一种吡咯并嘧啶类化合物的制备方法与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体地，本发明涉及作为jak抑制剂的一种吡咯并嘧啶类化合物的制备方法。


背景技术：

2.janus激酶(jaks)是一种胞质酪氨酸激酶，可传递细胞因子信号。从膜受体到stat转录因子。jak家庭包含四个成员，jak1、jak2、jak3和tyk2。jak-stat通路将来自多种细胞因子，生长因子和激素的细胞外信号传导到细胞核，并且负责数千个蛋白质编码基因的表达。jak-stat途径将胞外信号转化为转录应答涉及几个步骤:1)当细胞表面的细胞因子受体与其各自的细胞因子配体结合后构型发生变化从而引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的jak激酶相互靠近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。2)jak激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”(docking site)，同时含有sh2结构域的stat蛋白被招募到这个“停泊位点”。3)最后，激酶jak催化结合在受体上的stat蛋白发生磷酸化修饰，被激活的stat蛋白离开受体并组成二聚体后,再转移到细胞核内对特定的基因进行转录调节。jak-stat细胞内信号转导服务于干扰素，大多数白介素，以及多种细胞因子和内分泌因子，如epo，tpo、gh、osm、lif、cntf、gm-csf和prl(vainchenker w.e t al.(2008)。
3.jak-1、jak-2和tyk-2在人体各组织细胞中均有表达，jak-3主要表达于各造血组织细胞中，主要存在于骨髓细胞、胸腺细胞、nk细胞及活化的b淋巴细胞、t淋巴细胞中。jak1可与il-10，il-19，il-20，il-22，il-26，il-28，ifn-α，ifn-γ，gp130家族中的il-6以及含γc的其他受体等结合。jak1已成为免疫、炎症和癌症等疾病领域的新型靶点。jak2在包括epo，gh，prl，ifn-γ以及βc家族中的il-3，il-5，gm-csf等多种受体信号调节过程中发挥重要作用。人体中的jak2基因上的一个碱基突变jak2v617f，其与骨髓增生性疾病中的真性红细胞增多症(pv)、特发性血小板增多症(et)、特发性骨髓纤维化(imf)、慢性粒细胞白血病(cml)等的发生密切相关。jak3通过与il-2，il-4，il-7，il-9，il-15，il-21等细胞因子受体复合物中的γ共链(γc)相结合，调节细胞信号传导。jak3或γc突变都可导致重症联合免疫缺陷。jak3活性异常表现为t细胞和nk细胞大量减少、b细胞功能丧失，严重影响免疫系统等的正常生物学功能。基于其功能特点和特殊的组织分布，jak3已成为针对免疫系统相关疾病极具吸引力的药物靶点。tyk2是jak家族中的第1个成员，其可被ifns，il-10，il-6，il-12，il-23，il-27等多种受体激活。在小鼠中，tyk2功能缺失会引起多种细胞因子受体的信号通路发生缺陷，进而导致病毒感染、抗菌免疫功能下降并增加了肺部感染的可能性等(john j.o’shea,2004,nature reviews drug discovery 3,555-564)。不同的jak家族成员选择性地结合在不同的细胞因子受体上，赋予信号传导特异性，从而发挥不同的生理学作用，这种选择性的作用方式使得jak抑制剂可以相对特异性地应用于疾病治疗。如il-2或il-4受体连同共同的γ链与jak1和jak3结合，而具有相同β链的i型受体与jak2结合。使用gp130(糖蛋白130)的i型受体和由杂二聚体细胞因子激活的i型受体优先结合jak1/2和
tyk2。由激素样细胞因子激活的i型受体结合并激活jak2激酶。干扰素的ii型受体结合jak1和tyk2，而il-10细胞因子家族的受体与jak1/2和tyk2结合。上述细胞因子及其受体与jak家族成员的各种特异结合引发不同的生理学作用，为不同疾病的治疗提供可能。将jak1与其它jaks杂二聚化以转导细胞因子驱动的促炎信号传导。因此，预期抑制jak1和/或其它jak对于一系列炎性病症和其它由jak介导的信号转导驱动的疾病是具有治疗益处的(daniella m.schwartz,2017,nature reviews drug discovery 16,843-862。)


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是克服现有的jak抑制剂种类单一的缺陷，本发明提供了一种吡咯并嘧啶类化合物的制备方法，本技术中的吡咯并嘧啶类化合物对jak1、jak2、jak3和tyk2激酶均具有抑制作用，且本技术中的制备方法反应简单、产率高、操作简单、条件温和且具有广泛的工业应用前景。
5.本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题。
6.本发明提供了一种如式i所示的化合物，
[0007][0008]
其中，
[0009]
t1为ch或n；
[0010]
d1为o或c
0-1
烷基；
[0011]
r1为h或c
1-3
烷基，其中所述c
1-3
烷基任选被1、2或3个ra取代；
[0012]
r2为h或c
1-3
烷基，其中所述c
1-3
烷基任选被1、2或3个rb取代；
[0013]
r3选自h、f、cl、br、i、cn和c
1-3
烷基，其中所述c
1-3
烷基任选被1、2或3个rc取代；
[0014]
ra、rb和rc分别独立地选自f、cl、br、i和nh2。
[0015]
本发明的一些方案中，上述r1为h或ch3，其他变量如本发明所定义。
[0016]
本发明的一些方案中，上述r2为h或ch3，其他变量如本发明所定义。
[0017]
本发明的一些方案中，上述r3选自h、f、cl、br、i和cn，其他变量如本发明所定义。
[0018]
本发明的一些方案中，上述r3选自cn。
[0019]
本发明的一些方案中，上述d1选自ch2；t1选自ch。
[0020]
本发明的一些方案中，所述的如式i所示的化合物为
[0021]
本发明提供了一种如式i所示的化合物的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在脱保护试剂存在下，将化合物11进行如下所示的脱保护反应得如式i所示的化合物即可；
[0022][0023]
r1、r2、t1和d1的定义如上所述。
[0024]
所述的脱保护反应的条件和步骤可为本领域该类脱保护反应常规的条件和步骤，本发明优选如下：
[0025]
在所述的脱保护反应中，所述的如式i所示的化合物优选为相应地，化合物11为
[0026]
在所述的脱保护反应中，所述的溶剂可为本领域该类脱保护反应常规的溶剂，优选醚类溶剂、醇类溶剂、砜类溶剂和酰胺类溶剂中的一种或多种，更优选四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、甲醇、乙醇、异丙醇、dmso和dmf中的一种或多种，最优选四氢呋喃。
[0027]
在所述的脱保护反应中，所述的脱保护试剂优选为四丁基氟化铵、氟化铵、四丁基氯化铵和四丁基溴化铵中的一种。
[0028]
在所述的脱保护反应中，所述的化合物11与所述的脱保护试剂的摩尔比可为本领域该类脱保护反应常规的比例，优选1:1～1:5，更优选1:2或1:4
[0029]
在所述的脱保护反应中，所述的溶剂与所述的化合物11的体积质量比优选为1ml/g～15ml/g，更优选5ml/g～10ml/g。
[0030]
在所述的脱保护反应中，反应温度优选60～80℃，更优选70℃。
[0031]
在所述的脱保护反应中，反应以化合物11消失或不再反应为反应终点，反应时间优选12～25小时。
[0032]
所述的脱保护反应结束后可包含后处理，所述的后处理优选包含如下步骤：所述的脱保护反应结束后，加入碱的水溶液，过滤得如式i所示的化合物即可。所述的碱选自无机碱；所述的碱优选为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种，所述的碱的水溶液优选为碳酸氢钠质量分数为10％的水溶液。
[0033]
所述的如式i所示的化合物的制备方法还进一步包括化合物11的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在氨水和碘存在下，将化合物10进行如下所述的氰基化反应，得化合物11即可；
[0034][0035]
r1、r2、t1和d1的定义如上所述，r3为cn。
[0036]
在所述的氰基化反应中，所述的化合物10优选为相应地，所述的化合物11为
[0037]
在所述的氰基化反应中，所述的溶剂可为本领域该类氰基化反应常规的溶剂，优选醚类溶剂，更优选四氢呋喃和/或2-甲基四氢呋喃。
[0038]
在所述的氰基化反应中，所述的碘与所述的化合物10的摩尔比可为本领域该类氰基化反应常规的比例，优选2:1～5:1，更优选3:1。
[0039]
在所述的氰基化反应中，所述的化合物10与所述的氨水的摩尔比可为本领域该类氰基化反应常规的比例，优选1:3～1:12，更优选1:5或1:10。
[0040]
在所述的氰基化反应中，所述的溶剂与所述的化合物10的体积质量比优选为1ml/g～15ml/g，更优选5ml/g～10ml/g。
[0041]
在所述的氰基化反应中，反应温度可为-5～50℃，优选10～40℃，更优选20℃或25℃。
[0042]
在所述的氰基化反应中，所述的氰基化反应以化合物10消失或不再反应为反应终点，反应时间优选1～15小时，更优选2小时或12小时。
[0043]
所述的氰基化反应结束后可包含后处理，所述的后处理优选包含如下步骤：所述的氰基化反应结束后，加入乙酸乙酯和饱和亚硫酸钠溶液，分层，浓缩有机相得化合物11即可。
[0044]
所述的如式i所示的化合物的制备方法还可进一步包括化合物10的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在氧化剂和催化剂存在下，将化合物9进行氧化反应，得化合物10
即可；
[0045][0046]
r1、r2、t1和d1的定义如上所述。
[0047]
在所述的氧化反应中，所述的化合物9优选为相应地，所述的化合物10为
[0048]
在所述的氧化反应中，所述的溶剂可为卤代烷烃类溶剂、醚类溶剂和酯类溶剂中的一种或多种，例如二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸乙酯、四氢呋喃和乙醚中的一种或多种，优选卤代烷烃类溶剂和/或酯类溶剂，更优选为二氯甲烷、二氯乙烷和乙酸乙酯中的一种或多种。
[0049]
在所述的氧化反应中，所述的氧化剂优选为二乙酸碘苯。
[0050]
在所述的氧化反应中，所述的催化剂优选为2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(tempo)。
[0051]
在所述的氧化反应中，所述的化合物9与所述的氧化剂的摩尔比可为本领域该类氧化反应常规的比例，优选1:1～1:3，更优选1:1.1～1:2。
[0052]
在所述的氧化反应中，所述的化合物9与所述的催化剂的摩尔比可为本领域该类氧化反应常规的比例，优选1:0.1～1:1，更优选1:0.1～1:0.5。
[0053]
在所述的氧化反应中，所述的溶剂与所述的化合物9的体积质量比优选为1ml/g～15ml/g，更优选5ml/g～10ml/g。
[0054]
在所述的氧化反应中，反应温度可为-5～50℃，优选10～40℃，例如20℃、30℃或35℃。
[0055]
在所述的氧化反应中，所述的氧化反应以化合物9消失为反应终点，反应时间优选2～30小时，更优选12～24小时，例如5小时、6小时、20小时或24小时。
[0056]
所述的氧化反应结束后可包含后处理，所述的后处理优选包含如下步骤：所述的氧化反应结束后，加碱，过滤，浓缩得所述的化合物10即可。所述的碱优选为三乙胺。
[0057]
所述的如式i所示的化合物的制备方法还可进一步包括化合物9的制备方法，其包括如下步骤：将化合物8和化合物7-1进行如下所示的取代反应，得化合物9即可；
[0058][0059]
x为卤素；
[0060]
r1、r2、t1和d1的定义如上所述；
[0061]
所述的化合物9的制备方法优选包含如下步骤：在溶剂中，在碱存在下，将化合物8和化合物7-1进行取代反应，得化合物9即可。
[0062]
所述的取代反应的条件和步骤为本领域该类取代反应常规的条件和步骤，本发明优选如下：
[0063]
在所述的取代反应中，所述的卤素优选氟、氯、溴或碘，更优选氯。
[0064]
在所述的取代反应中，所述的化合物8优选为
[0065]
在所述的取代反应中，所述的化合物7-1优选为
[0066]
在所述的取代反应中，所述的溶剂可为本领域该类取代反应常规的溶剂，优选砜类溶剂、醚类溶剂、酰胺类溶剂和酯类溶剂中的一种或多种，更优选为乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁醚、二氧六环、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或多种，最优选为二甲基亚砜。
[0067]
在所述的取代反应中，所述的碱可为本领域该类取代反应常规的碱，优选n(c
1-c3烷基)3，所述的c
1-c3烷基优选甲基、乙基、丙基或异丙基。所述的碱优选为n,n-二异丙基乙胺。
[0068]
在所述的取代反应中，所述的化合物8与所述的化合物7-1的摩尔比可为1:1～1:1.5，更优选为1:1.05。
[0069]
在所述的取代反应中，所述的化合物8与所述的碱的摩尔比可为1:2～1:3。
[0070]
在所述的取代反应中，所述的溶剂与所述的化合物8的体积质量比优选为1ml/g～15ml/g，更优选5ml/g～10ml/g。
[0071]
在所述的取代反应中，反应温度可为本领域该类取代反应常规的温度，优选50～150℃，更优选80～130℃(例如100℃、110℃或120℃)，最优选80～100℃。
[0072]
在所述的取代反应中，反应以化合物7-1消失或不再反应为反应终点，反应时间优选4～15小时，更优选6～8小时。
[0073]
所述的取代反应结束后可包含后处理，所述的后处理优选包含如下步骤：所述的取代反应结束后，加水，过滤得所述的化合物9即可。
[0074]
本发明还提供了一种化合物11的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在氨水和碘存在下，将化合物10进行如下所述的氰基化反应，得化合物11即可；
[0075][0076]
r1、r2、d1和t1的定义如上所述；r3为cn。
[0077]
所述的氰基化反应的条件和步骤可如上任一方案所述。
[0078]
本发明还提供了一种化合物10的制备方法，其包括如下步骤：在溶剂中，在氧化剂和催化剂存在下，将化合物9进行氧化反应，得化合物10即可；
[0079][0080]
r1、r2、d1和t1的定义如上所述；
[0081]
所述的氧化反应的条件和步骤可如上任一方案所述。
[0082]
定义和说明：
[0083]
除非另有说明，本文所用的下列术语或短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
[0084]
本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
[0085]
本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
[0086]
下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
[0087]
本发明中，boc：叔丁氧羰基；cbz：苄氧羰基；fmoc：芴甲氧羰基；alloc：烯丙氧羰基；teoc：三甲基硅乙氧羰基；pht：邻苯二甲酰基；tos：对甲苯磺酰基；tfa：三氟乙酰基；trt：三苯甲基；dmb：2,4-二甲氧基苄基；pmb：对甲氧基苄基；mom：甲氧亚甲基，bn：苄基，
thp：四氢吡喃基，tr：三苯甲基，ac；乙酰基，bz：苯甲酰基，piv：特戊酰基，tms：三甲基硅基，tes：三乙基硅基，tbs：叔丁基二甲基硅基，tbdps：叔丁基二苯基硅基，ms：甲磺酰基，ts：对甲苯磺酰基。
[0088]
术语“烷基”是指具有指定的碳原子数的直链或支链烷基。
[0089]
本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。反应一般是在惰性氮气下、无水溶剂中进行的。
[0090]
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0091]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0092]
本发明的积极进步效果在于：本发明的吡咯并嘧啶类化合物对jak1、jak2、jak3和tyk2激酶均具有抑制作用，且本技术中的制备方法反应简单、产率高、操作简单、条件温和且具有广泛的工业应用前景。
具体实施方式
[0093]
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0094]
实施例1
[0095]
化合物12的合成方法如下
[0096][0097]
步骤9：
[0098]
向反应器中加入实施例1中产物8(60g)、式(7-1)化合物(107.0g)、dmso(600ml)、dipea(85.6g)，升温至100-110℃，保温搅拌8h后，降温至20-30℃，加入水(150ml),搅拌1h，过滤，干燥，得到产物9；纯度86％，收率73％；
[0099]
步骤10：
[0100]
向反应器中加入二氯甲烷(200g)、产物9(15g)，2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(tempo，0.52g)、二乙酸碘苯(11.7g)，室温反应10h，反应结束后加入三乙胺(12g)，搅拌1h，过滤，干燥，得到产物10；纯度，96.1％，收率：89％；
[0101]
步骤11：
[0102]
向反应器中加入产物10(73g)、氨水(25ml)、碘(124g)、thf(730ml)，室温下搅拌12h，反应结束后加入乙酸乙酯(100ml)和饱和亚硫酸钠溶液，搅拌0.5h，静置、分层、有机相浓缩，得到产物11；纯度97.1％，收率92％；
[0103]
步骤12：
[0104]
向反应器中加入产物11(11g)、thf(100ml)、tbaf(0.1mol)，升温至70℃，保温反应12h，反应结束后，降温至室温，加入10％nahco 3
水溶液(100ml)，并将混合物在20℃搅拌2h,过滤，干燥，得到产物12，纯度98.6％，收率86％；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ＝12.80-12.56(m,1h),8.43-8.32(m,1h),7.49-7.38(m,1h),7.01-6.88(m,1h),6.88-6.74(m,1h),5.31-5.17(m,1h),4.52-4.36(m,2h),3.45-3.41(m,3h),3.13-3.04(m,1h),3.01-2.91(m,1h),2.38-2.29(m,1h),2.17-2.09(m,1h)。
[0105]
实施例2
[0106]
对实施例1步骤9中的反应进行如表1所示的条件筛选，除筛选的条件外，其它条件如上所述：
[0107]
表1
[0108][0109]
本技术中的10v和5v分别代表：溶剂与原料的体积重量比为10ml/g和5ml/g，例如此处为溶剂与产物8的体积重量比为10ml/g。
[0110]
实施例3
[0111]
对实施例1步骤10中的反应进行如表2所示的条件筛选，除筛选的条件外，其它条件如上所述：
[0112]
表2
[0113]
[0114][0115]
当二氧化锰为氧化剂时，存在后处理不容易、重金属残留、环保、不适用大生产等问题，优化后的氧化剂，具有后处理简单、收率高、绿色环保的优点。
[0116]
实施例4
[0117]
对实施例1步骤11中的反应进行如表3所示的条件筛选，除筛选的条件外，其它条
件如上所述：
[0118]
表3
[0119][0120]
其中，sm代表产物10。
[0121]
实施例5
[0122]
化合物8的制备方法如下：
nmr(400mhz,cdcl3)δ＝6.003(s,1h),5.321(s,1h),5.100-5.078(m,1h),4.738(s,2h),4.321(m,1h),4.212-4.142(m,2h),2.809-2.646(m,2h),1.861-1.826(m,2h),1.491-1.453(s,9h),0.958-0.887(s,9h),0.133-0.110(s,6h)；
[0132]
步骤5：
[0133]
向反应器中加入产物4(40g)、thf(630g)，通入氮气，降温至0-5℃，加入三丁基膦(40g),搅拌，分批加入addp(56g)，升温至室温，保温反应20h，应结束后，过滤，浓缩，得到产物5，收率85.8％，纯度53.3％，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ＝6.007(s,1h),4.876-4.860(m,1h),4.617(m,2h),4.331-4.240(m,2h),3.948-3.901(m,1h),2.878-2.848(m,2h),2.067-2.027(m,2h),1.463(s,9h)；
[0134]
步骤6：
[0135]
向反应器中加入30％(hcl/etoh，180g)，降温至0-5℃，然后加入产物5(160g)，升温至室温，保温反应4h，反应结束后加入无水乙醇(300g)，搅拌12小时，过滤，干燥，得到产物6，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ＝5.870(s,1h),4.320-4.085(s,2h),3.686-3.637(m,2h),2.813-2.771(m,1h),2.630-2.308(m,2h),1.933-1.918(m,3h),1.628-1.594(m,2h)；
[0136]
步骤7：
[0137]
向反应器中加入产物6(32g)、水(320g),碳酸钠溶液(质量分数为10％，180g),搅拌，降温至0-5℃，然后滴加boc酸酐/甲醇溶液(boc酸酐50g，甲醇150g),滴加完毕后，升温至室温，保温反应10h,反应结束后，加入二氯甲烷(300g)，搅拌0.5h，静置、分层、有机相浓缩，得到产物7，收率43.2％，纯度98.5％；
[0138]
步骤8：
[0139]
向反应器中加入thf(90ml),通入氮气，降温至0-5℃，然后加入四氢铝锂(3.4g),升温至50℃，然后滴加产物7/thf溶液(6g/30ml),滴加完毕后，升温至70℃，保温反应3h,反应结束后，降温至5-10℃，加入水(30g)，搅拌，加入氢氧化钠水溶液(质量分数15％，4g),然后加入元明粉(7g),搅拌3小时，过滤，干燥，得到产物8，收率80.9％，纯度98.8％。
[0140]
生物活性测试
[0141]
实验例1：jak1,jak2,jak3,tyk2激酶体外活性测试
[0142]
实验材料
[0143]
重组人源jak1、jak2、jak3、tyk2蛋白酶、主要仪器及试剂均由英国的eurofins公司提供
[0144]
实验方法
[0145]
jak2,jak3和tyk2稀释：20mm 3-(n-吗啉)丙磺酸(mops),1mm edta,0.01％brij-35.5％甘油,0.1％β-巯基乙醇,1mg/ml bsa；jak1稀释：20mm tris,0.2mm edta,0.1％β-巯基乙醇,0.01％brij-35.5％甘油。将所有化合物制备成100％的dmso溶液并达到最终测定浓度50倍。测试化合物进行3倍浓度梯度稀释，终浓度为10μm到0.001μm共9个浓度，dmso在检测反应中的含量为2％。将该化合物的工作储备液作为反应的第一组分添加到测定孔中，然后按照下面测定详述的方案加入其余组分。
[0146]
jak1(h)酶反应
[0147]
jak1(h)与20mm tris/hcl ph7.5,0.2mm edta，500μm mgeeplywsfpakkk，10mm乙酸镁和[γ-33
p]-atp(根据需要制定活性和浓度)一起孵育。添加mg/atp混合物开始反应，在
室温下孵育40分钟后，加入0.5％浓度的磷酸终止反应。然后将10μl反应物点在p30滤垫上并于4分钟内用0.425％磷酸洗涤三次和甲醇洗涤一次，干燥、闪烁计数。
[0148]
jak2(h)酶反应
[0149]
jak2(h)与8mm mops ph 7.0,0.2mm edta,100μm ktfcgtpeylapevr reprilseeeqemfrdfdyiadwc,10mm乙酸镁和[γ-33
p]-atp(根据需要制定活性和浓度)一起孵育。添加mg/atp混合物开始反应，在室温下孵育40分钟后，加入0.5％浓度的磷酸终止反应。然后将10μl反应物点在p30滤垫上并于4分钟内用0.425％磷酸洗涤三次和甲醇洗涤一次，干燥、闪烁计数。
[0150]
jak3(h)酶反应
[0151]
jak3(h)与8mm mops ph 7.0,0.2mm edta,500μm ggeeeeyfelvkkkk,10mm乙酸镁和[γ-33
p]-atp(根据需要制定活性和浓度)一起孵育。添加mg/atp混合物开始反应，在室温下孵育40分钟后，加入0.5％浓度的磷酸终止反应。然后将10μl反应物点在p30滤垫上并于4分钟内用0.425％磷酸洗涤三次和甲醇洗涤一次，干燥、闪烁计数。
[0152]
tyk2(h)酶反应
[0153]
tyk2(h)与8mm mops ph 7.0,0.2mm edta,250μm ggmediyfefmggkkk,10mm乙酸镁和[γ-33
p]-atp(根据需要制定活性和浓度)一起孵育。添加mg/atp混合物开始反应，在室温下孵育40分钟后，加入0.5％浓度的磷酸终止反应。然后将10μl反应物点在p30滤垫上并于4分钟内用0.425％磷酸洗涤三次和甲醇洗涤一次，干燥、闪烁计数。
[0154]
数据分析
[0155]
ic
50
结果由idbs公司的xlfit5(205公式)进行分析得到，具体见表1。
[0156]
表1.本发明化合物体外筛选试验结果
[0157][0158]
结论：本发明的化合物在激酶4个亚型jak1、jak2、jak3和tyk2的体外活性测试中展现了对jak1和/或jak2的良好的选择性抑制。
[0159]
实验例2：渗透性试验
[0160]
实验材料
[0161]
转运缓冲液为hbss(汉克斯平衡盐溶液)和10mm hepes【n-(2-羟乙基)哌嗪-n
′-
(2-乙磺酸)溶液】，ph值为7.40
±
0.05；caco-2细胞从atcc购得。
[0162]
实验方法
[0163]
caco-2细胞以1
×
105细胞/cm2接种于聚乙烯膜(pet)的96孔bd插入板中，每隔4～5天更新一次培养基，直至第21～28天，形成融合细胞单层。试验化合物在2μm处进行双向试验，并设双孔。地高辛双方向10μm，纳多洛尔和美托洛尔双方向2μm。最终dmso浓度调整为小于1％。将培养板在37
±
1℃的co2培养箱中培养2小时，在饱和湿度下用5％浓度的co2培养，不摇晃。所有样品与含内标乙腈混合后，以4000转/分离心10分钟，然后用100微升蒸馏水稀
释100微升上清液进行lc/ms/ms分析。用lc/ms/ms方法，用分析物/内标物的峰面积比，对供试品初始溶液、供试品溶液和受试品溶液中的供试品和对照品浓度进行定量。转运试验后，用荧光素黄排斥反应法测定caco-2细胞单层完整性，并计算了表观渗透系数和外排率。
[0164]
实验结果
[0165]
实验结果见表2-1：
[0166]
表2-1化合物12的渗透性
[0167][0168]
结论：本发明化合物具有特征性的高渗透性，有利于实现良好的靶组织浓度和口服生物利用度。
[0169]
注：nd：未检测到。
[0170]
实验例3：药代动力学(pk)试验
[0171]
将试验化合物溶解后得到的澄清溶液分别经尾静脉注射和灌胃给予雄性小鼠(c57bl/6)或大鼠(sd)体内(过夜禁食，7～8周龄)。给予受试化合物后，静脉注射组(1mg/kg)在0.117,0.333,1,2,4,7和24小时，灌胃组(3mg/kg)在0.25,0.5,1,2,4,8和24小时，分别从下颌静脉采血并离心后获得血浆。采用lc-ms/ms法测定血药浓度，使用winnonlin
tm version 6.3药动学软件，以非房室模型线性对数梯形法计算相关药代动力学参数。测试结果如下：
[0172]
表3-1化合物12在小鼠中的pk测试结果
[0173]
pk参数结果t
1/2
(hr)1.89c
max
(nm)6000auc
0-inf
(nm.hr)12765bioavailability(％)a88.4
[0174]
注：t
1/2
：半衰期；c
max
：达峰浓度；
[0175]
auc
0-inf
：从0时间到外推至无穷大时的血浆浓度-时间曲线下面积；
[0176]
bioavailability：生物利用度。
[0177]
结论：本发明的化合物在小鼠中都有良好的口服生物利用度，较高的暴露量，有利于产生良好的体内药效。
[0178]
实验例4：大鼠佐剂诱导的关节炎(aia)的体内药效研究
[0179]
实验过程：
[0180]
用大鼠佐剂关节炎模型验证本发明化合物的治疗关节炎的作用。雌性,体重160-180克lewis大鼠用异氟烷麻醉后，在左后脚皮下注射0.1ml结核分枝杆菌悬浮液。在造模13天后分组并给予相应的受试化合物，如对大鼠分别给予不同剂量(具体剂量见表4-2，受试化合物12溶解在【5％dmso,95％(12％sbe-β-cd),0.5％mc)】混合溶媒中，并每天2次、口服给予雌性lewis大鼠(每个剂量组的受试动物数为8)。连续给药两周，期间观察大鼠状态，记录足体积肿胀情况并评分，评分标准见表4-1。
[0181]
表4-1.关节炎临床评分标准
[0182][0183]
实验结果：
[0184]
化合物12二个剂量治疗组对动物因发病造成的体重下降趋势有显著的缓解作用，且低、中剂量组(3mg/kg和10mg/kg)从20天与溶剂对照组相比出现显著性差异，显示出良好的体重恢复效果。化合物12抑制了关节炎临床评分和足体积的升高，且此抑制作用呈剂量依赖性。化合物12 10mg/kg的效果最为明显(从15天开始，与溶剂对照组比较有显著性差异)。该组的平均关节炎临床评分由第13天的峰值6分，降至实验终点第27天时的1.4分，且与溶剂对照组比较有显著性差异。
[0185]
表4-2临床评分曲线下面积抑制率(auc)
[0186][0187][0188]
结论：本发明的化合物12在剂量(3mg/kg和10mg/kg)下展示显著的治疗效果(抑制率与溶媒对照组相比p《0.0001)，且本发明的化合物12呈现良好剂量(3mg/kg和10mg/kg)效果的正相关性。
[0189]
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。