以另外包括向扩增培养物中添加外源细胞因子，例如白细胞介素。这种扩增可以包括在存在il-2和il-15的情况下培养γδt细胞。或者，扩增可包括在存在il-9和il-15的情况下培养γδt细胞。应当理解，任何扩增步骤都进行一段时间，以有效产生扩增的γδt细胞群。
[0149]
扩增γδt细胞的方法可以包括少于5天的群倍增时间(例如，少于4.5天、少于4.0天、少于3.9天、少于3.8天、少于3.7天、少于3.6天、少于3.5天、少于3.4天、少于3.3天、少于3.2天、少于3.1天、少于3.0天、少于2.9天、少于2.8天、少于2.7天、少于2.6天、少于2.5天、少于2.4天、少于2.3天、少于2.2天、少于2.1天、少于2.0天、少于46小时、少于42小时、少于38小时、少于35小时、少于32小时)。
[0150]
分离γδt细胞的方法
[0151]
如本文所述，抗体(或其片段)可应用于培养中的γδt细胞，即，从样品中获得的γδt细胞。在一个实施方案中，在施用抗vδ1抗体或其片段之前从样品中分离细胞群。因此，提供了一种调节(特别是扩增)vδ1t细胞的方法，所述方法包括将本文定义的抗vδ1抗体或其片段施用于从样品中分离的γδt细胞群(例如，包含vδ1t细胞的细胞群)。
[0152]
在非造血组织中占优势的γδt细胞(即，组织驻留的)主要包含delta可变1链，因此本文描述的抗vδ1抗体特别适用于从非造血组织分离中的γδt细胞。因此，在一个实施方案中，样品是非造血组织样品，例如皮肤。或者，本发明的方法可用于扩增不是主要包含vδ1链的样品中的vδ1t细胞群，例如，血液样品。因此，该方法可用于增加样品中的vδ1t细胞的数量。
[0153]
本文提及“分离”或“分离”细胞，特别是γδt细胞，是指从组织或细胞池中去除、分开、纯化、富集或以其他方式取出细胞的方法或过程。应当理解，这样的提及包括术语“分开的”、“去除的”、“纯化的”、“富集的”等。分离γδt细胞包括从完整的非造血组织样品或从非造血组织的基质细胞(例如，成纤维细胞或上皮细胞)中分离或分开细胞。这种分离可替代地或另外地包括从其他造血细胞(例如αβt细胞或其他淋巴细胞)中分离或分开γδt细胞。分离可以持续限定的一段时间，例如从将组织外植体或活检物放置在分离培养物中时开始，到从培养物中收集细胞时结束，例如通过离心或其他方式将分离的细胞群转移到扩增培养、或用于其他目的、或从培养物中去除原始组织外植体或活检物。分离步骤可以持续至少约3天至约45天。在一个实施方案中，分离步骤持续至少约10天至至少28天。在进一步的实施方案中，分离步骤持续至少14天至至少21天。因此，分离步骤可以持续至少3天、4天、5天、6天、7 天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20 天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、约35天、约40天或约45天。可以理解的是，尽管在该分离步骤中细胞增殖可能并不显著，但不一定不存在。实际上，对于本领域技术人员而言，已认识到分离的细胞也可以开始分裂以在包含样品的分离容器内产生许多这样的细胞。
[0154]
因此，本文提及“分离的γδt细胞”、“分离的γδt细胞群”或“分离的γδt细胞的群”将被理解为是指已从样品(例如原始的非造血组织样品)中分离、分开、去除、纯化或富集的γδ细胞，使得这些细胞基本上不与包含在完整(非造血组织)样品中的细胞接触。本文提及“分离的 vδ1t细胞”、“分离的vδ1t细胞群”、“分离的vδ1t细胞的群”、“分开的vδ1t细
胞”、“分开的vδ1t细胞群”或“分开的vδ1t细胞的群”将被理解为指已经从样品(例如原始的非造血组织样品)中分离、分开、去除、纯化或富集的vδ1t细胞，使得这些细胞基本上不与包含在完整(非造血组织)样品中的细胞接触。
[0155]
细胞群可以通过任何合适的方法获得，所述方法允许从人或非人动物样品(例如非造血组织样品)中分离淋巴细胞，特别是vδ1t细胞。一种这样的方法在clark等人(2006)j.invest. dermatol.126(5):1059-70中描述了，其描述了从人体皮肤中分离淋巴细胞的三维皮肤外植体方案。外植体可以附着到合成支架上以促进淋巴细胞从外植体排出到支架上。合成支架是指适合支持细胞生长的非天然三维结构。合成支架可以由以下材料构成，例如聚合物(例如，天然或合成聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯、甲基纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯)、陶瓷(例如，磷酸三钙、铝酸钙、羟基磷灰石钙)或金属(钽、钛、铂和与铂、铌、铪、钨在同一元素族中的金属及其合金的组合)。根据本领域已知的方法，生物因子(例如，胶原蛋白(例如，胶原蛋白i或胶原蛋白ii)、纤连蛋白、层粘连蛋白、整合素、血管生成因子、抗炎因子、糖胺聚糖、vitrogens、抗体及其片段、细胞因子(例如，il-2或il-15及其组合) 可以包被到支架表面上或封装在支架材料内以增强细胞粘附、迁移、存活或增殖。这种方法和其他方法可用于从许多其他非造血组织类型中分离细胞群，例如，肠道、前列腺和乳房。合适的分离方法的其他示例利用“爬出(crawl-out)”方法，其可以包括在足以诱导γδt细胞(特别是vδ1t细胞)分离或分开的细胞因子和/或趋化因子的存在下培养细胞群和/或样品。从样品(例如，非造血组织样品)中分离γδt细胞可以包括在存在il-2和il-15的情况下培养样品。
[0156]
可以收获非造血组织驻留的淋巴细胞并将其与基质细胞(例如真皮成纤维细胞)分开，例如，通过坚决的移液。淋巴细胞收获物可进一步通过40μm尼龙网进行洗涤，以截留在此过程中可能已经松散的成纤维细胞聚集体。淋巴细胞也可以通过使用例如cd45抗体的荧光或磁相关细胞分选来分离。
[0157]
或者，从样品(例如，造血组织样品)中分离γδt细胞可以包括在存在t细胞有丝分裂原(例如，γδtcr激动剂)和细胞因子(特别是常见的细胞因子受体gamma链(γc)细胞因子家族)的情况下培养样品，如wo2012/156958中所述。作为另一种选择，从样品(例如，造血组织样品) 中分离γδt细胞可以包括在存在t细胞有丝分裂原和细胞因子的情况下培养样品，如 wo2016/198480中所述。
[0158]
γδt细胞的分离可以包括在存在至少一种细胞因子的情况下培养样品。例如，该方法可以包括在存在至少一种试剂例如趋化因子的情况下培养样品。将进一步理解，将根据所分离的γδt细胞来选择趋化因子。此外，将根据用于分离γδt细胞的样品来改变和选择趋化因子。
[0159]
γδt细胞的分离可以包括在存在至少一种细胞因子的情况下进一步培养样品。所述细胞因子可以不同于初始培养中使用的细胞因子。
[0160]
分离方法可以包括培养样品。本文提及的“培养”包括将样品(包括从样品中分离、分开、去除、纯化或富集的细胞)添加到包含细胞和/或样品所需和/或优选的生长因子和/或必需营养素的培养基中。应当理解，这样的培养条件可以根据将从样品中分离的细胞或细胞群进行调整，或者可以根据将从样品中分离和扩增的细胞或细胞群进行调整。
[0161]
在某些实施方案中，样品的培养持续一段时间，以足以从样品中分离γδt细胞。在
某些实施方案中，培养的持续时间为至少14天。在某些实施方案中，培养的持续时间少于45天，例如少于30天，例如少于25天。在进一步的实施方案中，培养的持续时间在14天和35天之间，例如在14天和21天之间。在又一个实施方案中，培养的持续时间为约21天。
[0162]
在特定实施方案中，在培养样品后从培养物中收集γδt。γδt细胞的收集可以包括从培养物中物理收集γδt细胞、从其他淋巴细胞(例如，αβt细胞和/或nk细胞)中分离γδt细胞、或从样品中存在的其他细胞(例如，基质细胞，如成纤维细胞)中分离和/或分开γδt细胞。在一个实施方案中，通过机械方法(例如，移液)收集γδt细胞。在另一个实施方案中，通过磁分离和/或标记方法收集γδt细胞。在又一个实施方案中，通过流式细胞术技术例如facs收集γδt细胞。因此，在某些实施方案中，通过特异性标记γδt细胞来收集γδt细胞。应当理解，这种γδt细胞的收集可以包括从样品的培养物中物理去除、转移到单独的培养容器或转移到单独的或不同的培养条件。
[0163]
应当理解，在足以实现从样品中分离γδt细胞群的一段时间之后进行这种γδt细胞的收集。在某些实施方案中，在培养样品至少一周、至少10天、至少11天、至少12天、至少13 天或至少14天之后收集γδt细胞。适当地，在40天或更短时间之后，例如38天或更短时间、 36天或更短时间、34天或更短时间、32天或更短时间、30天或更短时间、28天或更短时间、 26天或更短时间或24天或更短时间之后收集γδt细胞。在一个实施方案中，在样品培养至少 14天之后收集γδt细胞。在另一个实施方案中，在培养样品14至21天之后收集γδt细胞。
[0164]
在一个实施方案中，在基本上不含血清(例如，无血清培养基或含有血清替代物(sr)的培养基)的培养基中培养样品。因此，在一个实施方案中，在无血清培养基中培养样品。此类无血清培养基还可以包括血清替代培养基，其中血清替代基于化学上确定的成分以避免使用人或动物来源的血清。在一个实施方案中，培养基不含动物来源的产品。在一个替代实施方案中，在含有血清的培养基中培养(例如，人ab血清或胎牛血清(fbs))培养样品。
[0165]
培养基可以另外包含可以辅助γδt细胞生长和扩增的其他成分。可以添加的其他成分的示例包括但不限于血浆或血清、纯化的蛋白如白蛋白、脂质源如低密度脂蛋白(ldl)、维生素、氨基酸、类固醇和任何其他支持或促进细胞生长和/或存活的补充剂。
[0166]
在血液中占优势的γδt细胞主要是vδ2t细胞，而在非造血组织中占优势的γδt细胞主要是vδ1t细胞，因此vδ1t细胞占非造血组织驻留的γδt细胞群的约70-80％。在一个优选的实施方案中，分离的γδt细胞包含vδ1t细胞群。
[0167]
抗体或其片段
[0168]
本文提供了能够特异性结合γδt细胞受体(tcr)的delta可变1链(vδ1)的抗体或其片段。
[0169]
在一个实施方案中，抗体或其片段是scfv、fab、fab'、f(ab')2、fv、可变结构域(例如 vh或vl)、双抗体、微型抗体或单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体或其片段是scfv。
[0170]
本文所述的抗体可以是任何类型，例如igg、iga、igm、ige、igd或其同种型，并且可以包含kappa或lambda轻链。在一个实施方案中，抗体是igg抗体，例如同种型igg1、igg2、 igg3或igg4中的至少一种。在进一步的实施方案中，抗体可以是已经被修饰以赋予所需特
性的格式(format)，例如igg格式，例如具有fc突变以降低效应子功能、延长半衰期、改变 adcc或改善铰链稳定性。这种修饰在本领域中是众所周知的。
[0171]
在一个实施方案中，抗体或其片段是人的。因此，抗体或其片段可以源自人免疫球蛋白(ig) 序列。抗体(或其片段)的cdr、框架和/或恒定区可以源自人ig序列，特别是人igg序列。人ig序列，特别是人igg序列的cdr、框架和/或恒定区可以是基本相同的。使用人抗体的一个优点是它们在人中具有低的免疫原性低或无免疫原性。
[0172]
抗体或其片段也可以是嵌合的，例如小鼠-人嵌合抗体。
[0173]
或者，抗体或其片段源自非人物种，例如小鼠。此类非人抗体可以被修饰以增加其与人天然产生的抗体变体的相似性，因此抗体或其片段可以部分或全部人源化。因此，在一个实施方案中，抗体或其片段是人源化的。
[0174]
靶向表位的抗体
[0175]
本文提供了结合γδtcr的vδ1链表位的抗体(或其片段)。这种结合可以任选地对γδtcr 活性具有影响，例如活化或抑制。
[0176]
在一个实施方案中，该表位可以是γδt细胞的活化表位。“活化”表位可以包括，例如，刺激tcr功能，例如脱粒、tcr下调、细胞毒性、增殖、动员、增加的存活或对耗竭的抗性、细胞内信号传导、细胞因子或生长因子分泌、表型改变或基因表达的改变。例如，活化表位的结合可以刺激γδt细胞群，优选vδ1 t细胞群的扩增(即，增殖)。因此，这些抗体可用于调节γδt细胞活化，从而调节免疫应答。因此，在一个实施方案中，活化表位的结合下调γδtcr。在另外的或替代的实施方案中，活化表位的结合活化γδt细胞的脱粒。在进一步的另外或替代的实施方案中，活化表位的结合活化γδt细胞杀伤。
[0177]
或者，抗体(或其片段)可通过阻止另一抗体或分子的结合或相互作用而具有阻断作用。在一个实施方案中，本发明提供了阻断vδ1并阻止tcr结合(例如，通过空间位阻)的分离抗体或其片段。通过阻断vδ1，抗体可以阻止tcr活化和/或信号传导。该表位可以是γδt细胞的抑制性表位。“抑制性”表位可以包括例如阻断tcr功能，从而抑制tcr活化。
[0178]
表位优选由γδtcr的vδ1链的至少一个胞外部分、可溶部分、亲水部分、外部或胞质部分组成。
[0179]
特别地，表位不包含在γδtcr的vδ1链的高变区，特别是vδ1链的cdr3中存在的表位。在一个优选的实施方案中，表位在γδtcr的vδ1链的非可变区内。应当理解，这种结合允许对vδ1链的独特识别，而不受高度可变的tcr序列(特别是cdr3)的限制。识别mhc 样肽或抗原的各种γδtcr复合物可以仅通过存在vδ1链的这种方式被识别。因此，应当理解，可以使用如本文定义的抗体或其片段来识别任何包含vδ1链的γδtcr，无论γδtcr的特异性如何。在一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区1-24和/或35-90内的一个或多个氨基酸残基，例如，vδ1链中不是cdr1和/或cdr3序列一部分的部分。在一个实施方案中，表位不包含seq id no:1的氨基酸区91-105(cdr3)内的氨基酸残基。
[0180]
与充分表征的αβt细胞类似，γδt细胞利用一组不同的体细胞重排的可变(v)、多样性(d)、连接(j)和恒定(c)基因，尽管与αβt细胞相比，γδt细胞含有较少v、d和j段。在一个实施方案中，由抗体(或其片段)结合的表位不包含在vδ1链的j区中存在的表位(例如，在人delta 1链种系中编码的四个j区之一：seq id no:131(j1*0)或132(j2*0)或133(j3*0)或134 (j4*0))。在一个实施方案中，由抗体(或其片段)结合的表位不包含在vδ1链的c区中
存在的表位(例如，seq id no:135(c1*0)，其包含c-末端近膜/跨膜区)。在一个实施方案中，由抗体(或其片段)结合的表位不包含在vδ1链的n-末端前导序列中存在的表位(例如，seq idno:129)。因此，抗体或片段可能仅在vδ1链的v区结合(例如seq id no:130)。因此，在一个实施方案中，表位由γδtcr的v区中的表位组成(例如，seq id no:1的氨基酸残基1-90)。
[0181]
表位参照luoma等人(2013)immunity 39:1032-1042,和rcsb protein data bank entries: 4mnh and 3omz中描述的序列来源的vδ1序列，示于seq id no：1： aqkvtqaqssvsmpvrkavtlnclyetswwsyyifwykqlpskemiflirqgsdeqna ksgrysvnfkkaaksvaltisalqledsakyfcalgesltradklifgkgtrvtvepni qnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksns avawsnksdfacanafnnsiipedtffpspess(seq id no:1)
[0182]
seq id no:1表示包含v区(也称为可变结构域)、d区、j区和tcr恒定区的可溶性tcr。 v区包含氨基酸残基1-90，d区包含氨基酸残基91-104，j区包含氨基酸残基105-115，恒定区包含氨基酸残基116-209。在v区内，cdr1定义为seq id no：1的氨基酸残基25-34， cdr2定义为seq id no：1的氨基酸残基50-54，cdr3定义为seq id no：1的氨基酸残基93-104(xu等人,pnas usa 108(6):2414-2419(2011))。
[0183]
因此，在一个实施方案中，分离的抗体或其片段结合γδt细胞受体(tcr)的可变delta 1(vδ1)链的表位，所述表位包含以下氨基酸区内的一个或多个氨基酸残基：
[0184]
(i)seq id no：1的3-20；和/或
[0185]
(ii)seq id no：1的37-77。
[0186]
在另一个实施方案中，抗体或其片段另外识别包含seq id no：128的氨基酸残基1-90 表位的多态性v区。因此，
[0187]
当定义本文所述的表位时，seq id no：1的氨基酸1-90和多态性种系变体序列(seq idno：128的氨基酸1-90)可以被认为是可互换的。本发明的抗体可以识别该种系序列的两种变体。举例来说，在指出如本文定义的抗体或其片段识别包含seq id no：1的氨基酸区1-24 和/或35-90内的一个或多个氨基酸残基的表位的情况下，这也指出了seq id no:128的相同区；特别是seq id no：128的氨基酸区1-24和/或35-90。
[0188]
在一个实施方案中，抗体或其片段识别seq id no：1的氨基酸区1-90内、以及seq idno：128的等效定位的氨基酸区1-90内的一个或多个氨基酸残基。更具体地，在一个实施方案中，本文定义的抗体或其片段识别人种系表位，其中所述种系在seq id no：1的第71位编码丙氨酸(a)或缬氨酸(v)。
[0189]
在一个实施方案中，表位包含在所述区内的一个或多个，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸残基。
[0190]
在进一步的实施方案中，表位包含seq id no：1的氨基酸区3-20内的一个或多个(例如 5个或更多个，例如10个或更多个)氨基酸残基。在进一步的实施方案中，表位包含seq id no： 1的氨基酸区37-77(如氨基酸区50-54)内的一个或多个(例如5个或更多个，例如10个或更多个)氨基酸残基。在又一个实施方案中，表位包含seq id no：1的氨基酸区3-20(例如5-20 或3-17)内的一个或多个(例如5个或更多个，例如10个或更多个)氨基酸残基，和seq id no：1的氨基酸区37-77(例如62-77或62-69)内的一个或多个(例如5个或更多个，例如10个或更多个)氨基酸残基。
[0191]
将进一步理解，所述抗体(或其片段)不需要结合限定范围内的所有氨基酸。这样的表位可以称为线性表位。例如，与包含seq id no：1的氨基酸区5-20内的氨基酸残基的表位结合的抗体，可以仅与所述范围内的一个或多个氨基酸残基结合，例如，与所述范围两端的氨基酸残基(即，氨基酸5和20)结合，任选地与所述范围内包括的氨基酸(即，氨基酸5、9、16和 20)结合。
[0192]
在一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、 20、37、42、50、53、59、62、64、68、69、72或77中的至少一个。在进一步的实施方案中，表位包含选自seq id no:1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、20、37、42、50、53、 59、62、64、68、69、72或77中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个氨基酸。
[0193]
在一个实施方案中，表位包含seq id no:1(或seq id no:128,如上所述)的以下氨基酸区内的一个或多个氨基酸残基：
[0194]
(i)3-17；
[0195]
(ii)5-20；
[0196]
(iii)37-53；
[0197]
(iv)50-64；
[0198]
(v)59-72；
[0199]
(vi)59-77；
[0200]
(vii)62-69；和/或
[0201]
(viii)62-77。
[0202]
在进一步的实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区：5-20和62-77；50-64；37-53 和59-72；59-77；或3-17和62-69内的一个或多个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，表位由seq id no:1的氨基酸区：5-20和62-77；50-64；37-53和59-72；59-77；或3-17和62-69 内的一个或多个氨基酸残基组成。
[0203]
在进一步的实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、 17、62、64、68和69，或适当地由seq id no:1的氨基酸残基3、5、9、10、12、16、17、 62、64、68和69组成。在进一步的实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸残基5、9、 16、20、62、64、72和77，或适当地由seq id no:1的氨基酸残基5、9、16、20、62、64、 72和77组成。在又一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸残基37、42、50、53、 59、64、68、69、72、73和77，或适当地由seq id no:1的氨基酸残基37、42、50、53、 59、64、68、69、72、73和77组成。在进一步的实施方案中，表位包含seq id no：1的氨基酸残基50、53、59、62和64，或适当地由seq id no：1的氨基酸残基50、53、59、62 和64组成。在进一步的实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸残基59、60、68和72，或适当地由seq id no:1的氨基酸残基59、60、68和72组成。
[0204]
在一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区5-20和/或62-77内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，表位由seq id no:1的氨基酸区5-20和62-77内的一个或多个氨基酸残基组成。在另一个替代的实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区5-20 或62-77内的一个或多个氨基酸残基。具有此类表位的抗体或其片段可具有1245_p01_e07的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可源自1245_p01_e07。例如，具有
1245_p01_e07 的一个或多个cdr序列或具有1245_p01_e07的vh和vl序列之一或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
[0205]
在一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区50-64内的一个或多个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，表位由seq id no:1的氨基酸区50-64内的一个或多个氨基酸残基组成。具有此类表位的抗体或其片段可具有1252_p01_c08的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可源自1252_p01_c08。例如，具有1252_p01_c08的一个或多个cdr序列或具有1252_p01_c08的vh和vl序列之一或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
[0206]
在一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区37-53和/或59-77内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，表位由seq id no:1的氨基酸区37-53和59-77内的一个或多个氨基酸残基组成。在另一个替代的实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区37-53或59-77内的一个或多个氨基酸残基。具有此类表位的抗体或其片段可具有 1245_p02_g04的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可源自1245_p02_g04。例如，具有1245_p02_g04的一个或多个cdr序列或具有1245_p02_g04的vh和vl序列之一或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
[0207]
在一个实施方案中，表位包含seq id no:1的氨基酸区59-72内的一个或多个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，表位由seq id no:1的氨基酸区59-72内的一个或多个氨基酸残基组成。具有此类表位的抗体或其片段可具有1251_p02_c05的一些或全部序列，或者此类抗体或其片段可源自1251_p02_c05。例如，具有1251_p02_c05的一个或多个cdr序列或具有1251_p02_c05的vh和vl序列之一或两者的抗体或其片段可以结合此类表位。
[0208]
在一个实施方案中，表位不包含seq id no:1的氨基酸区11-21内的氨基酸残基。在一个实施方案中，表位不包含seq id no:1的氨基酸区21-28内的氨基酸残基。在一个实施方案中，表位不包含seq id no:1的氨基酸区59和60内的氨基酸残基。在一个实施方案中，表位不包含seq id no:1的氨基酸区67-82内的氨基酸残基。
[0209]
在一个实施方案中，表位与市售抗vδ1抗体如ts-1或ts8.2所结合的表位不相同。如 wo2017197347中所述，当δ1链包括vδ1j1和vδ1j2序列但不包括vδ1j3链时，检测到 ts-1和ts8.2与可溶性tcr的结合，表明ts-1和ts8.2的结合涉及delta j1和delta j2区内的关键残基。
[0210]
本文提及的“在...内”包括所定义范围的端点。例如，“在氨基酸区5-20内”是指从残基5 至残基20的所有氨基酸残基，并且包括残基5和残基20。
[0211]
本领域已知各种技术来确定哪个表位被抗体结合。示例性技术包括，例如常规交叉阻断测定法、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析、肽切割分析晶体学研究和nmr分析。此外，还可以采用例如表位切除、表位提取和抗原化学修饰等方法。可用于鉴定多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换(如实施例9中所述)。一般而言，氢/ 氘交换方法包括氘标记感兴趣的蛋白，然后使抗体与氘标记的蛋白结合。接下来，蛋白/抗体复合物被转移到水中，受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子，以比不属于该界面部分的氨基酸内的可交换质子更慢的速率进行氘-氢反向交换。因此，形成蛋白/抗体界面部分的氨基酸可以保留氘，因此与不包括在界面中的氨基酸相比，其呈现相对较高的质量。抗体解离后，对靶标蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示对应于与抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记残基。
[0212]
抗体序列
[0213]
可以参考其cdr序列来描述分离的抗vδ1抗体或其片段。
[0214]
在一个实施方案中，抗vδ1抗体或其片段包含以下中的一者或多者：
[0215]
cdr3，其包含与seq id no：2-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列；
[0216]
cdr2，其包含与seq id no：26-37和序列a1-a12中任一者具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0217]
cdr1，其包含与seq id no：38-61中任一者具有至少80％序列同一性的序列。
[0218]
在一个实施方案中，分离的抗vδ1抗体或其片段包含cdr3，所述cdr3包含与seq idno：2-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含 cdr2，所述cdr2包含与seq id no：26-37和序列a1-a12(表2)中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr1，所述cdr1包含与seq idno：38-61中任一者具有至少80％序列同一性的序列。
[0219]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：2-25中任一者具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr2，所述cdr2包含与seq id no：26-37和序列:a1-a12(表2) 中任一者具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr1，所述cdr1包含与seq id no：38-61中任一者具有至少 85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
[0220]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：2-25中任一者具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr2，所述cdr2由与seq id no：26-37和序列:a1-a12(表2) 中任一者具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列组成。在一个实施方案中，抗体或其片段包含cdr1，所述cdr1由与seq id no：38-61中任一者具有至少 85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列组成。
[0221]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含与seq id no： 2-13中任一者共有至少80％序列同一性的cdr3序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3 包含与seq id no：14-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含由与seq id no：2-13中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成的cdr3，所述vl区包含由与seq id no：14-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成的cdr3。
[0222]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：2-13中任一者具有至少90％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-25中任一者具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含由与seq id no： 2-13中任一者具有至少90％序列同一性的序列组成的cdr3，所述vl区包含由与seq id no： 14-25中任一者具有至少90％序列同一性的序列组成的cdr3。
[0223]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：2-13中任一者具有至少95％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-25中任一者具有至少95％序列同一性的序列。在一个
实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含由与seq id no： 2-13中任一者具有至少95％序列同一性的序列组成的cdr3，所述vl区包含由与seq id no： 14-25中任一者具有至少95％序列同一性的序列组成的cdr3。
[0224]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含cdr3，所述 cdr3包含与seq id no：2-13中任一者具有至少80％序列同一性的序列，所述vl区包含 cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含由与seq id no：2-13 中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成的cdr3，所述vl区包含由与seq id no： 14-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成的cdr3。
[0225]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含cdr3，所述 cdr3包含与seq id no：2-7，特别是2-6，例如2、3或4中任一者具有至少80％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-19，特别是14-18，例如14、15或16中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：2-7，特别是2-6，例如2、3或4中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成，所述vl区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：14-19，特别是14-18，例如14、15或16中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成。
[0226]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：2-7，特别是2-6，例如2、3或4中任一者具有至少90％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-19，特别是14-18，例如14、15或16中任一者具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：2-7，特别是2-6，例如2、3或4中任一者具有至少90％序列同一性的序列组成，所述vl区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：14-19，特别是14-18，例如14、15或16中任一者具有至少90％序列同一性的序列组成。
[0227]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：2-7，特别是2-6，例如2、3或4中任一者具有至少95％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-19，特别是14-18，例如14、15或16中任一者具有至少95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：2-7，特别是2-6，例如2、3或4中任一者具有至少95％序列同一性的序列组成，所述vl区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：14-19，特别是14-18，例如14、15或16中任一者具有至少95％序列同一性的序列组成。
[0228]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：8-13，特别是8、9、10或11中任一者具有至少80％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：20-25，特别是20、21、 22或23中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含 vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：8-13，特别是8、 9、10或11中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成，所述vl区包含cdr3，所述cdr3 由与seq id no：20-25，特别是20、21、22或23中任一者具有至少80％序列同一性的序列组成。
[0229]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：8-13，特别是8、9、10或11中任一者具有至少90％序列同一性的序
列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：20-25，特别是20、21、 22或23中任一者具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含 vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：8-13，特别是8、 9、10或11中任一者具有至少90％序列同一性的序列组成，所述vl区包含cdr3，所述cdr3 由与seq id no：20-25，特别是20、21、22或23中任一者具有至少90％序列同一性的序列组成。
[0230]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：8-13，特别是8、9、10或11中任一者具有至少95％序列同一性的序列，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：20-25，特别是20、21、 22或23中任一者具有至少95％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含 vh区和/或vl区，所述vh区包含cdr3，所述cdr3由与seq id no：8-13，特别是8、 9、10或11中任一者具有至少95％序列同一性的序列组成，所述vl区包含cdr3，所述cdr3 由与seq id no：20-25，特别是20、21、22或23中任一者具有至少95％序列同一性的序列组成。
[0231]
本文提及“至少80％”或“80％或更高”的实施方案将被理解为包括等于或大于80％，例如 85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的所有值。在一个实施方案中，抗体或其片段包含与特定序列至少85％、例如至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
[0232]
作为百分比序列同一性的替代，实施方案也可以用一个或多个氨基酸改变来限定，例如一个或多个添加、取代和/或缺失。在一个实施方案中，序列可以包含多达五个氨基酸改变，例如多达三个氨基酸改变，特别是多达两个氨基酸改变。在进一步的实施方案中，序列可以包含多达五个氨基酸取代，例如多达三个氨基酸取代，特别是多达一个或两个氨基酸取代。例如，抗体或其片段的cdr3包含或更合适地由以下序列组成：所述序列与seq id no:2-25 中的任一者相比，具有不超过2个、更合适地不超过1个取代。
[0233]
合适地，任何与其在seq id no:2-61和序列a1-a12中相应的残基不同的cdr1、cdr2 或cdr3的残基是相对于其相应残基的保守取代。例如，任何与其在seq id no:2-25中相应的残基不同的cdr3的残基是相对于其相应残基的保守取代。
[0234]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含：
[0235]
(i)vh区，其包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：2-13中任一者具有至少80％序列同一性的序列；
[0236]
(ii)vh区，其包含cdr2，所述cdr2包含与seq id no：26-37中任一者具有至少80％序列同一性的序列；
[0237]
(iii)vh区，其包含cdr1，所述cdr1包含与seq id no：38-49中任一者具有至少80％序列同一性的序列；
[0238]
(iv)vl区，其包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no：14-25中任一者具有至少80％序列同一性的序列；
[0239]
(v)vl区，其包含cdr2，所述cdr2包含与序列a1-a12中任一者具有至少80％序列同一性的序列；和/或
[0240]
(vi)vl区，其包含cdr1，所述cdr1包含与seq id no：50-61中任一者具有至少80％序列同一性的序列。
[0241]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含重链，其具有：
的序列的cdr2和包含seq id no:42的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq idno：6的序列组成，cdr2由seq id no：30的序列组成，并且cdr1由seq id no：42 的序列组成。
[0256]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:8的序列的cdr3、包含seq id no:32 的序列的cdr2和包含seq id no:44的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq idno：8的序列组成，cdr2由seq id no：32的序列组成，并且cdr1由seq id no：44 的序列组成。
[0257]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:9的序列的cdr3、包含seq id no:33 的序列的cdr2和包含seq id no:45的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq idno：9的序列组成，cdr2由seq id no：33的序列组成，并且cdr1由seq id no：45 的序列组成。
[0258]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:10的序列的cdr3、包含seq id no:34 的序列的cdr2和包含seq id no:46的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq idno：10的序列组成，cdr2由seq id no：34的序列组成，并且cdr1由seq id no：46 的序列组成。
[0259]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:11的序列的cdr3、包含seq id no:35 的序列的cdr2和包含seq id no:47的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq idno：11的序列组成，cdr2由seq id no：35的序列组成，并且cdr1由seq id no：47 的序列组成。
[0260]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vl区(或由vl区组成)，所述vl区包含cdr3，所述cdr3包含与seq id no:14-25，例如seq id no:14、15、16、17或18，例如14、15、 16或17，特别是14、15或16中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vl区(或由vl区组成)，所述vl区包含cdr2，所述cdr2包含与序列 a1-a12(表2)，例如，序列a1、a2、a3、a4或a5，例如a1、a2、a3或a4，特别是a1、 a2或a3中任一者具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含 vl区(或由vl区组成)，所述vl区包含cdr1，所述cdr1包含与seq id no:50-61，例如seq id no:50、51、52、53或54，例如50、51、52或53，特别是50、51或52中任一者具有至少80％序列同一性的序列。
[0261]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:14的序列的cdr3、包含序列a1的序列的cdr2和包含seq id no:50的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 14的序列组成，cdr2由序列a1的序列组成，并且cdr1由seq id no：50的序列组成。
[0262]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:15的序列的cdr3、包含序列a2的序列的cdr2和包含seq id no:51的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 15的序列组成，cdr2由序列a2的序列组成，并且cdr1由seq id no：51的序列组成。
[0263]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:16的序列的cdr3、包含序列a3的序列的cdr2和包含seq id no:52的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 16的序列组成，cdr2由序列a3的序列组成，并且cdr1由seq id no：52的序列组成。
[0264]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:17的序列的cdr3、包含序列a4的序列的cdr2和包含seq id no:53的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 17的序列组成，cdr2由序列a4的序列组成，并且cdr1由seq id no：53的序列组成。
[0265]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:18的序列的cdr3、包含序列a5的序列的cdr2和包含seq id no:54的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no：18的序列组成，cdr2由序列a5的序列组成，并且cdr1由seq id no：54的序列组成。
[0266]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:20的序列的cdr3、包含序列a7的序列的cdr2和包含seq id no:56的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 20的序列组成，cdr2由序列a7的序列组成，并且cdr1由seq id no：56的序列组成。
[0267]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:21的序列的cdr3、包含序列a8的序列的cdr2和包含seq id no:57的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 21的序列组成，cdr2由序列a8的序列组成，并且cdr1由seq id no：57的序列组成。
[0268]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:22的序列的cdr3、包含序列a9的序列的cdr2和包含seq id no:58的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 22的序列组成，cdr2由序列a9的序列组成，并且cdr1由seq id no：58的序列组成。
[0269]
在一个实施方案中，vl区包含包含seq id no:23的序列的cdr3、包含序列a10的序列的cdr2和包含seq id no:59的序列的cdr1。在一个实施方案中，cdr3由seq id no： 23的序列组成，cdr2由序列a10的序列组成，并且cdr1由seq id no：59的序列组成。
[0270]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:2的序列的cdr3、包含seq id no:26 的序列的cdr2和包含seq id no:38的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:14 的序列的cdr3、包含序列a1的序列的cdr2和包含seq id no:50的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：2的序列组成，hcdr2由seq id no：26的序列组成，hcdr1由seq id no：38的序列组成，lcdr3由seq id no：14的序列组成，lcdr2 由序列a1的序列组成，并且lcdr1由seq id no：50的序列组成。
[0271]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:3的序列的cdr3、包含seq id no:27 的序列的cdr2，包含seq id no:39的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:15 的序列的cdr3、包含序列a2的序列的cdr2和包含seq id no:51的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：3的序列组成，hcdr2由seq id no：27的序列组成，hcdr1由seq id no：39的序列组成，lcdr3由seq id no：15的序列组成，lcdr2 由序列a2的序列组成，并且lcdr1由seq id no：51的序列组成。
[0272]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:4的序列的cdr3、包含seq id no:28 的序列的cdr2，包含seq id no:40的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:16 的序列的cdr3、包含序列a3的序列的cdr2和包含seq id no:52的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：4的序列组成，hcdr2由seq id no：28的序列组成，hcdr1由seq id no：40的序列组成，lcdr3由seq id no：16的序列组成，lcdr2 由序列a3的序列组成，并且lcdr1由seq id no：52的序列组成。
[0273]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:5的序列的cdr3、包含seq id no:29 的序列的cdr2，包含seq id no:41的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:17 的序列的cdr3、包含序列a4的序列的cdr2和包含seq id no:53的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：5的序列组成，hcdr2由seq id no：29的序列组成，hcdr1由seq id no：41的序列组成，lcdr3由seq id no：17的序列组成，lcdr2 由序列a4的序列组成，并且lcdr1由seq id no：53的序列组成。
[0274]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:6的序列的cdr3、包含seq id no:30 的序列的cdr2，包含seq id no:42的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:18 的序列的cdr3、包含序列a5的序列的cdr2和包含seq id no:54的序列的cdr1。在一个实施方案中，
hcdr3由seq id no：6的序列组成，hcdr2由seq id no：30的序列组成，hcdr1由seq id no：42的序列组成，lcdr3由seq id no：18的序列组成，lcdr2 由序列a5的序列组成，并且lcdr1由seq id no：54的序列组成。
[0275]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:7的序列的cdr3、包含seq id no:31 的序列的cdr2，包含seq id no:43的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:19 的序列的cdr3、包含序列a6的序列的cdr2和包含seq id no:55的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：7的序列组成，hcdr2由seq id no：31的序列组成，hcdr1由seq id no：43的序列组成，lcdr3由seq id no：19的序列组成，lcdr2 由序列a6的序列组成，并且lcdr1由seq id no：55的序列组成。
[0276]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:8的序列的cdr3、包含seq id no:32 的序列的cdr2，包含seq id no:44的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:20 的序列的cdr3、包含序列a7的序列的cdr2和包含seq id no:56的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：8的序列组成，hcdr2由seq id no：32的序列组成，hcdr1由seq id no：44的序列组成，lcdr3由seq id no：20的序列组成，lcdr2 由序列a7的序列组成，并且lcdr1由seq id no：56的序列组成。
[0277]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:9的序列的cdr3、包含seq id no:33 的序列的cdr2，包含seq id no:45的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:21 的序列的cdr3、包含序列a8的序列的cdr2和包含seq id no:57的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：9的序列组成，hcdr2由seq id no：33的序列组成，hcdr1由seq id no：45的序列组成，lcdr3由seq id no：21的序列组成，lcdr2 由序列a8的序列组成，并且lcdr1由seq id no：57的序列组成。
[0278]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:10的序列的cdr3、包含seq id no:34 的序列的cdr2，包含seq id no:46的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:22 的序列的cdr3、包含序列a9的序列的cdr2和包含seq id no:58的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：10的序列组成，hcdr2由seq id no：34的序列组成，hcdr1由seq id no：46的序列组成，lcdr3由seq id no：22的序列组成，lcdr2 由序列a9的序列组成，并且lcdr1由seq id no：58的序列组成。
[0279]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:11的序列的cdr3、包含seq id no:35 的序列的cdr2，包含seq id no:47的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:23 的序列的cdr3、包含序列a10的序列的cdr2和包含seq id no:59的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：11的序列组成，hcdr2由seq id no：35的序列组成，hcdr1由seq id no：47的序列组成，lcdr3由seq id no：23的序列组成，lcdr2由序列a10的序列组成，并且lcdr1由seq id no：59的序列组成。
[0280]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:12的序列的cdr3、包含seq id no:36 的序列的cdr2，包含seq id no:48的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:24 的序列的cdr3、包含序列a11的序列的cdr2和包含seq id no:60的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：12的序列组成，hcdr2由seq id no：36的序列组成，hcdr1由seq id no：48的序列组成，lcdr3由seq id no：24的序列组成， lcdr2由序列a11的序列组成，并且lcdr1由seq id no：60的序列组成。
[0281]
在一个实施方案中，vh区包含包含seq id no:13的序列的cdr3、包含seq id no:37 的序列的cdr2，包含seq id no:49的序列的cdr1，并且vl区包含包含seq id no:25 的序列的cdr3、包含序列a12的序列的cdr2和包含seq id no:61的序列的cdr1。在一个实施方案中，hcdr3由seq id no：13的序列组成，hcdr2由seq id no：37的序列组成，hcdr1由seq id no：49的序列组成，lcdr3由seq id no：25的序列组成， lcdr2由序列a12的序列组成，并且lcdr1由seq id no：61的序列组成。
[0282]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个如表2中所描述的cdr序列。在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆 1252_p01_c08的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1245_p01_e07的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1245_p02_g04的cdr序列。在一个替代的实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆 1245_p02_b07的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1251_p02_c05的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1139_p01_e04的cdr序列。在一个替代的实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆 1245_p02_f07的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1245_p01_g06的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1245_p01_g09的cdr序列。在一个替代的实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆 1138_p01_b09的cdr序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含一个或多个(例如全部)如表2中所描述的克隆1251_p02_g10的cdr序列。
[0283]
合适地，上述vh和vl区各自包含四个框架区(fr1-fr4)。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，fr1、fr2、fr3和/或fr4)，所述框架区包含与seq id no：62-85 中任一者的框架区具有至少80％序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，fr1、fr2、fr3和/或fr4)，所述框架区包含与seq id no：62-85中任一者的框架区具有至少90％，例如至少95％、97％、或99％的序列同一性的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，fr1、fr2、fr3和/或fr4)，所述框架区包含seq idno：62-85中任一者的序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含框架区(例如，fr1、fr2、fr3和/或fr4)，所述框架区由seq id no：62-85中任一者的序列组成。
[0284]
本文所述的抗体可以由其完整的轻链和/或重链可变序列来定义。在一个实施方案中，抗体或其片段包含与seq id no：62-85中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段由与seq id no：62-85中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
[0285]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含与seq id no：62-73 中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh 区，所述vh区由与seq id no：62-73中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，vh区包含与seq id no：62、63、64、65或66，例如62、63、 64或65，特别是62、63或64中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方
案中，vh区由与seq id no：62、63、64、65或66，例如62、63、64或65，特别是62、63或64中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，vh区包含与seq id no：68、69、70、71、72或73，例如68、69、70或71中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，vh区由与seq id no： 68、69、70、71、72或73，例如68、69、70或71中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
[0286]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区包含与seq id no：74-85中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段包含vl 区，所述vl区由与seq id no：74-85中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，vl区包含与seq id no：74、75、76、77或78，例如74、75、 76或77，特别是74、75或76中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，vl区由与seq id no：74、75、76、77或78，例如74、75、76或77，特别是74、75或76中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，vl区包含与seq id no：80、81、82、83、84或85，例如80、81、82或83中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，vl区由与seq id no： 80、81、82、83、84或85，例如80、81、82或83中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
[0287]
在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含与seq id no： 62-73中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且所述vl区包含与seq id no： 74-85中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区由与seq id no：62-73中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成，并且所述vl区由与seq id no：74-85中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。
[0288]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含seq id no： 63(1252_p01_c08)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述 vh区包含seq id no：62(1245_p01_e07)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含seq id no：64(1245_p02_g04)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含seq id no：68(1139_p01_e04) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含seq idno：69(1245_p02_f07)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含seq id no：70(1245_p01_g06)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区包含seq id no：71(1245_p01_g09)的氨基酸序列。
[0289]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区由seq id no： 63(1252_p01_c08)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区由seq id no：62(1245_p01_e07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区由seq id no：64(1245_p02_g04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区由seq id no：68 (1139_p01_e04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述 vh区由seq id no：69(1245_p02_f07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区由seq id no：70(1245_p01_g06)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区，所述vh区由seq id no：71(1245_p01_g09) 的氨基酸序列组成。
[0290]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区包含seq id no：75 (1252_p01_c08)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl 区包含seq id no：74(1245_p01_e07)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区包含seq id no：76(1245_p02_g04)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区包含seq id no：80(1139_p01_e04)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区包含seq id no： 81(1245_p02_f07)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述 vl区包含seq id no：82(1245_p01_g06)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区包含seq id no：83(1245_p01_g09)的氨基酸序列。
[0291]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区由seq id no：75 (1252_p01_c08)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述 vl区由seq id no：74(1245_p01_e07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区由seq id no：76(1245_p02_g04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区由seq id no：80(1139_p01_e04) 的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区由seq idno：81(1245_p02_f07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl 区，所述vl区由seq id no：82(1245_p01_g06)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vl区，所述vl区由seq id no：83(1245_p01_g09)的氨基酸序列组成。
[0292]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含seq id no：63(1252_p01_c08)的氨基酸序列，并且所述vl区包含seq id no：75(1252_p01_c08)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含seqid no：62(1245_p01_e07)的氨基酸序列，并且所述vl区包含seq id no：74(1245_p01_e07) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含 seq id no：64(1245_p02_g04)的氨基酸序列，并且所述vl区包含seq id no：76 (1245_p02_g04)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含seq id no：68(1139_p01_e04)的氨基酸序列，并且所述vl区包含seq idno：80(1139_p01_e04)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和 vl区，所述vh区包含seq id no：69(1245_p02_f07)的氨基酸序列，并且所述vl区包含 seq id no：81(1245_p02_f07)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含 vh区和vl区，所述vh区包含seq id no：70(1245_p01_g06)的氨基酸序列，并且所述 vl区包含seq id no：82(1245_p01_g06)的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区包含seq id no：71(1245_p01_g06)的氨基酸序列，并且所述vl区包含seq id no：83(1245_p01_g09)的氨基酸序列。
[0293]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区由seq id no：63 (1252_p01_c08)的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seq id no：75(1252_p01_c08)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区由 seq id no：62(1245_p01_e07)的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seq id no：74 (1245_p01_e07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl 区，所述vh区由seq id no：64(1245_p02_g04)的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seqid no：76(1245_
p02_g04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含 vh区和vl区，所述vh区由seq id no：68(1139_p01_e04)的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seq id no：80(1139_p01_e04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区由seq id no：69(1245_p02_f07)的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seq id no：81(1245_p02_f07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区由seq id no：70(1245_p01_g06) 的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seq id no：82(1245_p01_g06)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含vh区和vl区，所述vh区由seq id no：71 (1245_p01_g09)的氨基酸序列组成，并且所述vl区由seq id no：83(1245_p01_g09)的氨基酸序列组成。
[0294]
对于即包含vh区又包含vl区的片段，这些区可以共价结合(例如，通过二硫键或接头) 或非共价键结合。本文所述的抗体片段可包含scfv，即，包含通过接头连接的vh区和vl 区的片段。在一个实施方案中，vh和vl区通过(例如合成的)多肽接头连接。多肽接头可以包含(gly4ser)n接头，其中n＝1至8，例如，2、3、4、5或7。多肽接头可以包含 [(gly4ser)n(gly3alaser)m]
p
接头，其中n＝1至8，例如，2、3、4、5或7，m＝1至8，例如， 0、1、2或3，p＝1至8，例如，1、2或3。在进一步的实施方案中，接头包含seq id no:98。在进一步的实施方案中，接头由seq id no:98组成。
[0295]
在一个实施方案中，抗体或其片段包含与seq id no：86-97中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：86-97中任一者的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：87(1252_p01_c08) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：86(1245_p01_e07) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：88(1245_p02_g04) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：92(1139_p01_e04) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：93(1245_p02_f07) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：94(1245_p01_g06) 的氨基酸序列。在一个替代实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：95(1245_p01_g09) 的氨基酸序列。
[0296]
在一个实施方案中，抗体或其片段由与seq id no：86-97中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，抗体或其片段由seq id no：86-97中任一者的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由seq id no:87 (1252_p01_c08)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段由seq id no： 86(1245_p01_e07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段由seq id no： 88(1245_p02_g04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段由seq id no： 92(1139_p01_e04)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段由seq id no： 93(1245_p02_f07)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段由seq id no： 94(1245_p01_g06)的氨基酸序列组成。在一个替代实施方案中，抗体或其片段由seq id no： 95(1245_p01_g09)的氨基酸序列组成。
[0297]
本领域技术人员将理解，可以设计和制备包括n-末端和c-末端修饰的scfv构建体，以辅助翻译、纯化和检测。例如，在scfv序列的n-末端，可以在规范vh序列(例如起始qvq 或evq)之前另外包括甲硫氨酸和/或丙氨酸的氨基酸残基。在c-末端(即，根据imgt定义的
规范vl结构域序列结束的c-末端)，可以另外包括序列，如(i)恒定结构域的部分序列和/或(ii) 包括标签的另外的合成序列，例如his-tag和flag-tag，以辅助纯化和检测。在一个实施方案中，将seq id no：124添加到seq id no：86、88-90、92-97中任一者的c-末端。在一个实施方案中，将seq id no：125添加到seq id no：86、88-90、92-97中任一者的c-末端。在一个实施方案中，将seq id no：126添加到seq id no：87或91中任一者的c-末端。在一个实施方案中，将seq id no：127添加到seq id no：87或91中任一者的c-末端。众所周知，如果采用替代的scfv设计、翻译、纯化或检测策略，则所述scfv n-或c-末端序列是可选的并且可以被去除、修饰或取代。
[0298]
如本文所述，抗体可以是任何格式(format)。在一个优选的实施方案中，抗体是igg1格式。因此，在一个实施方案中，抗体或其片段包含与seq id no：111-122中任一者具有至少 80％序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含seq id no： 111-122中任一者的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：111-116，例如seq id no:111-113和116的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：117-122，例如seq id no:117-120的氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗体或其片段包含seq id no：111、112、116-120，例如seq id no:111、112或116, 或seq id no:117-120的氨基酸序列。
[0299]
在一个实施方案中，抗体或其片段由与seq id no：111-122中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，抗体或其片段由seq id no：111-122 中任一者的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由seq id no:111-116，例如seq id no:111-113和116的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由seq id no:117-122，例如seq id no:117-120的氨基酸序列组成。在又一个实施方案中，抗体或其片段由seq id no:111、112、116-120，例如seq id no:111、112或116，或seqid no:117-120的氨基酸序列组成。
[0300]
在一个实施方案中，抗体与本文定义的抗体或其片段结合或竞争相同或基本相同的表位。可以通过使用本领域已知的常规方法容易地确定抗体是否与参考抗vδ1抗体结合或竞争结合相同的表位。例如，为了确定测试抗体是否与参考抗vδ1抗体结合相同的表位，使参考抗体在饱和条件下与vδ1蛋白或肽结合。接下来，评估测试抗体与vδ1链结合的能力。如果测试抗体在vδ1与参考抗vδ1抗体饱和结合后能够与vδ1结合，则可以得出结论：测试抗体与参考抗vδ1抗体结合不同的表位。另一方面，如果测试抗体在vδ1链与参考抗vδ1抗体饱和结合后不能与vδ1链结合，则测试抗体可能结合与参考抗vδ1抗体所结合的表位相同的表位。
[0301]
本发明还包括与本文定义的抗体或其片段、或具有本文所述的任何示例性抗体的cdr序列的抗体竞争结合vδ1的抗vδ1抗体。例如，可以用抗体进行竞争性测定法，以确定哪些蛋白、抗体和其他拮抗剂与抗体竞争结合vδ1链和/或共享表位。这些测定法是本领域技术人员公知的；他们评估拮抗剂或配体之间对蛋白(例如,vδ1)上有限数量的结合位点的竞争。抗体(或其片段)在竞争之前或之后被固定或是不溶的，并且将与vδ1链结合的样品与未结合的样品分离，例如，通过倾析(抗体在之前是不溶的情况)或离心(在竞争反应后抗体被沉淀的情况)。此外，可以通过功能是否被抗体与蛋白的结合或不结合而改变来确定竞争性结合，例如，通过抗体分子是否抑制或增强例如标记的酶活性来确定。如本领域已知和本文
所述的，可以使用 elisa和其他功能测定法。
[0302]
如果两个抗体中的每一个竞争性地抑制(阻断)另一个与靶抗原的结合，则两个抗体结合相同或重叠的表位。即，如在竞争性结合测定法中所测量的，1、5、10、20或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合至少50％，但优选75％、90％或甚至99％。或者，如果靶抗原中降低或消除一种抗体结合的基本上所有氨基酸突变都降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。
[0303]
然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认观察到的测试抗体的结合缺失是否确实是由于与参考抗体结合相同的表位，或者是否是由于空间阻断(或其他现象) 造成观察到的结合缺失。可以使用elisa、ria、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定法来进行此类实验。
[0304]
在一些实施方案中，通过改变与asn 297(kabat编号方案)连接的糖，使抗体或其片段包含修饰的效应子功能。在进一步的所述修饰中，asn 297未被岩藻糖基化或表现出降低的岩藻糖基化(即，去岩藻糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体)。岩藻糖基化包括将岩藻糖添加到分子中，例如，将岩藻糖连接到n-聚糖、o-聚糖和糖脂。因此，在去岩藻糖基化抗体中，岩藻糖不连接到恒定区的碳水化合物链上。可以修饰抗体以防止或抑制抗体的岩藻糖基化。通常，糖基化修饰包括通过靶向工程化或通过靶向或偶然宿主或克隆选择，在宿主细胞中表达所述抗体或其片段，所述宿主细胞具有交替的糖基化加工能力。这些和其他效应子修饰在最近的综述中进一步讨论，例如xinhua wang等人(2018)protein&cell 9:63-73和pereira等人(2018) mabs 10(5):693-711，其并入本文。
[0305]
抗体序列修饰
[0306]
可以使用已知方法修饰抗体及其片段。本领域技术人员可以容易地并入本文所述的抗体分子的序列修饰。以下示例是非限制性的。
[0307]
在从噬菌体文库中发现抗体和回收序列期间，可以通过亚克隆将所需的抗体可变结构域重新格式化到全长igg中。为了加速这一过程，通常使用限制性内切酶转移可变结构域。这些独特的限制性位点可以引入另外的/替代的氨基酸，并偏离规范序列(例如，可以在国际 immunogenetics[imgt]信息系统中找到此类规范序列，参见http://www.imgt.org)。这些可以作为kappa或lambda轻链序列修饰引入。
[0308]
kappa轻链修饰
[0309]
在重新形式化为全长igg期间，可以使用限制性位点(例如，nhe1-not1)克隆可变kappa 轻链可变序列。更具体地，在kappa轻链n-末端引入另外的ala-ser序列以支持克隆。优选地，然后在进一步开发期间去除该另外的as序列，以产生规范的n-末端序列。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有kappa轻链的抗体在其n-末端不含有as序列,即，seq idno:74、76-78和80-85不包括初始as序列。在进一步的实施方案中，seq id no：74和76-78 不包括初始as序列。应当理解，本实施方案也适用于本文包括的包含该序列的其他序列(例如，seq id no:86、88-90和92-97)。
[0310]
可以进行另外的氨基酸改变以支持克隆。例如，对于本文所述的抗体，在kappa轻链可变结构域/恒定结构域边界引入了缬氨酸到丙氨酸的变化，以支持克隆。这导致了kappa恒定结构域的修饰。具体来说，这导致恒定结构域开始的rtaaaps(来自noti限制性位点)。优选地，可以在进一步开发过程中修饰该序列，以产生以rtvaaps开始的规范kappa轻
链恒定区。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有kappa轻链的抗体含有以序列rtv开始的恒定结构域。因此，在一个实施方案中，seq id no:111-114和117-122的序列rtaaaps 被序列rtvaaps替换。
[0311]
lambda轻链修饰
[0312]
与上面的kappa示例类似，lambda轻链可变结构域也可以通过在重新格式化为全长igg 期间引入限制性位点(例如，nhe1-not1)来克隆。更具体地，在lambda轻链n-末端，可以引入另外的ala-ser序列以支持克隆。优选地，然后在进一步开发期间去除该另外的as序列，以产生规范的n-末端序列。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有lambda轻链的抗体在其n-末端不含有as序列,即，seq id no:75和79不包括初始as序列。应当理解，本实施方案也适用于本文包括的包含该序列的其他序列(例如，seq id no:87、91、115和116)。在一个实施方案中，seq id no:75不包含初始的六个残基，即，assyel序列被去除。
[0313]
作为另一个示例，对于本文所述的抗体，在lambda轻链可变结构域/恒定结构域边界引入了赖氨酸到丙氨酸的变化，以支持克隆。这导致了lambda恒定结构域的修饰。具体来说，这导致恒定结构域开始的gqpaaaps(来自noti限制性位点)。优选地，可以在进一步开发过程中修饰该序列，以产生以gqpkaaps开始的规范lambda轻链恒定区。因此，在一个实施方案中，本文所述的含有lambda轻链的抗体含有以序列gqpk开始的恒定结构域。因此，在一个实施方案中，seq id no:115或116的序列gqpaaaps被序列gqpkaaps替换。
[0314]
重链修饰
[0315]
通常，人可变重链序列以碱性谷氨酰胺(q)或酸性谷氨酸(e)开始。然而，已知这两种序列都转化为酸性氨基酸残基，焦谷氨酸(pe)。q到pe的转化导致抗体的电荷改变，而e到pe 的转化不改变抗体的电荷。因此，为了避免随时间变化的电荷改变，一种选择是首先将起始重链序列从q修饰为e。因此，在一个实施方案中，本文所述的抗体重链在n-末端含有q到 e的修饰。具体而言，seq id no:62、64和/或67-71的初始残基可以从q修饰为e。应当理解，本实施方案也适用于本文包括的包含该序列的其他序列(例如，seq id no:86、88、91-97 和111、112、115、117-120)。
[0316]
此外，igg1恒定结构域的c-末端以pgk结束。然而，末端碱性赖氨酸(k)通常在表达过程中被切割(例如，在cho细胞中)。这反过来通过c-末端赖氨酸残基的不同损失导致抗体的电荷改变。因此，一种选择是首先去除赖氨酸，从而产生统一且一致的以pg结束的重链c
‑ꢀ
末端序列。因此，在一个实施方案中，本文所述抗体的重链具有从其c-末端去除的末端k。特别地，本发明的抗体可以包含seq id no：111-122中的任一个，其中末端赖氨酸残基已被去除。
[0317]
可选的同种异型修饰
[0318]
在抗体发现期间，可以使用特定的人同种异型。任选地，可以在开发过程中将抗体转换为不同的人同种异型。作为非限制性示例，对于kappa链，存在三种人同种异型，称为km1、 km1,2和km3，其定义了三个km等位基因(使用同种异型编号)：km1与缬氨酸153(imgtv45.1)和亮氨酸191(imgt l101)相关；km1,2与丙氨酸153(imgt a45.1)和亮氨酸 191(imgt l101)相关；和km3与丙氨酸153(imgt a45.1)和缬氨酸191(imgt v101)相关。可选地，因此可以通过标准克隆方法将序列从一种同种异型修饰为另一种同种异型。例如， l191v(imgt l101v)改变将km1,2同种异型转换为km3同种异型。有关此类同种异型的进一
步参考，参见jefferis and lefranc(2009)mabs 1(4):332-8，其通过引用并入本文。
[0319]
因此，在一个实施方案中，本文所述的抗体含有源自相同基因的另一种人同种异型的氨基酸取代。在进一步的实施方案中，抗体含有kappa链的l191v(imgt l101v)取代，以将 c-结构域从km1,2转化为km3同种异型。
[0320]
抗体结合
[0321]
如通过表面等离子共振所测量的，抗体或其片段可以小于1.5x10-7
m(即，150nm)的结合亲和力(kd)结合γδtcr的vδ1链。在一个优选实施方案中，kd小于1.5x10-7
m(即，150nm)。在另一个实施方案中，kd为1.3x10-7
m(即，130nm)或更小，例如1.0x10-7
m(即，100nm) 或更小。在又一个实施方案中，kd小于5.0x10-8
m(即，50nm)，例如小于4.0x10-8
m(即， 40nm)，小于3.0x10-8
m(即，30nm)或小于2.0x10-8
m(即，20nm)。例如，根据一个方面，提供了一种人抗vδ1抗体，如通过表面等离子共振所测量的，其以小于1.5x10-7
m(即，150nm) 的结合亲和力(kd)结合γδtcr的vδ1链。
[0322]
在一个实施方案中，如通过表面等离子共振所测量的，抗体或其片段以小于4.0x10-8
m(即， 40nm)、小于3.0x10-8
m(即，30nm)或小于2.0x10-8
m(即，20nm)的结合亲和力(kd)结合γδ tcr的vδ1链。
[0323]
在一个实施方案中，抗体或其片段的结合亲和力是通过直接地或间接地(例如，通过用抗人igg fc捕获)将抗体或其片段包被到传感器表面(例如，胺高容量芯片或等效物)来建立的，其中被抗体或其片段结合的靶(即，γδtcr的vδ1链)流经芯片以检测结合。适当地，在25℃下在pbs 0.02％tween20运行缓冲液中以30μl/min使用mass-2仪器(也可称为sierraspr-32)。
[0324]
本文描述了可用于定义抗体功能的其他测定法。例如，可以通过γδtcr接合，例如测量抗体结合后γδtcr的下调来评估本文所述的抗体或其片段。例如，可以通过流式细胞术测量应用抗体或其片段(任选地存在于细胞表面上)后的γδtcr的表面表达。也可以通过测量γδt 细胞脱粒来评估本文所述的抗体或其片段。例如，可以通过流式细胞术测量向γδt细胞应用抗体或其片段(任选地存在于细胞表面上)后，细胞脱粒标记物cd107a的表达。还可以通过测量γδt细胞杀伤活性(以测试抗体是否对γδt细胞的杀伤活性有影响)来评估本文所述的抗体或其片段。例如，可以在抗体或其片段存在下(任选地存在于细胞表面上)孵育靶细胞与γδt 细胞。孵育后，可以用细胞活力染料对培养物进行染色，以区分活的靶细胞和死的靶细胞。然后，例如，可以通过流式细胞术测量死细胞的比例。
[0325]
如本文所述，用于测定法中的抗体或其片段可以存在于表面上，例如细胞表面，例如包含fc受体的细胞的表面。例如，抗体或其片段可以存在于thp-1细胞，例如tib-202
tm
细胞 (可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得)的表面。或者，抗体或其片段可直接用于测定法中。
[0326]
在此类功能测定法中，可以通过计算半数最大浓度来测量输出，也称为“ec50”或“50％的有效浓度”。术语“ic50”是指抑制浓度。ec50和ic50都可以使用本领域已知的方法测量，例如流式细胞术方法。为避免疑义，本技术中的ec50值是使用igg1格式的抗体提供的。这些值可以很容易地根据抗体形式的分子量转换为等效值，如下所示：
[0327]
(μg/ml)/(以kda计的mw)＝μm
[0328]
抗体(或片段)结合后，γδtcr下调的ec50可以小于0.50μg/ml，例如小于0.40μg/
ml、0.30μg/ml、0.20μg/ml、0.15μg/ml、0.10μg/ml或0.05μg/ml。在一个优选的实施方案中，在抗体(或片段)结合后，γδtcr下调的ec50小于0.10μg/ml。特别地，在抗体(或片段)结合后，γδtcr下调的ec50可以小于0.06μg/ml，例如小于0.05μg/ml、0.04μg/ml或0.03μg/ml。特别地，所述ec50值是当抗体以igg1格式测量时。例如，可以使用流式细胞术测量ec50γδtcr下调值(例如，如实施例6的测定法中所述)。
[0329]
抗体(或片段)结合后，γδt细胞脱粒的ec50可以小于0.050μg/ml，例如小于0.040μg/ml、0.030μg/ml、0.020μg/ml、0.015μg/ml、0.010μg/ml或0.008μg/ml。特别地，抗体(或片段)结合后，γδt细胞脱粒的ec50可以小于0.005μg/ml，例如小于0.002μg/ml。在一个优选的实施方案中，抗体(或片段)结合后，γδt细胞脱粒的ec50小于0.007μg/ml。特别地，所述ec50值是当抗体以igg1格式测量时。例如，可以使用流式细胞术(例如，如实施例7的测定法中所述)通过检测cd107a表达(即，细胞脱粒的标志物)来测量γδt细胞脱粒的ec50值。在一个实施方案中，使用抗cd107a抗体测量cd107a表达，例如使用抗人cd107abv421(克隆h4a3)(bdbiosciences)。
[0330]
抗体(或片段)结合后，γδt细胞杀伤的ec50可以小于0.50μg/ml，例如小于0.40μg/ml、0.30μg/ml、0.20μg/ml、0.15μg/ml、0.10μg/ml或0.07μg/ml。在一个优选的实施方案中，抗体(或片段)结合后，γδt细胞杀伤的ec50小于0.10μg/ml。特别地，在抗体(或片段)结合后，γδt细胞杀伤的ec50可以小于0.060μg/ml，例如小于0.055μg/ml，特别是小于0.020μg/ml或0.010μg/ml。特别地，所述ec50值是当抗体以igg1形式测量时。例如，可以在孵育抗体、γδt细胞和靶细胞后，通过使用流式细胞术检测死细胞的比例(即，使用细胞活力染料)来测量ec50γδt细胞杀伤值(例如，如实施例8的测定法中所述)。在一个实施方案中，测量靶细胞死亡所使用的细胞活力染料是viabilitydyeefluor
tm
520(thermofisher)。
[0331]
在这些方面描述的测定法中，抗体或其片段可以存在于细胞的表面，例如存在于thp-1细胞，例如tib-202
tm
(atcc)的表面。thp-1细胞可选地用染料标记，例如用celltracker
tm
orangecmtmr(thermofisher)标记。
[0332]
可以使用例如greenandsambrook,molecularcloning:alaboratorymanual(2012)第4版coldspringharbourlaboratorypress中公开的技术获得和操作抗体(或片段)。
[0333]
可以使用通过将产生特定抗体的b细胞与骨髓瘤(b细胞癌)细胞融合的杂交瘤技术来产生单克隆抗体，所选择的骨髓瘤具有在组织培养中生长的能力，并且不存在抗体链的合成。
[0334]
例如，可以通过以下方式获得针对确定抗原的单克隆抗体：
[0335]
a)使用永生细胞，优选使用骨髓瘤细胞，使从先前用确定的抗原免疫的动物的外周血中获得的淋巴细胞永生化，以形成杂交瘤，
[0336]
b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)，回收产生具有所需特异性的抗体的细胞。
[0337]
或者，不需要使用杂交瘤细胞。可以通过常规实践，例如使用本领域已知的噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术，从合适的抗体文库中分离能够结合如本文所述的靶抗原的抗体。因此，单克隆抗体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：
[0338]
a)将从动物(适当地先前用确定的抗原免疫)的淋巴细胞，尤其是外周血淋巴细胞中获得的dna或cdna序列克隆入载体，尤其是噬菌体，更特别是丝状噬菌体，
[0339]
b)在允许产生抗体的条件下用上述载体转化原核细胞，
[0340]
c)通过对抗体进行抗原亲和力选择来选择抗体，
[0341]
d)回收具有所需特异性的抗体。
[0342]
药物组合物
[0343]
根据本发明的另一方面，提供了包含通过如本文限定的方法获得的vδ1t细胞群的组合物。在一个实施方案中，vδ1t细胞群是扩增的vδ1t细胞群。在这样的实施方案中，组合物可以包含细胞，任选地与其他赋形剂组合。还包括的是组合物，其包含一种或多种另外的活性剂(例如，适用于治疗本文提及的疾病的活性剂)。
[0344]
药物组合物可以包含如本文所述的vδ1t细胞，特别是扩增的vδ1t细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如,氢氧化铝)；和防腐剂。可用于本发明药物组合物的低温保存溶液包括例如dmso。例如，可以将组合物配制成用于静脉内施用。
[0345]
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含，例如，没有可检测水平的污染物，例如内毒素或支原体。
[0346]
优选的施用模式是肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、鞘内)。在一个优选的实施方案中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在另一个优选的实施方案中，组合物通过肌肉内或皮下注射施用。
[0347]
将本发明的药物组合物作为通常用于治疗此类疾病的其他既定疗法的辅助或结合，用于治疗本文所述疾病的治疗方法中，在本发明的范围内。
[0348]
在本发明的另一方面，细胞群、组合物或药物组合物与至少一种活性剂序贯地、同时或分开施用。
[0349]
使用细胞群的治疗方法
[0350]
根据本发明的另一方面，提供了通过本文定义的方法获得的细胞群用作药物。根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的扩增细胞群用作药物。本文提及细胞群“用”作药物或用于治疗仅限于将细胞群施用于受试者。此类用途不包括将抗体或其片段直接施用于患者，即，其中所述抗体被用作治疗剂。
[0351]
在一个实施方案中，细胞群用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病。在进一步的实施方案中，细胞群用于治疗癌症。
[0352]
在一个实施方案中，用作药物的细胞群包含超过50％的vδ1t细胞，例如超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过95％或超过99％的vδ1t细胞。在另一个实施方案中，用作药物的细胞群由vδ1t细胞组成。
[0353]
在一个实施方案中，用作药物的细胞群包含少于10％的αβt细胞，例如少于8％、少于 7％、少于6％、少于5％、少于4％或少于3％的αβt细胞。在一个实施方案中，用作药物的细胞群包含少于10％的vδ2t细胞，例如少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％或少于3％的vδ2t细胞。在一个实施方案中，用作药物的细胞群包含少于50％的nk细胞，例如少于40％、少于30％、少于20％、少于10％或少于5％的nk细胞。在一个实施方案中，存在于用作药物的细胞群中的少于50％的细胞表达cd56，例如少于40％、少于30％、少于 20％、少于
10％或少于5％的细胞表达cd56。
[0354]
根据本发明的另一方面，提供了药物组合物用作药物，所述药物组合物包含如本文所限定的细胞群。在一个实施方案中，包含细胞群的药物组合物用于治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病。在进一步的实施方案中，包含细胞群的药物组合物用于治疗癌症。
[0355]
根据本发明的另一方面，提供了一种在有需要的受试者中调节免疫应答的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文限定的细胞群。
[0356]
根据本发明的另一方面，提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文限定的细胞群。或者，施用治疗有效量的包含细胞群的药物组合物。
[0357]
根据本发明的其他方面，提供了本文定义的细胞群在制备药物中的用途，例如治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的药物。
[0358]
过继性t细胞疗法
[0359]
通过本发明的扩增方法获得的γδt细胞可以用作药物，例如用作用于过继性t细胞疗法的药物。这涉及将γδt细胞转移到患者体内。治疗可以是自体的，即，γδt细胞可以被转移回它们被获自的同一患者体内，或者治疗可以是同种异体的，即，来自一个人的γδt细胞可以转移到不同的患者体内。在涉及同种异体转移的情况下，γδt细胞可以基本上不含αβt细胞。例如，在扩增后，使用本领域已知的任何合适的方法(例如，通过阴性选择，例如，使用磁珠)，可以从γδt细胞群中耗尽αβt细胞。一种处理方法可包括：提供从供体个体获得的样品(例如，非造血组织样品)；如本文所述培养从样品中获得的γδt细胞，例如，以产生扩增的群；以及将γδt细胞群施用于受体个体。
[0360]
待治疗的患者或受试者优选是人癌症患者(例如，正在接受实体瘤治疗的人癌症患者)或病毒感染患者(例如，cmv感染或hiv感染患者)。在某些情况下，患者已经和/或正在接受实体瘤治疗。因为vδ1t通常驻留于非造血组织中，相比于其全身血液驻留的对应物，组织驻留的vδ1t也更有可能归巢并保留在肿瘤块内，并且这些细胞的过继转移可能更有效地靶向实体瘤和潜在的其他非造血组织相关的免疫病理学。
[0361]
由于γδt细胞是非mhc限制性的，其不能将其转移到的宿主识别为外来的，这意味着它们不太可能引起移植物抗宿主病。这意味着它们可以“现成”使用，并转移到任何受者，例如，用于同种异体过继性t细胞治疗。
[0362]
通过本文所述的方法获得的γδt细胞可以表达nkg2d并对nkg2d配体(例如，mica) 响应，该配体与恶性肿瘤密切相关。它们还可能在没有任何活化的情况下表达细胞毒性谱，因此可能有效杀伤肿瘤细胞。例如，如本文所述获得的γδt细胞可以在不存在任何活化的情况下表达ifn-γ、tnf-α、gm-csf、ccl4、il-13、粒溶素、颗粒酶a和b以及穿孔素中的一种或多种，优选地全部。可能不表达il-17a。
[0363]
在一些实施方案中，治疗患有肿瘤的个体的方法可以包括：提供从供体个体获得的所述肿瘤的样品，如上所述培养从该样品获得的γδt细胞，和将γδt细胞群施用于患有肿瘤的个体。在进一步的实施方案中，治疗患有非造血组织中肿瘤的个体的方法可以包括：提供从供体个体获得的所述非造血组织的样品，如上所述培养从该样品获得的γδt细胞，和将γδt细胞群施用于患有肿瘤的个体。
[0364]
在一些情况下，通过上述任何方法获得的治疗有效量的γδt细胞可以治疗有效量
施用于受试者(例如，用于治疗癌症,例如，用于治疗实体瘤)。在某些情况下，治疗有效量的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)少于10x10
12
个细胞每剂量(例如，少于9x 10
12
个细胞每剂量、少于8x10
12
个细胞每剂量、少于7x10
12
个细胞每剂量、少于6x10
12
个细胞每剂量、少于5x10
12
个细胞每剂量、少于4x10
12
个细胞每剂量、少于3x10
12
个细胞每剂量、少于2x10
12
个细胞每剂量、少于1x10
12
个细胞每剂量、少于9x10
11
个细胞每剂量、少于8x10
11
个细胞每剂量、少于7x10
11
个细胞每剂量、少于6x10
11
个细胞每剂量、少于5x 10
11
个细胞每剂量、少于4x10
11
个细胞每剂量、少于3x10
11
个细胞每剂量、少于2x10
11
个细胞每剂量、少于1x10
11
个细胞每剂量、少于9x10
10
个细胞每剂量、少于7.5x10
10
个细胞每剂量、少于5x10
10
个细胞每剂量、少于2.5x10
10
个细胞每剂量、少于1x10
10
个细胞每剂量、少于7.5x109个细胞每剂量、少于5x109个细胞每剂量、少于2.5x109个细胞每剂量、少于1x109个细胞每剂量、少于7.5x108个细胞每剂量、少于5x108个细胞每剂量、少于2,5 x108个细胞每剂量、少于1x108个细胞每剂量、少于7.5x107个细胞每剂量、少于5x107个细胞每剂量、少于2,5x107个细胞每剂量、少于1x107个细胞每剂量、少于7.5x106个细胞每剂量、少于5x106个细胞每剂量、少于2,5x106个细胞每剂量、少于1x106个细胞每剂量、少于7.5x105个细胞每剂量、少于5x105个细胞每剂量、少于2,5x105个细胞每剂量、或少于1x105个细胞每剂量)。
[0365]
在一些实施方案中，治疗有效量的γδt细胞(例如,皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)在疗程中少于10x10
12
个细胞(例如，在疗程中少于9x10
12
个细胞、少于8x10
12
个细胞、少于7x10
12
个细胞、少于6x10
12
个细胞、少于5x10
12
个细胞、少于4x10
12
个细胞、少于3x10
12
个细胞、少于2x10
12
个细胞、少于1x10
12
个细胞、少于9x10
11
个细胞、少于8x10
11
个细胞、少于7x10
11
个细胞、少于6x10
11
个细胞、少于5x10
11
个细胞、少于4x10
11
个细胞、少于3x10
11
个细胞、少于2x10
11
个细胞、少于1x10
11
个细胞、少于9x10
10
个细胞、少于7.5x10
10
个细胞、少于5x10
10
个细胞、少于2.5x10
10
个细胞、少于1x10
10
个细胞、少于7.5x109个细胞、少于5x109个细胞、少于2.5x109个细胞、少于1x109个细胞、少于7.5x108个细胞、少于5x108个细胞、少于2.5x108个细胞、少于1x108个细胞、少于7.5x107个细胞、少于5x107个细胞、少于2.5x107个细胞、少于1x107个细胞、少于7.5x106个细胞、少于5x106个细胞、少于2.5x106个细胞、少于1x106个细胞、少于7.5x105个细胞、少于5x105个细胞、少于2.5x105个细胞、或少于1x105个细胞)。
[0366]
在一些实施方案中，一个剂量的如本文所述的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)包含约1x106、1.1x106、2x106、3.6x106、5x106、1x107、1.8x107、2x 107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，一个剂量的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)包含多达约1x106、1.1x106、2x106、3.6 x106、5x106、1x107、1.8x107、2x107、5x107、1x108、2x108、或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，一个剂量的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)包含约1.1x10
6-1.8x107个细胞/kg。在一些实施方案中，一个剂量的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)包含约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x108、 1x109、2x109、或5x109个细胞。在一些实施方案中，一个剂量的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)包含至少约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、5x 108、1x109、2x109、或5x109个细胞。在一些实施方案中，一个剂量的γδt细胞(例如，皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)包含多达约1x107、2x107、5x107、1x108、2x108、 5x108、1x109、2x109、或5x109个细胞。
[0367]
在一个实施方案中，受试者被施用104至106个γδt细胞(例如，每公斤受试者体重施用 104至106个皮肤来源的γδt细胞和/或vδ1t细胞)。在一个实施方案中，受试者接受初始施用的γδt细胞群(例如，每公斤体重受试者初始施用104至106个γδt细胞，例如，每公斤体重受试者初始施用104至105个γδt细胞)，以及一次或多次(例如，2、3、4或5次)后续施用的γδt细胞(例如，每公斤体重受试者一次或多次后续施用104至106个γδt细胞，例如，每公斤体重受试者104至105个γδt细胞)。在一个实施方案中，一次或多次后续施用在之前的施用之后，少于15天，例如少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天施用，例如,在之前的施用之后少于4、3或2天施用。在一个实施方案中，受试者在至少3次γδ t细胞群施用的过程中，总共接受每公斤受试者体重约106个γδt细胞，例如，受试者接受初始剂量的1x105个γδt细胞，第二次施用的3x105个γδt细胞，以及第三次施用的6x105个γδt细胞，并且，例如，每次施用在之前的施用之后少于4、3或2天施用。
[0368]
在一些实施方案中，可以向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可以选自免疫治疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、放射治疗剂、抗血管生成剂或其两种或更多种药剂的组合。另外的治疗剂可以与γδt细胞同时施用、在其施用之前或之后施用。另外的治疗剂可以是免疫治疗剂，其可以作用于受试者体内的靶标(例如，受试者自身的免疫系统)和/或转移的γδt细胞。
[0369]
组合物的施用可以任何方便的方式进行。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用至患者，例如，通过皮内或皮下注射施用至患者。γδt细胞的组分可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
[0370]
基因工程化
[0371]
通过本发明的方法获得的γδt细胞也可以进行基因工程化以增强治疗特性，例如用于嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法。这涉及产生工程化的t细胞受体(tcr)，以重新编程具有新的特异性的t细胞，例如，具有单克隆抗体的特异性。工程化的tcr可以使t细胞对恶性细胞具有特异性，因此可用于癌症免疫治疗。例如，t细胞可以识别表达肿瘤抗原的癌细胞，例如来自受试者组织的正常体细胞不表达的肿瘤相关抗原。因此，car-修饰的t细胞可用于例如癌症患者的过继性t细胞疗法。
[0372]
抗体或其片段的其他用途
[0373]
根据本发明的另一方面，提供了本文所述的抗vδ1抗体或其片段在研究γδt细胞(特别是 vδ1t细胞)的抗原识别、活化、信号传导或功能中的用途。如本文所述，抗体已显示在可用于研究γδt细胞功能的测定法中具有活性。此类抗体还可用于诱导γδt细胞的增殖，因此可用于扩增γδt细胞(例如，vδ1t细胞)的方法中。
[0374]
与vδ1链结合的抗体可用于检测γδt细胞(即作为标记)。优选地，用作标记的抗体不会刺激细胞增殖，从而靶vδ1t细胞在抗体结合后不受影响。例如，抗体可以用可检测标记或报告分子标记，或用作捕获配体以选择性地检测和/或分离样品中的vδ1t细胞。标记的抗体可用于本领域已知的许多方法中，例如免疫组织化学和elisa。
[0375]
可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，例如3h、
14
c、
32
p、
35
s、或
125
l；荧光或化学发光部分，例如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。应用于本发明抗体的荧光标记然后可用于荧光活化细胞分选(facs)方法。
[0376]
多核苷酸和表达载体
[0377]
还提供了编码本发明的抗vδ1抗体或片段的多核苷酸。在一个实施方案中，抗vδ1抗体或片段由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与seq id no：99-110具有至少70％、例如至少 80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成。在一个实施方案中，抗vδ1抗体或片段由包含seq id no：99-110的vh区的表达载体编码。在另一个实施方案中，抗vδ1抗体或片段由包含seq id no：99-110的vl区的表达载体编码。在进一步的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:99-110，或由其组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cdna。
[0378]
在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-110具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成。在一个实施方案中，表达载体包含seq id no：99-110的vh区。在另一个实施方案中，表达载体包含 seq id no：99-110的vl区。在进一步的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:99-110，或由其组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cdna。
[0379]
在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-101或105-108具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成。在一个实施方案中，表达载体包含seq id no：99-101或105-108的vh区。在另一个实施方案中，表达载体包含seq id no：99-101或105-108的vl区。在进一步的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:99-101或105-108，或由其组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cdna。
[0380]
在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-101具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成。在一个实施方案中，表达载体包含seq id no：99-101的vh区。在另一个实施方案中，表达载体包含 seq id no：99-101的vl区。在进一步的实施方案中，多核苷酸包含seq id no:99-101，或由其组成。在另一方面，提供了包含所述多核苷酸的cdna。
[0381]
在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-110的部分中的任一部分具有至少 70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成，所述任一部分编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的cdr1、cdr2和/或cdr3。在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-101或105-108的部分中的任一部分具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成，所述任一部分编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的cdr1、cdr2和 /或cdr3。在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-101的部分中的任一部分具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成，所述任一部分编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的cdr1、cdr2和 /或cdr3。
[0382]
在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-110的部分中的任一部分具有至少 70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成，所述任一部分编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的fr1、fr2、fr3和/或fr4。在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-101或105-108的部分中的任一部分具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一
性的序列，或由其组成，所述任一部分编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的fr1、fr2、fr3 和/或fr4。在一个实施方案中，多核苷酸包含与seq id no：99-101的部分中的任一部分具有至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少99％序列同一性的序列，或由其组成，所述任一部分编码所编码的免疫球蛋白链可变结构域的fr1、fr2、fr3 和/或fr4。
[0383]
本发明的多核苷酸和表达载体也可以参照所编码的氨基酸序列进行描述。因此，在一个实施方案中，多核苷酸包含编码seq id no：62至85中任一项的氨基酸序列的序列，或由其组成。在一个实施方案中，表达载体包含编码seq id no：62至73中任一者的氨基酸序列的序列。在另一个实施方案中，表达载体包含编码seq id no：74至85中任一者的氨基酸序列的序列。
[0384]
为了表达抗体或其片段，将如本文所述的编码部分或全长轻链和重链的多核苷酸插入表达载体中，使得基因可操作地连接到转录和翻译控制序列。因此，在本发明的一个方面，提供了一种包含本文定义的多核苷酸序列的表达载体。在一个实施方案中，表达载体包含seq idno：99-110例如seq id no:99、100、101、105、106、107或108的vh区。在另一个实施方案中，表达载体包含seq id no：99-110例如seq id no:99、100、101、105、106、107 或108的vl区。
[0385]
应当理解，本文所述的核苷酸序列包含编码氨基酸残基以辅助翻译、纯化和检测的另外序列，然而，取决于所使用的表达系统，可以使用替代序列。例如，seq id no：99-110的起始(5'-末端)的九个核苷酸，和seq id no：99-100、102-103、105-110的最后(3'-末端)的36 个核苷酸，或seq id no：101和104的最后(3'-末端)的39个核苷酸是可选序列。如果采用替代设计、翻译、纯化或检测策略，则可以删除、修饰或取代这些可选序列。
[0386]
可以对编码多肽的dna或cdna进行突变，这些突变对多肽的氨基酸序列是沉默的，但为在特定宿主中的翻译提供优选的密码子。用于核酸在例如，大肠杆菌和酿酒酵母，以及哺乳动物，特别是人中翻译的优选密码子是已知的。
[0387]
可以例如通过对编码多肽的核酸进行取代、添加或缺失来实现多肽的突变。编码多肽的核酸的取代、添加或缺失可以通过许多方法引入，包括例如易错pcr、改组、寡核苷酸定向诱变、组装pcr、pcr诱变、体内诱变、盒诱变、递归集成诱变、指数集成诱变、位点特异性诱变、基因重组、人工基因合成、基因位点饱和诱变(gssm)、合成连接重组(slr)或这些方法的组合。也可以通过以下方法引入核酸的修饰、添加或缺失：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的dna诱变、含尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷宿主菌株诱变、化学诱变、放射产生的诱变、缺失诱变、限制性选择诱变、限制性纯化诱变、集成诱变、嵌合核酸多聚体产生或其组合。
[0388]
特别地，可以使用人工基因合成。编码本发明多肽的基因可以通过例如固相dna合成合成产生。可以从头合成整个基因，而无需前体模板dna。为了获得所需的寡核苷酸，根据产物序列的需要按顺序将构建单元相继偶联到增长的寡核苷酸链上。链组装完成后，产物从固相释放到溶液中、脱保护并收集。可以通过高效液相色谱法(hplc)分离产物，以获得所需的高纯度寡核苷酸。
[0389]
表达载体包括例如质粒、逆转录病毒、粘粒、酵母人工染色体(yac)和爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)衍生的附加体。将多核苷酸连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列
发挥其调节多核苷酸转录和翻译的预期功能。表达和/或控制序列可以包括启动子、增强子、转录终止子、编码序列5'端的起始密码子(即atg)、内含子的剪接信号和终止密码子。选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。seq id no:99-110包含编码本发明的单链可变片段的核苷酸序列，其包含通过合成接头连接的vh区和vl区(例如，编码seq idno:98)。应当理解，本发明的多核苷酸或表达载体可以包含vh区、vl区或两者(任选地包括接头)。因此，可以将编码vh和vl区的多核苷酸插入分别的载体中，或者，将编码这两个区的序列插入同一表达载体中。通过标准方法(例如，在多核苷酸和载体上连接互补限制性位点，如果不存在限制性位点，则连接平端)将多核苷酸插入表达载体中。
[0390]
方便的载体是编码功能完整的人ch或cl免疫球蛋白序列的载体，其具有适当的工程化限制性位点，使得任何vh或vl序列可以容易地被插入和表达，如本文所述。表达载体还可以编码促进抗体(或其片段)从宿主细胞分泌的信号肽。可以将多核苷酸克隆到载体中，以使信号肽与抗体的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0391]
宿主细胞可以包含编码抗体或其片段的轻链的第一载体，和编码抗体或其片段的重链的第二载体。或者，将在同一表达载体上编码的重链和轻链引入宿主细胞。在一个实施方案中，多核苷酸或表达载体编码与抗体或其片段融合的膜锚或跨膜结构域，其中抗体或其片段存在于宿主细胞的细胞外表面。
[0392]
可以通过任何已知的方法进行转化，用于将多核苷酸引入宿主细胞中。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域中是众所周知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中、基因枪注射和直接将dna显微注射到细胞核中。此外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞。
[0393]
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得的许多永生化细胞系。其中包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、nso、 sp2细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hep g2)、 a549细胞、3t3细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。可以使用本领域已知的方法在大肠杆菌中分离和表达抗体的抗原结合片段，例如scfv和fv片段。
[0394]
通过将宿主细胞培养一段时间来产生抗体，所述一段时间足以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，足以允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收抗体。
[0395]
可以使用例如green and sambrook,molecular cloning:a laboratory manual(2012)第4 版cold spring harbour laboratory press中公开的技术获得和操作本发明的抗体(或片段)。
[0396]
可以使用通过将产生特定抗体的b细胞与骨髓瘤(b细胞癌)细胞融合的杂交瘤技术来产生单克隆抗体，所选择的骨髓瘤具有在组织培养中生长的能力，并且不存在抗体链的合成。
[0397]
例如，可以通过以下方式获得针对确定抗原的单克隆抗体：
[0398]
a)使用永生细胞，优选使用骨髓瘤细胞，使从先前用确定的抗原免疫的动物的外周血中获得的淋巴细胞永生化，以形成杂交瘤，
[0399]
b)培养形成的永生化细胞(杂交瘤)，回收产生具有所需特异性的抗体的细胞。
[0400]
或者，不需要使用杂交瘤细胞。可以通过常规实践，例如使用本领域已知的噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术，从合适的抗体文库中分离能够结合如本文所述的靶抗原的抗体。因此，单克隆抗体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：
[0401]
a)将从动物(适当地先前用确定的抗原免疫)的淋巴细胞，尤其是外周血淋巴细胞中获得的dna或cdna序列克隆入载体，尤其是噬菌体，更特别是丝状噬菌体，
[0402]
b)在允许产生抗体的条件下用上述载体转化原核细胞，
[0403]
c)通过对抗体进行抗原亲和力选择来选择抗体，
[0404]
d)回收具有所需特异性的抗体。
[0405]
应当理解，本文描述的所有实施方案都可以应用于本发明的所有方面。
[0406]
本发明的其他特征和优点将从本文提供的描述中显而易见。然而，应该理解的是，说明和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。现在将使用以下非限制性实施例描述本发明：
[0407]
实施例
[0408]
实施例1材料和方法
[0409]
人抗体发现
[0410]
人噬菌体展示被用来产生如本文所述的人的抗人可变vδ1 结构域抗体。该文库按照 schofield等人(genome biology 2007,8(11):r254)的描述构建，并且包含展示单链可变片段 (scfv)的约400亿人克隆的文库。使用如本文所述的抗原、方法、选择、取消选择、筛选和表征策略来筛选该文库。
[0411]
抗原制备
[0412]
以下实施例中使用的包含tcrα和tcrβ恒定区的可溶性yδtcr异二聚体的设计是根据xu等人(2011)pnas 108:2414-2419产生的。vγ或vδ结构域与缺乏跨膜结构域的tcrα或tcrβ恒定区框内融合，随后是亮氨酸拉链序列或fc序列和组氨酸标签/接头。
[0413]
将表达构建体瞬时转染到哺乳动物expi hek293悬浮细胞中(作为异二聚体的单转染或共转染)。通过亲和色谱法从培养上清液中回收和纯化分泌的重组蛋白。为了确保单体抗原的良好回收，使用制备型尺寸排阻色谱法(sec)进一步纯化样品。通过sds-page分析纯化抗原的纯度，通过分析型sec分析聚集状态。
[0414]
抗原功能验证
[0415]
含有delta可变1(vδ1)链的抗原的特异性在delfia免疫测定法(perkin elmer)和使用 rea173-miltenyi biotec抗vδ1抗体的与γδt细胞竞争的基于流式的测定法中得到证实。
[0416]
解离增强镧系元素荧光免疫测定法(delfia)
[0417]
为了确认抗原的特异性，使用直接包被在板上的抗原进行delfia免疫测定法，3μg/ml 抗原在50μl pbs中在4℃下过夜(nunc#437111)，并且从300nm开始系列稀释一抗。
delfiaeu-n1抗人igg(perkin elmer#1244-330)用作二抗，在50μl 3％mpbs(pbs 3％(w/v)脱脂奶粉)中1/500稀释，用于检测。使用50μl delfia增强溶液(perkin elmer#4001-0010)进行显色。
[0418]
使用delfia免疫测定法对目的抗体进行亲和力排序，其中抗体通过包被在板上的蛋白 g捕获，可溶性生物素化l1(dv1-gv4)抗原以5nm加入50μl(3mpbs)中。为了检测，使用 50μl链霉亲和素-eu(1:500在分析缓冲液中，perkin elmer)，并使用delfia增强溶液产生信号。d1.3 higg1(在england等人(1999)j.immunol.162:2129-2136中描述)用作阴性对照。
[0419]
将噬菌体展示选择输出亚克隆到scfv表达载体psang10(martin等人(2006)bmcbiotechnol.6:46)。可溶性scfv被表达，并在delfia中筛选与直接固定的靶标的结合。命中被定义为delfia信号超过3000个荧光单位。
[0420]
抗体制备
[0421]
使用市售质粒将选择的scfv亚克隆到igg1框架中。用所述质粒转染expi293f悬浮细胞，用于抗体表达。为方便起见，除非另有说明，否则这些实施例中表征的抗体是指选自噬菌体展示的作为scfv的igg1格式的抗体。然而，本发明的抗体可以是如前所述的任何抗体格式。
[0422]
抗体纯化
[0423]
使用蛋白a色谱法从上清液中批量纯化igg抗体。然后使用尺寸排阻色谱法(sec)纯化浓缩的蛋白a洗脱液。使用elisa、sds-page和sec-hplc分析纯化igg的质量。
[0424]
γδt细胞的制备
[0425]
根据wo2016/198480(即，血液来源的γδt细胞)或wo2020/095059(即，皮肤来源的γδt 细胞)中描述的方法制备富集的γδt细胞群。简而言之，对于血液来源的γδt细胞，从血液中获得pbmc，并进行αβt细胞的磁耗尽。然后在存在okt-3(或相应的抗vδ1抗体)、il-4、 ifn-γ、il-21和il-1β的情况下，在cts optmiser培养基(thermofisher)中培养αβ耗尽的 pbmc 7天。在培养的第7天，将培养基补充okt-3(或相应的抗vδ1抗体)、il-21和il-15，进一步维持4天。在培养的第11天，将培养基补充okt-3(或相应的抗vδ1抗体)和il-15，进一步维持3天。在培养的第14天，一半培养基替换为新鲜的完全optmiser，并补充 okt-3(或相应的抗vδ1抗体)、il-15和ifn-γ。从培养第17天开始，每3至4天向培养物中补充okt-3(或相应的抗vδ1抗体)和il-15；每7天将一半培养基替换为新鲜培养基。
[0426]
对于皮肤来源的γδt细胞，通过去除皮下脂肪制备皮肤样品，并使用3mm活检打孔器进行多次打孔。将打孔器放置在碳矩阵网格上并放置在g-rex6(wilson wolf)的孔中。每个孔都充满了完全分离培养基，其中包含aim-v培养基(gibco，life technologies)、cts免疫血清替代物(life technologies)、il-2和il-15。对于培养的前7天，使用含有两性霉素b(lifetechnologies)的完全分离培养基(“ amp”)。每7天更换培养基，轻轻吸出上部培养基并替换为2x完全分离培养基(不含amp)，尽量不要干扰板或生物反应器底部的细胞。培养超过3 周后，将产生的离开(egressed)的细胞传代到新鲜组织培养容器和新鲜培养基(例如aim-v培养基或texmax培养基(miltenyi))加重组il-2、il-4、il-15和il-21中，然后收获。任选地，然后在αβt细胞耗尽试剂盒和相关方案(例如由miltenyi提供的那些试剂盒)的帮助下去除也存在于培养物中的αβt细胞。进一步参考的见wo2020/095059。
[0427]
γδt细胞结合测定法
[0428]
通过将固定浓度的纯化抗体与250000γδt细胞孵育，测试抗体与γδt细胞的结合。这种孵育是在封闭条件下进行的，以防止抗体通过fc受体进行非特异性结合。通过添加二级的、荧光染料缀合的抗人igg1抗体进行检测。对于阴性对照，使用a)仅同种型抗体(重组人igg)、 b)仅荧光染料缀合的抗人igg抗体和c)a)和b)的组合制备细胞。还制备和分析了完全未染色细胞的对照孔。作为阳性对照，纯化的鼠单克隆igg2抗人cd3抗体和纯化的鼠单克隆igg1 抗人tcr vδ1抗体以两种不同的浓度使用，并用荧光染料缀合的山羊抗鼠二抗染色。如果在 fitc通道中较低浓度的阳性对照的平均荧光强度是最高阴性对照的至少10倍，则该测定法被接受。
[0429]
spr测定法
[0430]
使用具有胺高容量芯片的mass-2仪器(均来自德国sierra sensors)进行spr测定法。通过蛋白g将15nm igg捕获到胺高容量芯片(对于ts8.2为100nm)。使以1:2系列稀释的、从2000nm至15.625nm的l1(dv1-gv4)抗原流过小池(cell)，其中参数如下：180秒结合，600秒解离，流速30μl/min，运行缓冲液pbs 0.02％tween 20。所有实验均在室温下在 mass-2仪器上进行。使用软件sierra analyzer 3.2根据langmuir 1:1结合确定稳态拟合。
[0431]
比较器(comparator)抗体
[0432]
如所述，在测试测定法中将抗体与可商购的抗体进行比较。
[0433][0434]
γδtcr下调和脱粒测定法
[0435]
用celltracker
tm orange cmtmr(thermofisher,c2927)标记负载或未负载测试抗体的 thp-1(tib-202
tm
,atcc)靶细胞，并且在cd107a抗体(抗人cd107a bv421(克隆h4a3)bdbiosciences 562623)存在下以2:1的比例与γδt细胞孵育。孵育2小时后，使用流式细胞术评估γδt细胞上的γδtcr的表面表达(以测量tcr的下调)和cd107a的表达(以测量脱粒)。
[0436]
杀伤测定法
[0437]
通过流式细胞术评估gamma delta t细胞杀伤活性和测试抗体对γδt细胞杀伤活性的影响。在以20:1的比例体外共培养γδt细胞和celltracker
tm orange cmtmr(thermofisher， c2927)标记的thp-1细胞(负载或未负载抗体)4小时后，用viability dyeefluor
tm
520(thermofisher，520 65-0867-14)染色以区分活的和死的靶标thp-1细胞。在样品采集过程中，对靶细胞在celltracker
tm orange cmtmr阳性上进行门控，并基于viabilitydye的摄取情况检查细胞死亡。cmtmr和efluor
tm 520双阳性细胞被识别为死亡靶细胞。γδ t细胞的杀伤活性以死亡靶细胞的百分比表示。
[0438]
表位作图
[0439]
使用高质量maldi分析用于表位作图的所有蛋白样品(抗原l1(dv1-gv4)和抗体 1245_p01_e07、1245_p02_g04、1252_p01_c08、1251_p02_c05和1141_p01_e01)的蛋白完整性和聚集水平。
[0440]
为了以高分辨率确定l1(dv1-gv4)/1245_p01_e07、l1(dv1-gv4)/1245_p02_g04、 l1(dv1-gv4)/1252_p01_c08、l1(dv1-gv4)/1251_p02_c05和l1(dv1-gv4)/1141_p01_e01 复合物的表位，蛋白复合物与氘代交联剂一起孵育，并使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、asp-n、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶进行多酶蛋白水解。交联的肽富集后，通过高分辨率质谱 (nlc-ltq-orbitrap ms)分析样品，并使用xquest和stavrox软件分析生成的数据。
[0441]
sytox-流式杀伤测定法
[0442]
sytox测定法允许使用流式细胞术对t细胞介导的靶细胞细胞溶解进行定量。通过死细胞染色剂(aadvanced
tm
,life technologies,s10274)检测死亡/垂死的细胞，该染色剂仅透入质膜受损的细胞中，但不能穿过健康细胞的完整细胞膜。用ctv染料(cell traceviolet
tm
,life technologies,c34557)标记nalm-6靶细胞，因此可与未标记的效应t细胞区分开来。通过死细胞染料和细胞追踪染料的双重染色来识别死亡/垂死的靶细胞。
[0443]
以指定的效靶比(e:t，1:1或10:1)体外共培养效应细胞和ctv标记的靶细胞16小时后，用aadvanced
tm
染色细胞并在facslyric
tm
(bd)上采集。杀伤结果表示为靶细胞降低％，其计算考虑测试样品中活的靶细胞数量(样品计数)相对于未添加效应细胞的对照孔中的活的靶细胞(最大计数)：
[0444][0445]
实施例2抗原设计
[0446]
gamma delta(γδ)t细胞是具有cdr3多克隆性的多克隆细胞。为了避免针对cdr3序列选择生成的抗体的情况(因为cdr3序列在tcr克隆与tcr克隆之间不同)，抗原设计包括在不同的格式中保持cdr3的一致。该设计旨在生成识别可变结构域内的序列的抗体，该序列是种系编码的，因此在所有克隆中都是相同的，从而提供识别更广泛的γδt细胞亚群的抗体。
[0447]
抗原制备过程的另一个重要方面是设计适合作为蛋白表达的抗原。γδtcr是一种复合蛋白，包括具有链间和链内二硫键的异二聚体。使用亮氨酸拉链(lz)格式和fc形式生成可溶性 tcr抗原，以用于噬菌体展示的选择。lz和fc格式都表达良好并成功展示了tcr
(特别是异二聚体tcr，例如，vδ1vγ4)。
[0448]
发现来自公共数据库条目的γδtcr的cdr3序列作为蛋白表达良好(rcsb proteindata bank entries:3omz)。因此选择其用于抗原制备。
[0449]
包含delta可变1链的抗原以lz格式表达为异二聚体(即，与不同的gamma可变链—“l1”、“l2”、“l3”组合)和以fc格式表达为异二聚体(“f1”、“f2”、“f3”)或表达为同二聚体(即，与另一个delta可变1链组合
‑“
fc1/1”)。所有抗原的delta可变1链都含有3omz cdr3。将使用类似格式的另一系列γδtcr抗原设计为包含不同的delta可变链(例如，delta可变2和delta 可变3)，并用于取消选择具有非特异性或脱靶结合的抗体(“l4”、“f9”、“fc4/4”、“fc8/8”)。这些抗原也被设计成包括3omz cdr3，以确保在cdr3区中结合的抗体也被取消选择。
[0450]
进行抗原功能验证以确认设计的抗原将适合产生抗trdv1(tcr delta可变1)抗体。仅到对含有δ1结构域的抗原进行检测(图1)。
[0451]
实施例3噬菌体展示
[0452]
在第1轮和第2轮中使用异二聚体lz tcr格式针对人scfv文库进行噬菌体展示选择，在两轮中均取消选择异二聚体lz tcr。或者，使用同二聚体fc融合tcr进行第1轮，其中取消选择人igg1 fc，然后对异二聚体lz tcr进行第2轮，其中取消选择异二聚体lztcr(参见表1)。
[0453]
表1概述噬菌体展示选择
[0454]
靶标第1轮选择第1轮取消选择第2轮选择第2轮取消选择dv1bt-l1(dv1-gv4)l4(dv2-gv4)bt-l3(dv1-gv8)l4(dv2-gv4)dv1bt-fc1/1(dv1-dv1)fcbt-l1(dv1-gv4)l4(dv2-gv4)
[0455]
bt＝生物素。
[0456]
使用100nm生物素化蛋白在溶液相中进行选择。使用1μm非生物素化蛋白进行取消选择。
[0457]
通过多克隆噬菌体elisa(delfia)分析噬菌体展示选择的成功。所有dv1选择输出均显示与靶标fc 1/1、l1、l2、l3、f1和f3的所期望的结合。检测到与非靶标l4、f9、fc 4/4、 fc 8/8和fc不同程度的结合(参见图2a和b)。
[0458]
实施例4抗体选择
[0459]
对实施例3中获得的命中进行测序(使用本领域已知的标准方法)。鉴定了130个独特的克隆，其显示出vh和vl cdr3的独特组合。在这130个独特的克隆中，125个显示出独特的 vh cdr3，109个显示出独特的vl cdr3。
[0460]
重新排列独特的克隆，并通过elisa(delfia)分析特异性。从选择中鉴定出一组94个独特的人scfv结合物，其结合trdv1(l1、l2、l3、f1、f2、f3)但不结合trdv2(l4)。
[0461]
包括所选结合物的亲和力排名以辅助选择之后的克隆。大量结合物显示在纳摩尔范围内的亲和力，与25至100nm生物素化的抗原反应。少数结合物显示出与5nm抗原的强反应，表明可能存在个位数的纳摩尔亲和力。一些结合物与100nm抗原没有反应，表明在微摩尔范围内的亲和力。
[0462]
为了选择克隆以进行igg转化，目的是包括尽可能多的种系谱系和尽可能多的不同 cdr3。此外，避免了糖基化、整合素结合位点、cd11c/cd18结合位点、未配对半胱氨酸等
序列倾向。此外，还包括多种亲和力。
[0463]
使用从不同供体获得的皮肤来源的γδt细胞筛选所选择的克隆与天然细胞表面表达的γδtcr的结合。选择转化为igg的克隆显示在表2。
[0464][0465]
实施例5：抗体spr分析
[0466]
将制备的igg抗体通过γδ细胞结合测定法，并选择5种最佳结合物用于进一步的
功能和生物物理表征。进行spr分析以确定平衡解离常数(kd)。被测抗体与分析物相互作用的传感图，以及稳态拟合(如果有)显示在图3中。没有检测到ts8.2与芯片上捕获的80ru igg的结合。结果总结在表3中。
[0467]
表3igg捕获的结果
[0468]
分析物克隆idkd(nm)kd(m)l1(dv1-gv4)1245_p01_e0712.41.24e-08l1(dv1-gv4)1252_p01_c081001.00e-07l1(dv1-gv4)1245_p02_g041261.26e-07l1(dv1-gv4)1245_p01_b073413.41e-07l1(dv1-gv4)1251_p02_c051967*1.97e-06l1(dv1-gv4)1139_p01_e042512.51e-07l1(dv1-gv4)1245_p02_f071931.93e-07l1(dv1-gv4)1245_p01_g062642.64e-07l1(dv1-gv4)1245_p01_g092082.08e-07l1(dv1-gv4)1138_p01_b092902.90e-07l1(dv1-gv4)1251_p02_g108298.29e-07l1(dv1-gv4)ts8.2(商业化抗vδ1抗体)444.40e-08
[0469]
*1252_p02_c05的结合未达到饱和，因此外推数据
[0470]
实施例6：tcr接合测定
[0471]
发明人设计了几种测定法以用于选定抗体的功能表征。第一个测定法通过测量抗体结合后γδtcr的下调来评估γδtcr的接合。针对用作阳性对照的商业化抗cd3和抗vδ1抗体或针对用作阳性对照的1252_p01_c08(对于1139_p01_e04、1245_p02_f07、1245_p01_g06 和1245_p01_g09)测试选择的抗体。商业化抗panγδ用作阴性对照，因为它是一种panγδ抗体，识别所有γδt细胞，而与可变链无关，因此可能具有不同的作用方式。
[0472]
使用从三个不同供体样品(样品纯度为94％、80％和57％)中获得的皮肤来源的γδt细胞进行测定。结果显示在图4中。ec50值总结在以下表4。
[0473]
实施例7：t细胞脱粒测定法
[0474]
第二个测定法评估了γδt细胞的脱粒。人们认为γδt细胞可能通过穿孔素-颗粒酶介导的细胞凋亡活化介导靶细胞杀伤。γδt细胞的细胞质内的溶解颗粒可在t细胞活化后向靶细胞释放。因此，用cd107a抗体标记靶细胞并通过流式细胞术测量表达可用于鉴定脱粒的γδt 细胞。
[0475]
对于实施例6，针对用作阳性对照的商业化抗cd3和抗vδ1抗体或针对用作阳性对照的 1252_p01_c08(对于1139_p01_e04、1245_p02_f07、1245_p01_g06和1245_p01_g09)测试选择的抗体。igg2a、igg1和d1.3抗体用作阴性对照。使用从三个不同供体样品(样品纯度为 94％、80％和57％)中获得的皮肤来源的γδt细胞进行测定法。结果显示在图5中。ec50值总结在以下表4。
[0476]
实施例8：杀伤测定法
[0477]
第三个测定法评估了用所选抗体活化的γδt细胞杀伤靶细胞的能力。
[0478]
对于实施例6，针对用作阳性对照的商业抗cd3和抗vδ1抗体或针对用作阳性对照
的 1252_p01_c08(对于1139_p01_e04、1245_p02_f07、1245_p01_g06和1245_p01_g09)以及用作阴性对照的抗panγδ，测试选择的抗体。igg2a、igg1和d1.3抗体也用作同种型对照。使用从两个供体获得的皮肤来源的γδt细胞(94％和80％纯度)进行测定法，结果显示在图6中。
[0479]
在实施例6-8中测试的三种功能测定法的结果总结在表4。
[0480]
表4从功能测定法中获得的结果的总结
[0481][0482][0483]
n/d：无法测定；n/d*：无法测定，滴定曲线未达到平台；n/d**：杀伤曲线降低，ec50 未建立。
[0484]
实施例9：表位作图
[0485]
为了以高分辨率确定抗原/抗体复合物的表位，将蛋白复合物与氘化交联剂一起孵育并进行多酶切割。交联的肽富集后，通过高分辨率质谱(nlc-ltq-orbitrap ms)分析样品，并使用xquest(version 2.0)和stavrox(3.6版本)软件分析生成的数据。
[0486]
在胰蛋白酶、糜蛋白酶、asp-n、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对带有氘化d0d12的蛋白复合物l1(dv1-gv4)/1245_p01_e07进行蛋白水解后，nlc-orbitrap ms/ms分析检测到 l1(dv1-gv4)和抗体1245_p01_e07之间的13个交联肽。结果显示在图7中。
[0487]
在胰蛋白酶、糜蛋白酶、asp-n、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对带有氘化d0d12的蛋
白复合物l1(dv1-gv4)/1252_p01_c08进行蛋白水解后，nlc-orbitrap ms/ms分析检测到 l1(dv1-gv4)和抗体1252_p01_c08之间的5个交联肽。结果显示在图8中。
[0488]
在胰蛋白酶、糜蛋白酶、asp-n、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对带有氘化d0d12的蛋白复合物l1(dv1-gv4)/1245_p02_g04进行蛋白水解后，nlc-orbitrap ms/ms分析检测到 l1(dv1-gv4)和抗体1245_p02_g04之间的20个交联肽。结果显示在图9中。
[0489]
在胰蛋白酶、糜蛋白酶、asp-n、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对带有氘化d0d12的蛋白复合物l1(dv1-gv4)/1251_p02_c05进行蛋白水解后，nlc-orbitrap ms/ms分析检测到 l1(dv1-gv4)和抗体1252_p01_c05之间的5个交联肽。结果显示在图10中。
[0490]
还测试了与另一种抗体，克隆id 1141_p01_e01的表位结合。在胰蛋白酶、糜蛋白酶、 asp-n、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对带有氘化d0d12的蛋白复合物 l1(dv1-gv4)/1141_p01_e01进行蛋白水解后，nlc-orbitrap ms/ms分析检测到 l1(dv1-gv4)和抗体1141_p01_e01之间的20个交联肽。结果显示在图11中。
[0491]
表位作图结果的总结显示在表5中。
[0492]
表5抗原/抗体复合物的表位作图结果
[0493][0494][0495]
实施例10：vδ1t细胞的扩增
[0496]
在存在所选择的抗体和比较器抗体的情况下研究了分离的γδt细胞的扩增。比较器抗体选自：作为阳性对照的okt3抗cd3抗体，作为阴性对照的无抗体或作为同种型对照的igg1 抗体。还测试了市售的抗vδ1抗体、ts-1和ts8.2，以进行比较。
[0497]
实验1：
[0498]
如实施例1中的对于血液来源的γδt细胞的“γδt细胞制备”中所述，通过铺种70,000个细胞/孔并使用完全优化剂(complete optimizer)和细胞因子来进行初步研究。以4.2ng/ml至 420ng/ml的各种浓度测试选择的抗体和比较器抗体。该实验是使用组织培养板进行的，其允许将抗体结合/固定在塑料上。
[0499]
在第7、14和18天收获细胞，并使用细胞计数器(nc250，chemometec)确定总细胞计数。结果如图12所示。每次收获时也测量vδ1t细胞的细胞活力，并且所有抗体都显示在整个实验过程中维持细胞活力(数据未显示)。在第18天，还分析了vδ1t细胞的百分比、细胞计数和倍数变化。结果如图13所示。
[0500]
在图12中可以看出，在整个培养过程中，在具有抗体的培养物中产生的细胞总数稳步增加，并且与商业抗vδ1抗体相当或更好。在第18天，在以大多数测试浓度的 1245_
p02_g04(“g04”)、1245_p01_e07(“e07”)、1245_p01_b07(“b07”)和1252_p01_c08(“c08”) 抗体存在的情况下，vδ1阳性细胞的比例大于存在okt3、ts-1或ts8.2对照抗体的培养物(参见图13a)。
[0501]
实验2：
[0502]
如实施例1中的“γδt细胞制备”中所述，在具有细胞因子的培养容器中对分离的细胞进行后续实验。与实验1相比，使用了不同的培养容器，其表面不利于抗体结合/固定。以42pg/ml 至42ng/ml的各种浓度测试选择的抗体和比较器抗体。在实验2中，从一式三份的实验中获得结果。
[0503]
在第7、14和17天收获细胞，并如前所述使用细胞计数器确定总细胞计数。结果如图14 所示。在第17天，还分析了vδ1t细胞的百分比、细胞计数和倍数变化。结果如图15所示。
[0504]
在实验2中还测量了细胞组成，包括非vδ1细胞。第17天收获细胞并通过流式细胞术分析vδ1、vδ2和αβtcr的表面表达。每种培养物中每种细胞类型的比例以图形方式显示在图 16，百分比值在表6中提供。
[0505]
表6第17天的细胞组成-每个亚组的活细胞百分比
[0506] αβ-γδ-vδ1vδ2非vδ1/vδ2αβ无ab63.0018.170.867.100.37okt-325.6350.430.2520.131.13igg165.7715.591.116.910.42ts8.2 42ng/ml30.6053.573.597.460.14ts-1 42ng/ml18.7765.900.919.510.12c08 42ng/ml0.7996.430.082.510.05c08 4.2ng/ml1.9194.670.182.630.05c08 420pg/ml8.4780.570.288.420.04c08 42pg/ml35.9725.933.0419.500.31b07 42ng/ml0.9495.570.462.730.05b07 4.2ng/ml1.7994.100.403.280.01b07 420pg/ml3.0891.800.293.940.02b07 42pg/ml17.9362.900.859.160.07e07 42ng/ml2.2985.130.1911.650.04e07 4.2ng/ml2.1591.230.135.770.04e07 420pg/ml9.2573.900.4213.050.02e07 42pg/ml49.2318.672.177.700.43g04 42ng/ml1.9088.530.478.090.05g04 4.2ng/ml4.2589.670.933.980.02g04 420pg/ml25.9750.601.4512.720.11g04 42pg/ml44.0013.772.3326.300.32c05 42ng/ml25.0042.033.7513.671.32c05 4.2ng/ml46.8722.032.5816.460.38
c05 420pg/ml33.5344.602.2311.130.22c05 42pg/ml36.8325.236.1618.000.30
[0507]
从这些结果可以看出，与okt3、ts-1或ts8.2对照相比，存在b07、c08、e07和g04 的培养物中vδ1阳性细胞的比例更大。因此，测试的抗体比市售抗体更有效地产生和扩增vδ1 阳性细胞，即使在培养物中以低浓度存在时也是如此。
[0508]
还分析了来自实验2的第17天的细胞的其他细胞标志物，包括cd3-cd56 ，以识别自然杀伤(nk)细胞，和表达cd27(即，cd27 )的vδ1t细胞的存在。结果总结在表7中。
[0509]
表7第17天的细胞组成-nk和cd27 细胞的百分比
[0510][0511][0512]
sem:平均值的标准误差
[0513]
实施例11：vδ1t细胞的功能性
[0514]
在存在选择的抗体的情况下扩增的vδ1t细胞保留了cdr3区的多克隆库，还使用 sytox流式杀伤测定法测试了功能性。显示在实验1中、在第14天使用10:1的效靶(e:t) 比的细胞获得的细胞的结果(图17a)，以及在实验2中、在第17天(冻融后)使用1:1和10:1 的e:t比的细胞获得的细胞的结果(图17b)。
[0515]
在图17中可以看出，在存在所有抗体的情况下扩增的vδ1阳性细胞有效裂解靶细胞，表明即使在冷冻和解冻细胞后，其也具有功能。
[0516]
实施例12：储存后细胞的功能性
[0517]
还研究了冷冻然后解冻的储存步骤后细胞的功能性。在实验2的第17天从培养物中取出一部分细胞并冷冻。然后将细胞解冻并在与il-15一起培养中进一步扩增。图18显示在冷冻前与b07、c08、e07、g04或okt-3抗体接触的培养物，在冻融后培养细胞7天后的总细胞计数。所有培养物在储存后都显示出增殖能力。培养持续到第42天，在此期间监测总细胞计数(结果显示在图19)。在先前暴露于所选择抗体的培养物中，总细胞数保持或增加。
[0518]
实施例13：抗vδ1抗体赋予til中免疫细胞的调节和增殖
[0519]
进行了研究以探索抗vδ1抗体赋予人肿瘤浸润淋巴细胞(til)的调节和增殖。对于这些研究，人肾细胞癌(rcc)肿瘤活检样品是新鲜运输的，并在收到后进行处理。具体而言，将组织切成约2mm2.将多达1g的组织与4.7mlrpmi和来自miltenyi肿瘤解离试剂盒的酶按制造商推荐的浓度放入每个miltenyic管中，enzymer除外，该酶以0.2x浓度使用以防止相关细胞表面分子的切割。将c管放置在带加热器的gentlemacs
tm
octodissociator上。选择用于分离软肿瘤的程序37c_h_tdk_1。然后将消化物通过70mm过滤器过滤，以产生单细胞悬浮液。将含有10％fbs的rpmi添加到消化物中以淬灭酶活性。将细胞用rpmi/10％fbs洗涤2次，并重悬用于计数。然后将衍生细胞以每孔2.5x10e6接种在tc孔中(24-孔g-rex，wilsonwolf)。然后将细胞在没有或没有细胞因子和有或没有抗体的情况下孵育18天。研究中包含的抗体概述于图20中。这些抗体包括okt3(至50ng/ml)和1252_p01_c08，本文又名“c08”(至500ng/ml)。当包括在内时，在第0、7、11和14天添加这些抗体的单次添加剂量(bolusaddition)。在所述孵育期间，在第11天和第14天用新鲜培养基替换培养基。在第0天和第18天进行流式细胞术分析，以确定淋巴细胞表型以及细胞数的倍数变化。细胞首先在活的cd45 细胞上进行门控，然后如所示。在包括重组细胞因子的组中，添加如下这些。第0天：il-4、ifn-γ、il-21、il-1β。在第7、11、14天包括了另外的il-15。在第7天和第14天分别包括了另外的il-21和ifn-γ。图20(a)显示了在存在c08或okt3、在有和没有细胞因子支持(ck)的情况下，培养18天后tilvδ1 细胞的倍数增加。这些结果显示，与单独的抗体或细胞因子相比，在存在细胞因子的情况下，使用c08或比较器(comparator)okt3抗体可使tilvδ1 细胞显著倍数增加。图20(b)显示在收获后总的vδ1细胞数增加。这些结果显示，与单独的抗体或细胞因子相比，在存在细胞因子的情况下，使用c08或比较器okt3抗体培养后可使tilvδ1 细胞数明显增加。图20(c)显示了用于细胞流式细胞术分析的示例门控策略。根据其前向和侧向散射特性(未显示)，从活的cd45 细胞群中对细胞设置淋巴细胞的门控，然后通过对t细胞受体的染色将γδt细胞与αβt细胞分离。最后，确定了总γδt细胞群中vδ1细胞的比例。第18天的示例数据显示为所示的2个条件( /-1252_p01_c08)：64.3％的细胞为cd45 ，在那些cd45％的细胞中，53.1％为γδ ，并且在γδ细胞中，89.7为vδ1 。图20(d)显示了tilvδ1 细胞在收获时的细胞表面表型谱。在用c08抗体培养后观察到更高水平的cd69。图20(e)显示了收获时活的cd45阳性门内tilγδ阴性、cd8阳性淋巴细胞级分的分析。总之，组合的结果突出了本文所述的本发明的抗vδ1抗体赋予til群的调节作用。