丹参转录因子SmbHLH124在提高丹参毛状根产量性状中的用途的制作方法

丹参转录因子smbhlh124在提高丹参毛状根产量性状中的用途
技术领域
1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及丹参转录因子smbhlh124在提高毛状根产量性状中的用途。


背景技术：

2.丹参(salvia miltiorrhiza bunge)是一种使用历史悠久的药用植物，长期记载于《中国药典》中，以根和根茎入药，其药材和制剂在临床上广泛得以应用。丹参酮类化合物是丹参中的脂溶性有效成分，代表性成分有隐丹参酮(cryptotanshinone，cts)、二氢丹参酮(dihydrotanshinone，dts)、丹参酮ⅰ(tanshinone i，tsi)和丹参酮ⅱa(tanshinone ii a，tsa)，在心血管疾病、抗炎和免疫、抗肿瘤、肝保护、神经保护等多方面有明确的药效作用(刘慧颖，2016)。
3.丹参毛状根和其他植物毛状根一样，具有生长速率快、高度分叉、激素自养等特点，是生产丹参中活性成分理想的药源原料之一。在毛状根培养过程中，改变培养条件或利用相关生物技术手段以期提高毛状根中次生代谢产物的积累已经成为研究热点。应用生物技术方法来提高次生代谢产物产量常见的基因工程手段有：构建过表达及反义抑制载体技术，遗传转化丹参获得毛状根。但是目前还有较大的提升空间。
4.碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋(bhlh)类转录因子作为植物中最大的转录因子家族之一，在调节植物生长发育、代谢、应对生物及非生物胁迫等生理过程中都起着重要的作用。目前，丹参中bhlh类转录因子家族的成员众多，smbhlh1，smbhlh 3，smbhlh 53，smbhlh 10等成员有报道对次生代谢产物生物合成方面有一定的调控作用，但未见对丹参毛状根生长量提高的报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提高丹参毛状根的产量性状。
6.本发明解决技术问题的技术方案是提供了丹参转录因子smbhlh124或其编码dna分子在提高丹参毛状根产量性状中的用途。
7.其中，上述用途中所述的丹参转录因子smbhlh124的氨基酸序列为seq id no.10所示。
8.其中，上述用途中所述的丹参转录因子smbhlh124编码dna分子的核苷酸序列为seq id no.1所示。
9.其中，上述用途中所述的毛状根产量性状为毛状根的生物量和/或毛状根的丹参酮含量。
10.其中，上述用途中所述的丹参酮为丹参酮ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮ⅰ或丹参酮ⅱa中的至少一种。
11.本发明同时还提供了提高丹参毛状根产量性状的方法。该方法包括以下步骤：
12.a、构建表达丹参转录因子smbhlh124的编码基因的过表达载体；
13.b、用步骤a得到的过表达载体转化丹参，获得遗传转化的丹参毛状根；
14.c、对步骤c得到的转化毛状根进行筛选鉴定，筛选出过表达丹参转录因子smbhlh124的编码基因的毛状根；
15.d、对过表达丹参转录因子smbhlh124的编码基因的毛状根进行液体培养，得到产量性状提升的毛状根。
16.其中，上述方法中所述的丹参转录因子smbhlh124的氨基酸序列为seq id no.10所示。
17.进一步的，上述方法中所述的丹参转录因子smbhlh124的编码基因的核苷酸序列为seq id no.1所示。
18.进一步的，上述方法中遗传转化的方法可为电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、脂质体介导法、peg介导法和病毒介导法中的至少一种。
19.其中，上述方法中所述的毛状根产量性状为毛状根的生物量和/或毛状根的丹参酮含量。
20.进一步的，上述方法中所述的丹参酮为丹参酮ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮ⅰ或丹参酮ⅱa中的至少一种。
21.本发明的有益效果在于：本发明创造性地发现使smbhlh124基因过表达能得到生长量和丹参酮含量增加的毛状根。进而本发明针对丹参毛状根体系，构建了过表达smbhlh124基因载体。实验表明，本发明方法能够提高smbhlh124基因在丹参根中的表达，从而使得毛状根的生物量和丹参酮含量明显增加，有效提高丹参毛状根的产量性状。本发明为丹参酮药源生产提供理想材料，在解决丹参酮类化合物药源不足问题上具有很好的应用前景。
附图说明
22.图1、smbhlh124 cdna克隆。
23.图2、smbhlh124过表达载体构建。a，plxp003载体示意图；b，plxp003载体构建菌落pcr电泳图。
24.图3、毛状根遗传转化流程。a，诱导出根培养；b，诱导出根培养15天；c，继代培养0天；d，继代培养20天。
25.图4、过表达smbhlh124根系的鉴定。a，根系rolc基因鉴定；b，过表达smbhlh124根系的阳性鉴定。m，markers；pc，阳性对照；nc，阴性对照，6、29、39、41、43等数字分别代表经过筛选培养之后还存活的过表达smbhlh124的根系。
26.图5、对照根系与过表达smbhlh124根系生长情况对比。a，对照根系与过表达smbhlh124根系液体培养45天后表型图；b，c，生长量数据统计分析。c58c1
‑
7，对照根系；plxp003
‑
6，
‑
39，
‑
41，为过表达根系。
27.图6、过表达smbhlh124对丹参毛状根中几种丹参酮含量。a，二氢丹参酮ⅰ平均值(mg/g)；b，丹参酮平均值(mg/g)；c，丹参酮ⅰ平均值(mg/g)；d，丹参酮ⅱa平均值(mg/g)。
具体实施方式
28.本发明为了得到生长量和丹参酮等产量性状提升的丹参毛状根，在先前报道的全基因组范围内对丹参bhlh转录因子家族成员进行鉴定分析。预测其中的smbhlh124可能参与丹参酮生物合成调控。
29.在此基础上本发明构建得到了能过表达上述转录因子smbhlh124基因的表达载体并转入到农杆菌中，通过农杆菌介导的方法获得过表达smbhlh124的毛状根材料。结果发现获得的过表达smbhlh124的毛状根生长量和丹参酮含量均增加。即得到了丹参转录因子smbhlh124及其编码基因在提升丹参毛状根的产量性状中的新用途。
30.本发明同时还提供了提高丹参毛状根产量性状的方法。该方法包括以下步骤：
31.a、构建表达丹参转录因子smbhlh124的编码基因的过表达载体；
32.b、用步骤a得到的过表达载体转化丹参，获得遗传转化的丹参毛状根；
33.c、对步骤c得到的转化毛状根进行筛选鉴定，筛选出过表达丹参转录因子smbhlh124的编码基因的毛状根；
34.d、对过表达丹参转录因子smbhlh124的编码基因的毛状根进行液体培养，得到产量性状提升的毛状根。
35.其中，上述的过表达载体可根据常见的表达载体进行构建。在本发明的一个实例中，使用了载体pgsd
‑
av3。
36.使用上述过表达载体转化丹参，获得遗传转化的丹参毛状根的过程，可以使用本领域的各种转化方法。
37.比如，可使用农杆菌介导的遗传转化方法。农杆菌可以使用本领域常用的种类，比如c58c1或lba4404等。
38.具体而言，本发明技术方案中提高丹参毛状根产量性状的方法可参照以下方法具体进行：
39.(1)smbhlh124基因片段的获得
40.根据已经公布的丹参基因组和转录组数据中smbhlh124基因的序列信息设计特异引物smbhlh124
‑
f和smbhlh124
‑
r，其序列如seq id no.2和seq id no.3所示，以一年生丹参地下根的cdna(20ng/μl)为模板，进行smbhlh124基因片段扩增。
41.(2)smbhlh124过表达载体的构建
42.将获得的smbhlh124基因片段，通过golden gate的方式将组装至载体pgsd
‑
av3上，构建好的重组载体转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单克隆，用引物tc013
‑
f(引物序列如seq id no.4)和tc013
‑
r(引物序列如seq id no.5)进行pcr检测并将质粒进行sanger测序验证，获得丹参smbhlh124的过表达载体plxp003，将plxp003转化至农杆菌c58c1中，获得用于丹参毛状根遗传转化含有smbhlh124基因植物过表达载体的农杆菌菌株。
43.(3)丹参毛状根遗传转化
44.植物过表达载体plxp003由农杆菌c58c1介导的丹参毛状根遗传转化、筛选、获得转化子。
45.外植体准备：选取健壮的丹参无菌苗中部叶片深绿色健康叶片，切成约0.5cm
×
0.5cm的叶盘备用。
46.农杆菌侵染：将培养好的农杆菌离心收集菌体，用等体积的ms 200μm乙酰丁香酮
buffer 5μl，kpni(1u/μl)1μl，psti(1u/μl)1μl，片段/骨架载体(300μg)10μl，ddh2o 33μl。37℃，酶切1.5h。将回收到的酶切后smbhlh124 cdna片段与骨架载体pge01进行t4连接。t4连接体系：10
×
t4 ligase buffer 2μl，t4 ligase1μl，smbhlh124 cdna片段2μl，pge01(已酶切)3μl，ddh2o 12μl。t4连接反应条件：25℃，连接12h。待连接结束后，依次进行大肠杆菌dh5α转化、菌落pcr、质粒提取和测序验证。其中菌落pcr所使用的引物
‑
f：smbhlh124
‑
f(序列如seq id no.2)，引物
‑
r：smbhlh124
‑
r(序列如seq id no.3)。测序结果表明，中间载体pge01
‑
bhlh124构建成功。
59.(3)过表达载体plxp003组装
60.通过golden gate的方式将smbhlh124的cdna组装到pgsd
‑
av3骨架载体上。pgsd
‑
av3骨架载体是一种t
‑
dna载体，全长7050bp，其中265
‑
289是转移dna左边界重复序列；340
‑
350、976
‑
986是bsai识别及切割位点；351
‑
975是大肠杆菌毒性基因，用于筛选克隆；987
‑
1022是多克隆位点；1037
‑
1061是转移dna右边界重复序列。golden gate反应体系为：t4 dna连接酶缓冲液(10x)2μl，t4 dna连接酶1μl，限制性内切酶bsai1μl，pgsd
‑
av3(65ng/μl)1.5μl，ppe
‑
camv35s(140ng/μl)1μl，pte
‑
35st(35ng/μl)1μl，pge01
‑
bhlh124(100ngμl)1μl，se01
‑
nptii(200ngμl)1μl，ddh2o 10.5μl。golden gate反应程序为：(37℃5min，16℃10min)15个循环，37℃10min，65℃10min，4℃/10min。待反应结束后，依次进行反应产物大肠杆菌dh5α转化、菌落pcr、质粒提取和测序验证。其中菌落pcr所使用的引物
‑
f为tc013
‑
f(引物序列如seq id no.4)，引物
‑
r为tc013
‑
r(引物序列如seq id no.5)。
61.(4)质粒转化大肠杆菌杆菌感受态细胞
62.将大肠杆菌dh5α感受态细胞置于冰上融化，加入上述20ul连接产物，轻弹混匀，冰浴30min。42℃热激1min，置于冰上冰浴2min。加入500μl lb液体培养基，37℃，200rpm震荡孵育45min。后12000rpm离心2min，弃去400μl上清，用移液枪轻轻吹打重悬菌体。全部菌液涂布于lb固体培养基(含有50mg/l kan)，37℃正置培养1h后，倒置培养12～16h。
63.(4)菌落pcr
64.用灭菌牙签挑取lb平板上的单克隆，置于含50μl ddh2o水中，取1ul此菌液作为模板进行pcr扩增。采用25ul体系，体系如下：10
×
pcr buffer 2.5μl，dntp 0.5μl，引物
‑
f 0.5μl，引物
‑
r 0.5μl，taq dna enzyme 0.2μl，template 1μl，ddh2o 19.8μl。pcr程序为：94℃，2min
→
(94℃，30s
→
55℃，30s
→
72℃，30s)35个循环
→
72℃，5min
→
4℃，10min(taq dna enzyme，dntp等购自天根生物公司)。pcr产物，在1％琼脂糖凝胶中，130v，30min电泳检测,电泳图见图2b。
65.(5)质粒提取及测序验证
66.将电泳检测的阳性菌株，50μl菌液加入至4
‑
5ml培养基进行扩大培养12
‑
16h，提取质粒。质粒dna的提取按照axygen axypreptm plasmid miniprep kit说明书进行。提取的质粒送上海生工公司进行测序验证，测序结果表明，过表达载体plxp003构建成功，构建的plxp003载体结构示意图见图2a。
67.实施例2农杆菌介导的丹参毛状根遗传转化
68.农杆菌介导的丹参毛状根遗传转化参考文献(toki等，early infection of scutellum tissue with agrobacterium allows high
‑
speed transformation of rice.the plant journal,2006,47(6):969
‑
976.)中公开的方法。丹参的遗传转化步骤具
体如下，流程示意图见图3：
69.(1)农杆菌准备
70.用接种环挑取
‑
80℃保存的携带目标载体plxp003的根癌农杆菌c58c1(上海泰坦科技股份有限公司)，在lb 50mg/l kan 50mg/l rif平板上划线倒置于28℃培养箱，培养48h；用牙签挑取上述lb平板上的单菌落，接种于含5ml lb 50mg/l kan 50mg/l rif液体培养基的试管(或10ml ep管)中，28℃，180rpm活化培养48h；侵染当天按1:20至1:50比例，吸取上述菌液接入含50ml lb液体培养基的100ml或250ml三角瓶中，28℃，180rpm扩大培养约4
‑
6h至od600＝0.5。
71.(2)外植体准备
72.选取健壮的丹参无菌苗中部叶片(中部深绿色健康叶片，过嫩或过老的叶片均会影响转化效率)，于超净工作台上用锋利的刀片(新刀片为宜)去掉主叶脉和叶片边缘，切成约0.5cm
×
0.5cm的叶盘，放入无菌水或ms液体培养基中保持湿润备用。
73.(3)农杆菌侵染
74.培养好的农杆菌转入灭菌离心管中，常温下4200rpm离心10min收集菌体，用等体积的ms 200μm乙酰丁香酮液体培养基重悬菌体；取出备好的叶盘，浸泡于上述重悬菌液中，侵染30min，适当轻轻振荡保证叶盘完整浸没在菌液中。
75.(4)共培养(2d)：
76.倾去菌液，用无菌水冲洗叶片2
‑
3次，用无菌吸水纸彻底吸干叶盘表面菌液(尽量吸干)，将叶盘正面向上接入表面铺有一层滤纸的smccm上，25℃暗培养60h。
77.(5)诱导培养(20d)：
78.将叶盘正面向上接入诱导培养基smhrm(1/2ms 500mg/l cef 50mg/l kan)中，25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期，持续培养20d。约5
‑
10d左右开始长出白色毛状根，标记出根的顺序，20d时将长约1
‑
2cm、旺盛生长的毛状根从叶片边缘切下，接入筛选培养基中筛选，每皿5
‑
7根。
79.(6)筛选培养(20
‑
30d，筛选2
‑
3次)：
80.从叶盘上切取3
‑
5cm长的根系，整齐摆放转入筛选培养基smssm(b5 500mg/l cef 50mg/l kan)，并标记根尖起始位点，置于25℃黑暗条件下连续培养。每10
‑
15d继代1次，共继代1
‑
2次，计培养20
‑
30d。在这个过程中，有的根系有明显的生长；有的根系会停止生长，根尖出现褐化现象。取有生长的根系进行下一步的实验。
81.实施例3丹参过表达smbhlh毛状根的分子鉴定
82.(1)丹参毛状根基因组dna提取
83.丹参毛状根dna提取采用ctab法，具体操作步骤如下：
84.ctab提取液于65℃水浴锅中预热。取单根远离根尖部位1
‑
2cm放入带钢珠的2ml的离心管中，放入液氮速冻，后震荡成粉末状。加入500μl预热的ctab提取液，65℃水浴30～50min，期间充分混匀。加入500μl氯仿：异戊醇(24︰1)，充分颠倒混匀，室温，12000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀，
‑
20℃沉淀1h。室温，12000rpm离心10min，收集沉淀。去上清，75％乙醇漂洗，12000rpm离心2min。去掉上清，室温晾干dna。加入30μl ddh2o溶解dna，
‑
20℃冰箱中保存待用。
85.(2)丹参毛状根转基因阳性检测
86.使用发根质粒载体上含有的特异性引物rolc
‑
f(引物序列如seq id no.6)ctcctgacatcaaactcgtc和rolc
‑
r1(引物序列如seq id no.7)gctgctgtacctctacgtcga和plxp003上含有的特异性引物：bhlh124
‑
f2(引物序列如seq id no.8)ggcaatctggatcttcaagaatc与npt
ⅱ‑
r2(引物序列如seq id no.9)tgtgcccagtcatagccg扩增目的片段检测转基因阳性，扩增片段大小为400bp左右，pcr扩增体系及反应程序同前菌落pcr。结果表明所检测的再生植株均为阳性植株(参见图4)。
87.实施例4丹参过表达smbhlh毛状根系的生物量分析
88.(1)丹参毛状根液体培养
89.在经过鉴定的过表达smbhlh124和c58c1材料中，每一个根系选取10根3
‑
5cm左右的丹参毛状根(生长状态相似)接种于在含有100ml液体1/2b5培养基的250ml锥形瓶中进行液体培养(每个根系重复培养三瓶)，使用黑色遮光布包裹锥形瓶，将其避光培养在设置为25℃，150rpm的恒温摇床中，每15天记录一次毛状根的生长情况，直到培养至45天时，结束液体培养。(参见图5a)
90.(2)丹参毛状根生物量分析
91.液体增殖培养45天后收获毛状根，使用吸水纸尽量吸干表面水分，在精密度为万分之一的天平上称量其鲜重，结果发现，过表达毛状根系与对照根系相比，鲜重有明显提高(参见图5b)。
92.将收获的毛状根在40℃烘箱烘干至恒重后，使用万分之一天平称量获得其干重，结果发现，过表达毛状根系与对照根系相比，干重有明显提高(参见图5c)。
93.实施例5丹参过表达smbhlh毛状根系丹参酮含量检测
94.(1)丹参毛状根中丹参酮的提取
95.将培养在100ml液体培养基中45天的丹参毛状根，40℃烘干至恒重。在研钵中研磨成粉后，精密称量0.050g的丹参毛状根细粉加入10ml的容量瓶中，在容量瓶中加入8ml 80％甲醇(80％甲醇，20％水)，25℃超声提取60min，使用80％甲醇定容至10ml，混匀后使用定量滤纸过滤，收集滤液；再用0.34μm滤膜过滤进自动进样器瓶中，待上机检测。
96.(2)hplc检测丹参毛状根中丹参酮的含量
97.使用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，hplc)测定丹参毛状根样品中丹参酮的含量。检测条件如下：
98.液相色谱：waters e2695 hplc
99.检测器：waters 2489uv/vis detector
100.色谱柱：venusil xbp c18(l)(4.6*250mm；5μm；150a)
101.流动相：0.02％磷酸水溶液为流动相a(水相)，100％乙腈为流动相b(有机相)
102.流速：1m l/min
103.柱温：35℃
104.检测波长：270nm
105.进样量：20μl
106.梯度洗脱条件如下：0
‑
5min：5％乙腈
‑
10％乙腈；5
‑
15min：10％乙腈
‑
20％乙腈；15
‑
50min：20％乙腈
‑
60％乙腈；50
‑
65min：60％乙腈
107.对照品溶液的配制：精密称取四种丹参酮：丹参酮ⅰ(t
‑ⅰ
)、隐丹参酮(ct)、二氢丹
参酮ⅰ(dtⅰ)和丹参酮ⅱa(t
‑ⅱ
a)的对照品各5mg于6个10ml容量瓶中，分别溶解于80％甲醇中，定容至10ml，得到500μg/ml的对照品母液。使用母液按需配制适合浓度的对照品工作液。
108.标准曲线绘制：在上述色谱条件下对4种对照品的工作液进行测定——配制一系列梯度浓度的对照品工作液，分别测定其峰面积，以各对照品的进样量x(μg或者ng)为横坐标，峰面积y(μv
·
s)为纵坐标，进行线性回归，绘制丹参酮标准曲线。
109.成分含量测定：按上述色谱条件测定样品的峰面积，使用外标法计算对照根系c58c1与过表达smbhlh124根系中的各种丹参酮的含量。
110.实验结果(图6)表明，相对于c58c1，三个过表达smbhlh124的丹参毛状根根系中二氢丹参酮ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅰ和丹参酮ⅱa的含量分别增加了3.05
‑
3.69倍，1.93
‑
2.70倍，1.68
‑
2.13倍和1.07
‑
1.82倍。
111.以上实例表明，我们从丹参根中克隆获得了转录因子基因smbhlh124，构建获得过表达smbhlh124的载体。利用根癌农杆菌(c58c1)介导的遗传转化方法，获得过表达smbhlh124的转基因毛状根根系。实验结果发现，相对于对照根系，过表达smbhlh124的根系的鲜重和干重明显增加。同时，过表达smbhlh124的根系中的二氢丹参酮ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅰ和丹参酮ⅱa等主要的丹参酮成分的含量也都明显得到了提高。