一种绿针假单胞菌及其在土壤微生态调控上的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种绿针假单胞菌及其在土壤微生态调控上的应用。


背景技术：

2.随着现代农业的快速发展，大多数的蔬菜以及一些高附加值的经济作物得到集约化发展，高复种指数以及化肥农药的过度使用，导致土壤肥力下降，病虫害发病日益严重。其中连作障碍问题尤为突出，已经严重影响了相关产业的发展。土壤中造成植物连作障碍的因素很多，其中包括大量土传病原菌的富集，其中最常见的主要包括镰孢菌(fusarium spp.)、疫霉菌(phytophthora spp.)、丝核菌(rhizoctonia spp.)、灰霉菌(botrytis spp.)、腐霉(pythium spp.)和轮枝菌(verticillium spp.)和链格孢菌(alternaria spp.)等，这些病原真菌的富集，很容易造成植物的病害发生，协同危害严重。例如镰孢菌就是最常见的优势病原真菌，常会导致番茄等多种蔬菜的枯萎病、猝倒病等植物病害。研究显示，用pda培养基分离番茄根际土壤中的真可培养真菌，80％以上是镰孢菌，虽然多数镰孢菌不会直接侵染发病，但大量的镰孢菌依然对其它有益微生物造成种群竞争压力，更有可能成为机会致病菌，加重危害。
3.设施蔬菜由于常年连作，不合理的肥水管理，造成土壤环境恶化，病害严重。不得不采取非常规措施进行病害控制。例如土壤消毒技术，采用物理、化学以及生物等技术手段对土壤中的微生物进行无选择性灭杀，造成土壤微生态失衡，病原真菌选择富集成为优势种群，造成设施蔬菜病害发生日益严重，不得不依靠化学农药进行预防和控制，导致抗药性，进一步导致病原真菌富集危害，加重连作障碍。利用微生物技术对土壤中的有害生物进行拮抗，降低其种群优势，改善微生态环境，是解决植物连作障碍，减少或替代化学农药的重要手段之一。例如芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌和酵母菌等用于病害防治均有一定的效果，但也存在防病效果不理想，防效不稳定，难以替代化学杀菌剂的困境。挖掘更广谱、更高效的生防菌，通过调整土壤微生物种群组成，降低有害微生物的种群优势，对于蔬菜土传病害控制具有重要的意义。


技术实现要素：

4.针对国内设施蔬菜土壤中存在的微生态失衡，土传病害发病日益严重等实际问题，本发明提供了一种可调控土壤微生态环境的假单胞菌及应用技术，本发明的假单胞菌菌株分离筛选自设施蔬菜土壤，对土壤的理化环境具有更好的适应性，可对土壤中镰孢菌等多种常见病原真菌有强抑制作用，可有效降低其种群优势，达到预防和减少病害的效果。
5.第一方面，本发明提供的一种绿针假单胞菌，该菌株为绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)p2-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23576，保藏日期为2021年10月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
6.本发明的绿针假单胞菌菌株p2-1分离自山东设施蔬菜大棚土壤，将该菌株16s rdna序列提交ncbi blast进行相似性比较，与绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)模式菌株2a(genbank:gq906975)相似性达99.86％，结合形态学特征，鉴定该细菌菌株为绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)，16s rdna序列已经提交到了genbank数据库，登录号：ok626337。
7.另一方面，本发明提供的一种绿针假单胞菌p2-1在设施蔬菜土壤微生态调控上的应用。
8.所述的对土壤微生态调控，是对土壤中镰刀菌(fusarium spp.)、疫霉菌(phytophthora spp.)、丝核菌(rhizoctonia spp.)、灰霉菌(botrytis spp.)、腐霉(pythium spp.)和轮枝菌(verticillium spp.)及链格孢菌(alternaria spp.)中的一种或多种病原真菌种群进行种群调控。绿针假单胞菌能改变土壤微生物种群组成，降低土壤中镰孢菌等有害病原真菌的种群优势，实现对土传病害的生物预防和控制。
9.本发明将绿针假单胞菌p2-1制成可湿性粉剂，可湿性粉剂中有效活菌数≥20
×
108cfu/g。
10.所述可湿性粉剂的制备包括以下步骤：
11.a.将绿针假单胞菌p2-1接种到培养基中活化；
12.b.制备液体发酵培养基：玉米粉60g、豆饼粉10g、葡萄糖15g、硫酸铵2g、碳酸钙2g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.5g、硫酸镁0.5g，水1000ml，ph 7.2-7.4，121℃湿热灭菌60min，冷却备用；
13.c.将步骤a活化后的种子液接种到步骤b的液体发酵培养基上培养；
14.d.将步骤c培养后的发酵液用灭菌的硅藻土或草炭土吸附，即得可湿性粉剂。
15.进一步的，所述步骤a中，使用na培养基活化绿针假单胞菌p2-1，na培养基组成：牛肉膏3.0g，蛋白胨10g，nacl 5g，琼脂粉15g，水1000ml，ph 7.2-7.4；或使用lb培养基活化绿针假单胞菌p2-1，lb培养基组成：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 5g，水1000ml，ph 7.2-7.4。
16.进一步的，所述步骤a中，活化条件：28-30℃，180r/min振荡培养24h，得种子液。
17.进一步的，所述步骤c中，种子液接种到液体发酵培养基的接种比例为5％。
18.进一步的，所述步骤c中，培养条件：罐压0.04-0.06mpa，温度28-30℃，搅拌转速120-150r/min，通气量按1：0.8-1：1.2，培养36-48h。
19.进一步的，所述步骤d中，将发酵液用灭菌的硅藻土或草炭土按15-20％的比例吸附。
20.本发明将绿针假单胞菌p2-1制成发酵液，将发酵液稀释500倍，对蔬菜植株进行灌根处理，间隔7天施用一次，连续2-3次。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明提供的生防假单胞菌，具体为绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)p2-1，该菌株在土壤中有较高的分离频率，其对集约化设施栽培土壤环境具有很强的适应性，通过对镰刀菌(fusarium spp.)、疫霉菌(phytophthora spp.)、丝核菌(rhizoctonia spp.)、灰霉菌(botrytis spp.)、腐霉(pythium spp.)和轮枝菌(verticillium spp.)及链格孢菌(alternaria spp.)较强的抑制作用，从而调控土壤微生物种群结构及丰富度，可有效降低其种群优势，预防或减少病害的发生，替代化学杀菌剂的使用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1是实施例2中绿针假单胞菌p2-1对尖孢镰孢的抑菌效果图。
25.图2是实施例5中绿针假单胞菌p2-1对番茄根际土壤真菌在属水平的菌群组成影响图。
具体实施方式
26.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.菌株的分离
29.本发明采用的微生态调控菌株为绿针假单胞菌，是从设施番茄土壤中分离筛选，具体步骤为采集番茄根围土样，稀释106倍，取1ml涂na固体培养基平板，28℃培养2-3天，挑取细菌菌落，依次与尖孢镰孢(fusarium oxysporum)、瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)、大丽轮枝菌(verticillium dahliae)、疫霉菌(phytophthora capsici)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、链格孢菌(alternaria solani)及灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)，对峙培养，筛选对几种病原真菌有广谱抑菌活性的菌株。挑取对所有供试病原真菌均有较强抑菌活性的菌株p2-1，16s rdna序列提交ncbi blast进行相似性比较，与绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)模式菌株2a相似性达99.86％，结合形态新特征，鉴定该细菌菌株为绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)，16s rdna序列已经提交到了genbank数据库，登录号：ok626337。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23576，保藏日期为2021年10月12日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
30.实施例2
31.本发明绿针假单胞菌p2-1对几种植物病原真菌的对峙抑菌试验
32.步骤一：分别将保存的几种土传病原真菌，如立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、尖孢镰孢(fusarium oxysporum)、瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)、腐皮镰孢菌(fusarium solani)、大丽轮枝菌(verticillium dahliae)、疫霉菌(phytophthora capsici)、链格孢菌(alternaria solani)及灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)，接种在pda培养基上活化2d；
33.步骤二：用灭菌的直径5mm的打孔器各病原真菌菌落边缘打取菌苔，分别移置于直径9cm的na培养基(蛋白胨10g，nacl 5g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，水1000ml，ph7.2)平板上，同时将绿针假单胞菌p2-1用牙签挑取少许点平板另一侧(与病原真菌菌饼6cm)，25℃条件下对峙培养，每处理重复3次，以只接病原菌的为对照；
34.步骤三：待对照病原菌菌落快长到链霉菌接菌点时，测量各自菌落的半径，并计算抑制率。
35.表1-绿针假单胞菌p2-1对几种土传植物病原真菌的对峙试验
[0036][0037]
通过表1可以看出，通过绿针假单胞菌p2-1处理后，病原菌菌落半径大大减小，绿针假单胞菌p2-1尤其对立枯丝核菌、尖孢镰孢、瓜果腐霉、大丽轮枝菌有较强的抑菌率。
[0038]
实施例3
[0039]
制备可湿性粉剂
[0040]
a.将绿针假单胞菌p2-1接种到lb培养基活化；
[0041]
所述lb培养基组成：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl 5g，水1000ml，ph 7.3；
[0042]
活化条件：30℃，180r/min振荡培养24h，得种子液。
[0043]
b.制备液体发酵培养基：玉米粉60g、豆饼粉10g、葡萄糖15g、硫酸铵2g、碳酸钙2g、磷酸氢二钠2g、硫酸亚铁0.5g、硫酸镁0.5g，水1000ml，ph 7.3，121℃湿热灭菌60min，冷却备用。
[0044]
c.将步骤a的种子液按5％的比例接种到步骤b的液体发酵培养基上，罐压0.05mpa，温度30℃，搅拌转速120r/min，通气量按1：1，培养45h。
[0045]
d.将发酵液用灭菌的硅藻土或草炭土按18％的比例吸附，即得可湿性粉剂。
[0046]
实施例4
[0047]
本发明可湿性粉剂对番茄盆栽试验
[0048]
土壤取自山东济阳某日光温室，试验前接种各种病原菌，常温下保湿培养30天后进行盆栽试验。试验用一次性纸杯(9cm
×
7.3cm
×
7.3cm)，每个纸杯装干土150g。将绿针假单胞菌p2-1用可湿性粉剂用清水稀释500倍，加入带土纸杯，以完全浸透盆内土壤且不外溢为准，间隔7天，连续3次。以不加菌剂的为对照，每处理20次重复，每盆种番茄种子5粒(出苗后统一留下2棵)。温室培养30天，统计番茄病害发病率，计算防病效果。
[0049]
将番茄连根拔起，取根际土壤，用无菌水依次稀释10、100、1000倍，各取1ml稀释液涂pda培养基平板，各稀释梯度设10重复，28℃培养2-4天，挑取所有真菌菌落，转接pda培养
基上培养，根据供试植物病原真菌的菌落特征，统计其分离频率，估算种群密度。
[0050]
表2-盆栽条件下绿针假单胞菌对番茄几种土传病害的防治效果
[0051][0052][0053]
通过表2可以看出，通过绿针假单胞菌p2-1灌根处理后，大大降低了番茄的病株率，提高了防效，增强了对植物病原真菌的抑制率。
[0054]
实施例5
[0055]
本发明对土壤真菌组成及多样性影响试验
[0056]
土壤取自山东济阳某日光温室。试验用一次性纸杯(9cm
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7.3cm
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7.3cm)，每个纸杯装干土150g。将绿针假单胞菌可湿性粉剂用清水稀释500倍，加入带土纸杯，以完全浸透盆内土壤且不外溢为准，以不加菌剂的为对照，每处理6次重复，每盆种番茄种子2粒)。温室培养30天，取番茄根际土壤，测定微生物组成及多样性，结果如图2所示。施用本发明可湿性粉剂能显著改变根际土壤中的微生物种群相对丰富度，对微生态环境具有调节作用。
[0057]
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。