一种制备三七皂苷Fd和七叶胆苷XIII的方法与流程

一种制备三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的方法
技术领域
1.本发明涉及一种制备三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的方法，属于中药技术领域。


背景技术：

2.三七叶为掌状复叶，3～4片轮生茎顶，叶柄长5～11.5cm，表面无毛；托叶线形，簇生，长不及2cm。栽培主产区在云南的文山、砚山、广南、丘北及广西的百色，产量大，质量优，名满中外。
3.《本草纲目》称三七茎叶“治折伤、跌扑出血，敷之即止，青肿经夜即散余功同根”。近年来的研究，表明三七的茎叶亦可供药用，且毒副作用小。三七叶中含有多种皂苷成分，现已报道的有20多种。药理研究表明三七茎叶的活性成分三七茎叶总皂苷，对血液系统、心血管系统、神经系统和代谢系统作用与三七根皂苷相似。三七皂苷fd，又称绞股蓝皂苷ix、七叶胆苷ix，是从三七提取的一种纯化合物。动物实验表明，三七皂苷fd可以抑制由促炎介质引起的反应性星形胶质细胞增生，进而改善认真障碍。这一新发现为三七皂苷fd在减轻星形胶质细胞介导的神经炎症中的临床应用铺平道路。七叶胆苷xiii，又称绞股蓝皂苷m、人参皂苷mx，七叶胆苷xiii具有出色的抗氧化能力，可通过增强nrf2的核积累来提高细胞保护性抗氧化剂的表达；减少了uvb诱导的抑制nf-κb表达，从而减少过度释放的炎性细胞因子。七叶胆苷xiii是有前途的天然化妆品成分，用于预防和治疗uvb引起的皮肤损伤。
4.市场上三七茎叶主要产品是茶冲剂、化妆品、营养品等，均以其粗提物为原料，资源利用度低，产品技术层次不高。稀有人参皂苷的药理活性越来越受到关注，但天然植物中含量极低、来源受限、难于分离。实验测定三七茎叶提取物中三七皂苷fd和七叶胆苷xiii含量＜0.5％。酶转化法可以通过水解侧链糖基制备稀有人参皂苷，酶法水解三七茎叶中人参皂苷rb3制备三七皂苷fd和七叶胆苷xiii不仅生产效率高，符合国家低能耗、低污染、高效率的政策要求，且有助于植物资源综合利用。
5.目前，酶法水解人参皂苷均采用特异性的酶，比如，申请号为202010653370.0的中国发明专利公开了一种β-葡萄糖苷酶、其编码基因及其表达和应用，采用特定的氨基酸序列酶，转化人参皂苷rb1和人参皂苷rb2等天然化合物在适宜条件下进行转化，去除人参皂苷c20上连接的葡萄糖基。申请号为201911117100.1的中国发明专利公开了一种重组β-葡萄糖苷酶cb-3b及其在生产人参皂苷rg3中的应用。申请号为201510036363.5的中国发明专利公开了一种重组糖苷水解酶用于生物转化制备人参二醇型皂苷的工艺。
6.可见，水解人参皂苷的酶普遍采用特定的基因工程方法制备，其成本较高，且并未发现水解人参皂苷rb3的酶。


技术实现要素：

7.针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种成本较低的制备三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的方法。
8.本发明制备三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.a、水解：调节人参皂苷rb3溶液的ph值为4.5～5.0，然后加入纤维素酶进行水解，得到水解液，其中，人参皂苷rb3溶液的浓度为1～100g/l，纤维素酶的浓度为1～50000u/ml；
10.b、分离纯化：将水解液分离纯化，得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii。
11.在本发明的一个实施方式中，a步骤中，人参皂苷rb3溶液的浓度为2～50g/l。
12.在本发明的一个具体实施方式中，a步骤中，人参皂苷rb3溶液的浓度为2～10g/l。
13.在本发明一些实施方式中，纤维素酶的浓度为10～10000u/ml。在本发明的一些具体实施方式中，纤维素酶的浓度为10～4500u/ml。
14.在本发明的一些实施方式中，a步骤中，水解的时间为2～240h。在本发明优选的一些实施方式中，a步骤中，水解的时间为72～120h。
15.在本发明的一些实施方式中，所述纤维素酶为诺维信纤维素酶、和氏璧纤维素酶、苏柯汉果胶酶、夏盛纤维素酶、天野纤维素酶和赛诺纤维素酶中的至少一种。
16.在本发明的一些实施方式中，a步骤中，人参皂苷rb3溶液的制备方法为：三七茎叶、三七茎叶提取物或纯度为50％以上的人参皂苷rb3加溶剂溶解，得到人参皂苷rb3溶液。本发明的纯度为重量百分数。
17.作为本发明的一种实施方式，所述溶剂为水和有机溶剂，且有机溶剂与水的体积比0～0.25:1。
18.在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂为低级醇或丙酮。
19.在本发明的一些实施方式中，b步骤中，采用凝胶柱层析方法、硅胶柱层析法或hplc纯化法进行分离纯化。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.本发明方法，采用现有的纤维素酶为水解酶，水解人参皂苷rb3，得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii。其工艺简单，成本较低。
22.本发明方法，可以将市售50％的rb3原料中七叶胆苷xiii的含量从＜0.5％，提高到25％以上，三七皂苷fd的含量从＜0.2％提高到25％以上。经过分离、纯化，可以使三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的纯度达到98％以上。本发明方法为三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的制备提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
附图说明
23.图1为实施例1中水解前后纯度98％rb3原料的hplc图，其中，图a为水解前的纯度98％rb3原料的hplc图，图b为水解后的hplc图，图中画圈处为三七皂苷fd。
24.图2为实施例2中水解前后纯度98％rb3原料的hplc图，其中，图a为水解前的纯度98％rb3原料的hplc图，图b为水解后的hplc图，图中划圈处为七叶胆苷xiii。
25.图3为经纯化后的三七皂苷fd的hplc图。
26.图4为经纯化后的七叶胆苷xiii的hplc图。
27.图5为纯化后的三七皂苷fd的核磁图谱(c谱)。图5a、图5b、图5c和图5d均为纯化后的三七皂苷fd的核磁图谱的局部放大图。
28.图6为纯化后的七叶胆苷xiii的核磁图谱(c谱)。图6a、图6b、图6c和图6d均为纯化后的七叶胆苷xiii的核磁图谱的局部放大图。
29.图7为纯化后的三七皂苷fd的质谱图。
30.图8为纯化后的七叶胆苷xiii的质谱图。
具体实施方式
31.本发明制备三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的方法，其特征在于，包括以下步骤：
32.a、水解：调节人参皂苷rb3溶液的ph值为4.5～5.0，然后加入纤维素酶进行水解，得到水解液，其中，人参皂苷rb3溶液的浓度为1～100g/l，纤维素酶的浓度为1～50000u/ml；
33.b、分离纯化：将水解液分离纯化，得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii。
34.本发明方法，采用现有的纤维素酶为水解酶，水解人参皂苷rb3，得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii。其工艺简单，成本较低。
35.其中，人参皂苷rb3的结构如式ⅰ所示，三七皂苷fd结构如式ⅱ所示，七叶胆苷xiii的结构如式ⅲ所示。
36.从结构式可以看出：三七皂苷fd比人参皂苷rb3少一个葡萄糖，七叶胆苷xiii比人参皂苷rb3少两个葡萄糖基。理论上，可以用糖基水解酶、酸或碱水解使人参皂苷rb3的糖基减少。经过大量试验发现，采用酸或碱水解人参皂苷rb3，其目标性不强，容易得到原人参二醇，产品三七皂苷fd和七叶胆苷xiii得率较低，难以满足工业化生产的需要。酶水解因其效率高、污染低逐渐被用到工业化生产中。而现有的酶定向水解，多是通过酶学研究和分子结构优化，采用特定片段的目标基因表达特异性的酶来实现的。本发明的发明人通过大量试验，发现采用纤维素酶，并调整其用量、底物浓度、溶剂组成等，可以定向水解c3位上的葡萄糖基，从而得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii。
[0037][0038]
其中，上述a步骤水解时，若人参皂苷rb3浓度过高，会在溶液中形成分子间氢键，阻碍酶水解效率；若人参皂苷rb3浓度过低，三七皂苷fd和七叶胆苷xiii的产率较低，还会
增加浓缩成本，溶液中的人参皂苷rb3的浓度为1～100g/l较为合适。在其中一个具体的实施方式中，人参皂苷rb3溶液的浓度为2～50g/l。在其中一个具体的实施方式中，人参皂苷rb3溶液的浓度为2～10g/l。在本发明的具体实施方式中，人参皂苷rb3溶液的浓度为2～5g/l。在本发明的具体实施例中，人参皂苷rb3溶液的浓度可以为2g/l、2.5g/l、5g/l、7g/l、8.5g/l、10g/l等。
[0039]
纤维素酶的浓度会影响酶解反应，本发明所述的纤维素酶的浓度为初始浓度。其中，纤维素酶在最适ph值和温度的条件下，1min水解1wt％的β-葡聚糖溶液产生1ug葡萄糖的酶量为1个纤维素酶活力单位u。由于纤维素酶的溶解度有限，加入过多，则会造成浪费；纤维素酶的浓度过低，则水解效率较低，在本发明一些实施方式中，纤维素酶的浓度为10～10000u/ml。在本发明的一些具体实施方式中，纤维素酶的浓度为10～4500u/ml。
[0040]
水解时间影响底物的转化率，在本发明的一些实施方式中，水解的时间为2～240h。在本发明优选的一些实施方式中，水解的时间为72～120h。
[0041]
在本发明的一些实施方式中，所述纤维素酶为诺维信纤维素酶、和氏璧纤维素酶、苏柯汉果胶酶、夏盛纤维素酶、天野纤维素酶和赛诺纤维素酶中的至少一种。
[0042]
a步骤中，人参皂苷rb3溶液可以采用常规方法制备。在本发明的一些实施方式中，人参皂苷rb3溶液采用如下方法制备：三七茎叶、三七茎叶提取物或纯度为50％以上的人参皂苷rb3加溶剂溶解，得到人参皂苷rb3溶液。
[0043]
本发明方法，原料可以为三七茎叶鲜叶、三七茎叶提取物、市售50％rb3的原料或rb3大于98％的高纯度原料。其中，三七茎叶水提取物或低级醇溶液提取物均适用于本发明，即三七茎叶提取物为水提取物或低级醇溶液提取物。
[0044]
其中，所述溶剂可以为常规含水的溶剂，比如水、水和有机溶剂的混合物、或者水与酶解ph值相适应的缓冲液。
[0045]
作为本发明的一种实施方式，所述溶剂为水和有机溶剂。由于人参皂苷rb3在水中溶解度受限制，浓度较高时溶解性不好，所以添加一定比率有机溶剂，有机溶剂添加的种类和添加量以不影响酶的催化效果为准，有机溶剂与水的体积比有机溶剂与水的体积比0～0.25:1。
[0046]
常用的有机溶剂均适用于本发明。在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂为低级醇或丙酮。本发明中，所述低级醇为甲醇、乙醇等。
[0047]
b步骤为分离纯化步骤，从a步骤的水解液中分离纯化，得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii。b步骤中可以采用常规的分离、纯化方法，如：凝胶柱层析方法、硅胶柱层析法和hplc纯化法等，分离、纯化得到高纯度的得到三七皂苷fd和七叶胆苷xiii产品。
[0048]
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0049]
实施例中的转化率采用如下方法计算：
[0050]
转化率(％)＝(水解前人参皂苷rb3的重量-水解后产物中人参皂苷rb3的重量)/水解前人参皂苷rb3的重量
×
100％
[0051]
实施例1
[0052]
称取人参皂苷rb3纯度98％的样品2g，该样品的hplc图见图1。1l水溶解，加入盐酸调节ph值至4.8，加入诺维信纤维素酶，且初始纤维素酶的浓度为10u/ml。反应110h，人参皂
苷rb3的转化率为85.2％，水解后产物的hplc图见图1。测定产物中三七皂苷fd百分含量为56.7％，经过分离纯化有750mg产品入库，产品纯度为98％；七叶胆苷xiii百分含量8.9％，经过分离纯化有84.8mg入库，产品纯度98％。纯化后的三七皂苷fd的hplc图见图3，纯化后的七叶胆苷xiii的hplc图见图4，纯化后的三七皂苷fd的核磁图谱(c谱)见图5，纯化后的七叶胆苷xiii的核磁图谱(c谱)见图6，纯化后的三七皂苷fd的质谱图见图7，纯化后的七叶胆苷xiii的质谱图见图8。
[0053]
实施例2
[0054]
称取人参皂苷rb3纯度98％的样品10g，该样品的hplc图见图2。5l水溶解，加入盐酸调节ph值至5.0，加入夏盛纤维素酶，且初始纤维素酶的浓度为40u/ml。反应72h，人参皂苷rb3的转化率为83.5％，水解后产物的hplc图见图2。测定产物中三七皂苷fd百分含量12％，经过分离纯化有0.79g入库，产品纯度98％；七叶胆苷xiii百分含量为55.3％，经过分离纯化有3.04g产品入库，产品纯度98％。其表征谱图与图3～8类似。
[0055]
实施例3
[0056]
称取人参皂苷rb3纯度50％的样品100g(该样品中三七皂苷fd和七叶胆苷xiii百分含量均《0.5％)，10l水溶解，加入盐酸调节ph值至4.6，和氏璧纤维素酶和天野纤维素酶以质量比1:1复配后加入，且初始纤维素酶的总浓度为4030u/ml。反应72h，人参皂苷rb3的转化率为82.3％，测定产物中三七皂苷fd百分含量为26.7％，经过分离纯化有8.3g入库，产品纯度98％；七叶胆苷xiii百分含量为45.3％，经过分离纯化有11.9g产品入库，产品纯度98％。其表征谱图与图3～8类似。
[0057]
实施例4
[0058]
称取人参皂苷rb3纯度50％的样品1000g(该样品中三七皂苷fd和七叶胆苷xiii百分含量均《0.5％)，200l水溶解，加入盐酸调节ph值至4.8，苏柯汉果胶酶和赛诺纤维素酶以质量比3:1复配后加入，且初始纤维素酶的总浓度为350u/ml。反应72h，人参皂苷rb3的转化率为81.7％，测定产物中三七皂苷fd百分含量为38.5％，经过分离纯化有133.2g入库，产品纯度98％；七叶胆苷xiii百分含量为37.4％，经过分离纯化有108.8g产品入库，产品纯度98％。其表征谱图与图3～8类似。