PPARγ蛋白的第166位苏氨酸磷酸化修饰及其应用

ppar
γ
蛋白的第166位苏氨酸磷酸化修饰及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及pparγ thr166磷酸化修饰作为代谢性疾病用药标志物的用途，并涉及通过干预pparγ thr166磷酸化调控代谢性紊乱的治疗方法及可用于干预的小分子化合物信息。


背景技术：

2.pparγ是ii型糖尿病临床治疗的药物靶点，亦是一种可用于调控多种代谢性疾病、炎症及肿瘤的关键控制因子。pparg基因可通过启动子选择形成两种变体：pparγ1与pparγ2。 pparγ2比pparγ1在n端多出30个氨基酸，其余序列完全一致。通常情况下，我们统称为 pparγ，氨基酸位点信息一般指的是pparγ2中的对应的氨基酸位点。(后续为表述方便，统称为pparγ，氨基酸位点的数字代表pparγ2中的氨基酸位点)
3.pparγ的激动可以促进细胞内胰岛素敏感性基因及糖脂代谢相关基因的表达，抑制炎性相关基因的表达。pparγ的完全激动剂噻唑烷二酮类(tzds)药物可以非常显著的增强 ii型糖尿病患者的胰岛素敏感性，降低血糖。同时，这种激动作用可以降低代谢紊乱的器官及组织中的炎性细胞的浸润，增强免疫调控性细胞的活力，以此维持机体的代谢和免疫稳态。但是，tzds类药物，如罗格列酮，会引起强烈的副作用，主要包括：水钠潴留、体重增加、心脑血管问题等。这些现象的背后体现出对该药物靶点的生物学功能的研究的不足。因此，寻找pparγ特异性激活的控制开关，并以此设计筛选和开发新型的小分子调节剂可带动相关疾病治疗的革新。
4.磷酸化是最主要的蛋白质翻译后修饰形式。通过磷酸化作用，蛋白质可以被赋予多样性的生物功能。因此，设计靶向性药物并调控蛋白质的翻译后修饰，尤其是磷酸化修饰，是一种全新的药物研发思路。这种靶向过程的优势在于，不仅能够针对特定的疾病激活蛋白质靶点，而且能够规避传统的完全激动性药物所带来的副作用。
5.pparγ属于核受体(nuclear receptors，nrs)家族成员，具有nr典型的四个结构域：n 端激活区，dna结合区(dna binding domain，dbd)，铰链区(hinge domain)以及配体结合区(ligand binding domain，lbd)。以往对pparγ翻译后修饰的研究大多集中于lbd，发现了多种翻译后修饰形式，包括ser273磷酸化、lys268/293乙酰化以及lys395 sumo修饰。但是对于其dbd区域的修饰的功能，及其在疾病诊断、药物开发中的应用尚属空白。
6.代谢性疾病的发病机理复杂，涉及多器官多系统多因素的共同作用。临床上，对代谢性疾病的诊断多依赖于血清学指标物，但这并不能准确的指示代谢性疾病的病程状态。然而，现有技术尚未给出相关分子诊断标志物，及指导用药的合适靶点和干预策略。


技术实现要素：

7.本发明的第一目的在于提供pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化(相应在pparγ1中的位点为136位苏氨酸磷酸化)
8.本发明的第二目的在于提供检测pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化的兔多克隆抗
体及应用。
9.本发明的第三目的在于提供检测pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化的兔多克隆抗体的制备方法。
10.本发明的第四目的在于提供pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为疾病标志物，在临床前或临床上诊断与检测中的应用。
11.本发明的第五目的在于提供pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为靶点，在药物筛选、设计及优化上的应用。
12.本发明的第六目的在于提供pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为干预靶点，通过调控该靶点实现在治疗代谢性疾病中的应用。
13.本发明的第七目的在于提供pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为研究用指标在制备检测试剂盒、试纸或芯片中的应用。
14.所述的pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化，其上游激酶为pkc(包括pkcα/β/γ)，即pkc会结合于pparγ上，磷酸化pparγ的166位苏氨酸(位于dna结合区)。其活性评判标准为测定pparγ的转录活性。
15.所述的pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化的抗体，为小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体；所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下几个步骤：
16.1)多肽合成
17.2)动物免疫：选用健康家兔2只，经过2mg/只、5次免疫后，收集血清50～70ml/ 只；
18.3)免疫血清的鉴定：利用10μg/ml抗原包被，elisa的方法鉴定血清的效价；
19.4)抗体的纯化：使用磷酸化肽段偶连的介质亲和纯化抗体；
20.5)western blotting的方法测定多克隆抗体的特异性。
21.所述的pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化的抗体在检测细胞或器官组织样本中 pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化水平中的应用。该抗体亦可用于开发检测pparγ蛋白第 166位苏氨酸磷酸化的试剂盒、试纸或芯片等检测实体。
22.所述的pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为疾病标志物，在临床前或临床上诊断与检测中的应用。检测疾病标志物为代谢性疾病，包括：肥胖、糖尿病、脂肪组织代谢紊乱、脂肪细胞分化障碍、动脉粥样硬化、代谢性炎症、肿瘤、代谢性肾脏疾病、代谢性肝病等；用于评价pkc激活情况、pparγ磷酸化水平、pparγ转录活性及代谢状态；用于疾病病程的分期、分级及预后评估；用于指导临床药物的选择；用于指导开发能抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化的药物。
23.所述的pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为靶点，在药物筛选、设计及优化上的应用，包括筛选、设计能够抑制该磷酸化位点的pparγ的配体小分子、短肽或酶。同时，针对其上游激酶，筛选设计抑制pkc激活的小分子激活剂。
24.所述的pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化作为干预靶点，通过调控该靶点实现在治疗代谢性疾病中的应用。当pparγ第166位苏氨酸发生磷酸化后，脂肪细胞内棕色脂肪细胞标志物表达量下降，脂质分解代谢代谢、脂肪酸氧化代谢及线粒体氧化磷酸化水平皆受到抑制。干预手段包括：1)通过化学小分子cddo与cddo-im可干预pparγ该磷酸化位点，即这两种小分子化合物可作为pparγ的配体结合于pparγ，通过改变pparγ的分子构象，阻碍其上游激酶
pkc 与pparγ的结合，从而抑制pparγ蛋白的第166位苏氨酸磷酸化，进而促进脂肪细胞棕色脂肪标志物表达，促进脂质分解代谢，促进脂肪酸氧化代谢并增强线粒体呼吸活力与氧化磷酸化能力。2)通过使用pkc抑制剂ro 31-8220等抑制pkc激酶活性，从而抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化。达到调控细胞脂质代谢、线粒体功能的目的。3)通过使用基因编辑技术，在细胞内对pparg的基因进行定点突变，或使用基因过表达技术在细胞内过表达pparγ的突变体蛋白。通过这些技术，在细胞内生产pparγ第166位苏氨酸突变的蛋白质。当pparγ第166位苏氨酸突变为丙氨酸(alanine，a突变)时，可模拟该位点的持续去磷酸化状态，此时细胞脂质分解代谢旺盛，线粒体呼吸及氧化磷酸化能力强；当pparγ第166位苏氨酸突变为天冬氨酸(aspartic acid，d突变)时，可模拟该位点的持续磷酸化状态，此时细胞脂质分解代谢失活，脂质囤积强，线粒体呼吸能力减弱，氧化磷酸化水平下降。4)通过其它小分子化合物、短肽、抗体或酶调控pparγ蛋白第166位苏氨酸磷酸化。通过以上四种途径中的任意一种，可实现对细胞内的pparγ第166位苏氨酸发生磷酸化水平的靶向干预，达到恢复细胞脂质代谢稳态，调控线粒体状态，进而治疗多种代谢性疾病，包括：肥胖、糖尿病、脂肪组织代谢紊乱、脂肪细胞分化障碍、动脉粥样硬化、代谢性炎症、肿瘤、代谢性肾脏疾病、代谢性肝病等。
附图说明
25.图1为质谱法鉴定pparγ第166位苏氨酸磷酸化；免疫共沉淀证明上游激酶pkc与 pparγ蛋白之间存在相互作用。
26.图2为pparγ第166位苏氨酸磷酸化的小鼠抗体在细胞内可特异性检测pparγ第 166位苏氨酸磷酸化水平。
27.图3为cddo可抑制细胞内pparγ第166位苏氨酸磷酸化；cddo可干扰pkc对 pparγ的磷酸化作用。
28.图4为高脂饲喂的肥胖模型中，pparγ第166位苏氨酸磷酸化可作为代谢性疾病的诊断标志物；第166位苏氨酸磷酸化的小鼠抗体可用于检测组织内该磷酸化水平。
29.图5为以pparγ第166位苏氨酸磷酸化作为靶点，筛选可特异性抑制该磷酸化的小分子化合物。
30.图6为以小分子化合物cddo和cddo-im干预脂肪细胞pparγ第166位苏氨酸磷酸化，可促进棕色脂肪相关基因表达，促进脂质分解代谢与脂肪酸氧化代谢相关基因的表达。
31.图7为小分子cddo在动物体内抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化，促进脂肪组织褐色化，提升脂质分解代谢水平；cddo可增强细胞内线粒体数量及线粒体呼吸活力。
32.图8为通过基因编辑技术对pparγ第166位苏氨酸进行定点突变，a突变可以增强 pparγ的转录活性，提升细胞脂质分解代谢能力，增强线粒体呼吸活力。d突变具有相反的过程。
33.图9为ob/ob转基因小鼠的代谢紊乱模型中，通过使用pkc抑制剂ro 31-8220(ro) 处理小鼠，可以改善代谢性紊乱状态。
34.图10为ob/ob转基因小鼠的代谢紊乱模型中，通过使用pkc抑制剂ro 31-8220(ro) 处理小鼠，可以增强脂肪组织胰岛素敏感基因的表达。
35.图11为ob/ob转基因小鼠的代谢紊乱模型中，通过使用pkc抑制剂ro 31-8220(ro) 处理小鼠，可以抑制巨噬细胞经典活化表型(m1型炎性活化)，增强替代活化表型(m2型抗炎表型)。
36.图12为通过过表达外源基因技术，在巨噬细胞内过表达pparγ第166位苏氨酸突变的蛋白质，a突变可增强巨噬细胞m2极化，而d突变可增强巨噬细胞m1极化。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并未用于限定本发明的范围。以下结合说明书附图对具体实施方式进行说明：
37.图1为本发明通过使用磷酸化质谱技术，对pkc与pparγ的体外激酶反应体系中的反应产物进行磷酸化修饰分析，鉴定出了唯一的一个磷酸化修饰位点，即第166位苏氨酸磷酸化修饰(图1.a-b)。随后运用免疫共沉淀技术，在293t模式细胞中，分析了pkc与pparγ之间的相互作用关系，说明在细胞内pkc是pparγ的上游激酶(图1.c)。
38.本实施方式多抗的制备方法按以下步骤进行：一、合成氨基酸序列t166磷酸化的 pparγ的多肽；二、利用步骤一合成的多肽与klh偶联，得到免疫原，然后利用免疫原免疫健康家兔并收集抗血清，得到特异性识别第166位苏氨酸磷酸化的抗体。图2为使用制备的抗体检测细胞内(图2.a、c)及体外激酶实验中(图2.b)的pparγ第166位苏氨酸磷酸化。
39.图3为在293t细胞中过表达野生型pparγ，并使用pparγ的配体激动剂rsg和 cddo进行处理；通过使用pparγ第166位苏氨酸磷酸化的抗体检测磷酸化状态，结果表明， 50-100μm的cddo可以有效抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化(图3.a)。进一步使用免疫共沉淀技术分析rsg和cddo处理后，pkc与pparγ之间的互作关系，结果显示，100μm 的cddo可以有效的阻断pkc与pparγ之间的相互作用(图3.b)。
40.图4为使用60％fat的高脂饲料饲喂c57bl/6j小鼠2个月与4个月，检测血清中的代谢指标物：脂联素(adiponectin)、甘油三酯(tg)、空腹血糖(blood glucose)、总胆固醇(total cholesterol)；代谢性炎症指标物：tnf-α与il-6(图4.a-c)；同时，运用western blotting 并使用制备获得的抗体检测白色脂肪与棕色脂肪中的pparγ第166位苏氨酸磷酸化水平；可以发现，随着肥胖程度的提高，全身性的代谢紊乱也加剧，同步地，脂肪组织中的pparγ第 166位苏氨酸磷酸化水平也逐步加深(图4.d-e)，这说明该位点的磷酸化可以作为代谢性疾病的诊断指标物。
41.图5为筛选出可以直接抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化的小分子。图6.a为在293t 细胞中过表达野生型pparγ，并使用激酶抑制剂进行处理，结果发现pkc的活性抑制剂ro31-8220(ro)可以抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化(图5.a)。进一步地，运用体外激酶实验筛选可以抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化的pparγ的配体小分子；结果表明，cddo 是有效的可以抑制该磷酸化的pparγ的配体小分子(图5.b)。这部分数据说明，pparγ第 166位苏氨酸磷酸化可作为靶点，筛选可特异性抑制该磷酸化的小分子化合物，并开发治疗代谢性疾病的相关药物分子。
42.图6为使用体外培养的脂肪细胞，在培养过程中使用cddo或其结构类似物cddo-im (图6.a)处理细胞，结果显示，通过cddo和cddo-im干预脂肪细胞pparγ第166位苏氨酸磷酸化，可促进棕色脂肪相关基因表达，促进脂质分解代谢与脂肪酸氧化代谢相关基因的表达(图6.b-e)。[0041]与[0042]这两部分的数据说明，通过上游激酶pkc的抑制；或通过化学小分子配体cddo与cddo-im结合pparγ，阻碍其上游激酶pkc与pparγ的结合；两者皆可抑制pparγ第166位磷酸化修饰，进而促进脂肪细胞棕色脂肪标志物表达，促进脂质分解代谢，促进脂肪酸氧化代谢并增强线粒体呼吸活力与氧化磷酸化能力。
[0043]
图7为6-8周龄的雄性c57bl/6j小鼠腹腔注射4mg/kg的cddo，同时以10mg/kg的罗格列酮(rsg)为阳性对照药物，每天注射一次，持续2周；同步监控给药期间小鼠体重变化，可以看出，cddo可抑制小鼠体重增长(图7.a)。给药结束后，分选小鼠的三种主要的脂肪组织：棕色脂肪组织(bat)、附睾脂肪组织(eat)以及皮下脂肪组织(sat)；通过手动称量脂肪组织的重量，折算其占体重的百分比，可比较该类型脂肪组织的含量；如图7.b 所示，cddo可特异性的降低皮下脂肪组织的组织含量。同步地，在皮下脂肪组织中检测 pparγ第166位苏氨酸磷酸化水平，可以看出cddo的给药处理可以显著的降低皮下脂肪组织中的pparγ第166位苏氨酸磷酸化水平(图7.c)。进一步运用h&e病理切片、免疫组化及荧光定量pcr技术，分析皮下脂肪组织中的脂肪组织形态、米色脂肪标志物ucp1的蛋白分布、米色脂肪细胞生物标记物表达情况(图7.e)；结果表明，cddo可显著促进皮下脂肪组织多室化形态的形成(图7.d)，增加ucp1蛋白的表达量(图7.g)，增强米色脂肪细胞标志物基因的表达(图7.f)。另一方面，通过建立体外脂肪细胞分化模型，并使用cddo处理细胞，发现cddo在体外培养的脂肪细胞中亦可抑制抑制pparγ第166位苏氨酸磷酸化(图 7.h)，并且强有力的增强脂肪细胞线粒体活力(图7.i)。这部分的数据证明，通过干预pparγ第166位苏氨酸磷酸化，可促进脂肪组织褐色化，提升脂质分解代谢水平；可增强细胞内线粒体数量及线粒体呼吸活力。
[0044]
图8为通过crispr/cas9基因编辑技术，对小鼠胚胎干细胞进行编辑，获得了pparγ第166位苏氨酸进行定点突变的转基因小鼠模型，即丙氨酸突变(ta突变)及天冬氨酸突变 (td突变)的小鼠品系。通过荧光素酶报告基因系统检测突变后的pparγ的转录活性，可以发现，a突变可以显著增强pparγ的转录活性，而d突变则大幅度抑制其转录活力(图 8.b)。使用体外诱导分化的脂肪细胞，通过bodipy 493/503(中性脂质荧光探针)及mitotrackerred(线粒体膜电位探针)检测脂肪细胞脂滴与线粒体，可以看出，ta突变可显著提升脂肪细胞线粒体膜电位，增强线粒体活力；相反地，td突变会显著抑制脂肪细胞线粒体活力(图 8.a)。进一步通过rna-seq技术分析基因表达谱，可以发现，ta突变的脂肪细胞呈现高脂质分解、高脂肪酸氧化代谢的表型；而td则完全相反(图8.c)。荧光定量pcr亦可验证这个结论(图8.d)。进一步地，运用seahorse xf24 extracellular flux analyze能量代谢分析仪分析检测野生型wt，ta突变以及td突变的脂肪细胞线粒体呼吸能力，结果显示，ta可大幅度提高脂肪细胞线粒体的呼吸活力，而td则完全的抑制脂肪细胞的线粒体呼吸活力(图 8.e)。这部分的数据表明，通过使用基因编辑技术，在细胞内对pparg的基因进行定点突变，或使用基因过表达技术在细胞内过表达pparγ的突变体蛋白。通过这些技术，在细胞内生产 pparγ第166位苏氨酸突变的蛋白质。当pparγ第166位苏氨酸突变为丙氨酸(alanine， a突变)时，可模拟该位点的持续去磷酸化状态，此时细胞脂质分解代谢旺盛，线粒体呼吸及氧化磷酸化能力强；当pparγ第166位苏氨酸突变为天冬氨酸(aspartic acid，
d突变) 时，可模拟该位点的持续磷酸化状态，此时细胞脂质分解代谢失活，脂质囤积强，线粒体呼吸能力减弱，氧化磷酸化水平下降。通过基因编辑或过表达手段，可实现对细胞内的pparγ第 166位苏氨酸发生磷酸化水平的靶向干预，达到恢复细胞脂质代谢稳态，调控线粒体状态，进而治疗多种代谢性疾病，包括：肥胖、糖尿病、脂肪组织代谢紊乱、脂肪细胞分化障碍、动脉粥样硬化、代谢性炎症、肿瘤、代谢性肾脏疾病、代谢性肝病等。
[0045]
图9为在ob/ob转基因小鼠的代谢紊乱模型中，给予2mg/kg的pkc抑制剂ro 31-8220 (ro)处理小鼠30天，通过检测血清中的代谢指标物(图9.a-i)；并测定了小鼠的葡萄糖耐受和胰岛素耐受能力，以此评估小鼠的胰岛素敏感性状态(图9.j)。这部分的数据证明，抑制pkc活力可以降低胰岛素抵抗，改善全身代谢紊乱状态。
[0046]
图10为在ob/ob转基因小鼠的代谢紊乱模型中，给予2mg/kg的pkc抑制剂ro 31-8220 (ro)处理小鼠30天，随后分选小鼠的白色脂肪组织，检测脂肪组织胰岛素敏感性相关基因表达(图10.a)，以及血清中adiponectin含量(图10.b)；结果表明，pkc抑制可以增强脂肪组织胰岛素敏感性，并提升外周血中脂联素adiponectin的水平，显著改善全身性代谢失衡。
[0047]
图11为在ob/ob转基因小鼠的代谢紊乱模型中，给予2mg/kg的pkc抑制剂ro 31-8220 (ro)处理小鼠30天，病理切片分析脂肪组织免疫细胞浸润；同时，分选小鼠巨噬细胞，测定巨噬细胞活化表型(图11.a-b)；结果表明pkc抑制可改善炎性免疫细胞，特别是巨噬细胞的浸润；同时抑制巨噬细胞经典活化表型(m1型炎性活化)，增强替代活化表型(m2 型抗炎表型)。
[0048]
图12为通过过表达外源基因技术，在巨噬细胞内过表达pparγ第166位苏氨酸突变的蛋白质，通过定量pcr技术检测巨噬细胞活化表型(图12.a)；同时运用流式细胞术检测巨噬细胞极化的表面标志物表达情况、巨噬细胞吞噬活力(图12.b-e)；结果显示，a突变可增强巨噬细胞m2极化，而d突变可增强巨噬细胞m1极化。
[0049]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0050]
以上实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明精神和实质的情况下对本发明方法、步骤或条件所做的修改和替换，均属于本发明的范围。