中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物

中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测方法、试剂盒及引物
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测方法、试剂盒及特异性引物。


背景技术：

2.微孢子虫最早被报道于1857年，(nageli 1857)，是典型的专性胞内寄生的单细胞真核生物，微孢子虫自身具有着独特的特征，如独特的侵染装置，孢子发芽时弹出极丝，将具有感染性的胞原质运输到细胞内。国际动物命名委员会(iczn)已确定微孢子虫门包括200多个属(becnel et al.，2014)。 thelohania属侵染直额长臂虾(palaemon rectirostris)、锯齿长臂虾 (palaemon serratus)和海洋褐虾(crangon vulgaris)和淡水龙虾和奥斯塔欧洲鳌虾(astacus fluviatilis)等虾类(edgerton bf et al，2002； stentiford gd et al，2013)。
3.enterocytospora artemiae(eam)最早发现于2013年，它被认为是一种专性于卤虫的寄生虫，仅限于欧洲和美洲(rode等人，2013年)。然而，在2020 年，发现这种微孢子虫已经蔓延到亚洲，并感染了具有重要经济意义的中华小长臂虾(jiang et al.,2020)。eam主要寄生于中华小长臂虾的肝胰腺。eam感染严重时会导致肝胰腺发白病变，并大大降低中华小长臂虾的活力，使其生长缓慢、发育停滞。虽然死亡率不高，但这些微孢子虫对宿主营养的吸收导致繁育成本增加。
4.目前，对于eam的检测主要有光学显微、电子显微镜镜观察、组织病理切片，但是这些技术分别使用时，却各有其局限性。电镜观察耗时长，费用高并需要具备特殊放入实验器材视野狭窄，感染宿主的微孢子虫数量较低时，通过传统染色、光学显微镜或电子显微镜进行观察变得无效，从而无法准确测定各种微孢子虫。组织病理切片虽组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，但观察需要大量虫体，不适用于早期检测，操作繁琐，费时费工；常规pcr灵敏度低、不能准确、定量的检测eam及其在宿主组织中的寄生活性。相比之下，实时荧光定量pcr(qpcr)，具有优势：如高特异性和高灵敏度，消耗更少时间，并可得知初始dna模板的拷贝数。qpcr检测过程是在一个相对封闭、独立的系统中完成，防止样品和环境的交叉污染(kotkov
á
等人，2018年；li等人，2019年)。


技术实现要素：

5.针对上述存在的中华小长臂虾微孢子虫诊断技术检测灵敏度不高、操作频繁、检测时期较晚等技术问题，本发明提供一种中华小长臂虾微孢子虫 enterocytospora artemiae(eam)绝对荧光定量pcr检测方法、试剂盒及特异性引物，它可以快速诊断中华小长臂虾微孢子虫的特异性引物及sybr green荧光定量pcr检测，使得中华小长臂虾微孢子虫检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误解。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
7.本发明一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测的特异性引物，根据中华小长臂虾微孢子虫的靶基因序列，合成扩增片段大小为141bp的上下游引物，所述引物的序列如下：
8.上游引物为:5
’‑
attccctcgttcgttgagtcagattg-3’，
9.下游引物为：5
’‑
gtggcattgtcatcatccctttgttg-3’，
10.引物浓度有要求为10μm/μl。
11.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测的试剂盒，包括权利要求1所述的上下游引物以及中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品。
12.进一步地，所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由eb99f/eb99r引物进行扩增得到目的片段制备而成，-20℃保存。
13.本发明所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测中的应用。
14.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测方法，绝对荧光定量 pcr方法的建立：使用2
×
chamq universal sybr qpcr mastermix试剂进行绝对荧光定量pcr方法的建立，反应体系为20μl，2
×
chamq universal sybr qpcr master mix 10.0μl，上下游引物各0.4μl，ddh20 7.2μl，模板 2μl；加样时先将引物和ddh2o均匀混合并分装到反应管，后加均匀混合好的模板和2
×
chamq universal sybr qpcr master mix，上机器前离心处理；
15.反应条件为：预变性95℃ 30s，1个循环；变性95℃ 10s，退火 60℃ 30s，延伸72℃ 30s，40个循环。
16.进一步地，所述荧光定量pcr标准曲线的绘制：
17.(1)制备含扩增靶序列的阳性质粒作为阳性标准品；
18.(2)将构建标准重组质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍梯度稀释，从 7.7
×
100到7.7
×
108共设置9个浓度梯度，每个梯度设置6个重复，于荧光定量 pcr仪中进行扩增，各取2μl当做模板，同时设置以ddh2o为模板为阴性对照；
19.(3)扩增结束后收集数据，根据扩增屈曲线、ct值，每个浓度重复3次进行检测，得出最佳的检测区间，并绘制标准曲线。
20.本发明的有益效果为：
21.本发明利用荧光定量pcr(qpcr)的技术原理，我们发明了一种用于中华小长臂虾微孢子虫检测的sybr green荧光定量pcr方法，实现了对eam的快速准确检测的目的。由于该方法加入了特异性扩增引物和sybr green mix体系，使得eam的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，使用该方法获得的检测数据可作为快速、准确识别eam感染及预防和控制eam的技术参考。
附图说明
22.图1为不同稀释梯度标准质粒的常规pcr电泳图；其中：
23.泳道m：dl1000marker；
24.泳道1-9：7.4
×
10
8-7.4
×
100稀释不同梯度的标准质粒。
25.图2a、2b未常规pcr扩增特异性片段电泳图及荧光定量pcr。
26.泳道p:阳性对照；
27.泳道1-7依次为：中华小长臂虾微孢子虫阳性dna、河蟹微孢子虫总dna、轮虫dna、
二尖梅奇酵母菌dna、肝肠胞虫dna、白斑综合征病毒(wssv)dna、异克常威酵母菌dna、美级梅奇酵母菌dna；
28.泳道n：阴性对照。
29.图3为本发明所构建重组质粒的扩增曲线图。
30.图4为本发明构建重组质粒的标准曲线。
31.图5为本发明构建重组质粒的溶解曲线。
具体实施方式
32.下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
34.下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.实施例：参考图1至图5，中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测方法，根据全基因组序列，选取靶基因序列，设计特异性引物进行扩增，得到目的片段，制备质粒标准品，进行绝对荧光定量pcr的建立和条件优化，绘制荧光定量pcr标准曲线，进行数据分析。
36.具体步骤如下：
37.1.dna的提取
38.从中华小长臂虾肝胰腺中提取dna，严格按照海洋动物组织基因组dna提取试剂盒的说明进行操作，用超显微分光光度计测定dna浓度，然后于-20℃保存。
39.2.引物的设计与合成
40.根据adenylate kinas基因序列,利用primer 5.0设计引物(如表1所示)，预计扩增的片段长度为141bp，由上海生物技术有限公司合成。
41.表1引物设计
[0042][0043]
3.质粒标准品的制备
[0044]
3.1常规pcr扩增：以eam阳性样品为模板，采用eb99f/eb99r引物进行扩增。常规pcr反应体系及反应程序如下(表3和表2)。
[0045]
表2常规pcr反应程序
[0046][0047]
表3常规pcr反应体系
[0048][0049]
3.2dna片段的纯化和回收：将表3所述的pcr扩增产物移入1.5％琼脂糖凝胶孔中，将电泳仪调至120v,运行30min。电泳结束后，在紫外灯下，用干净手术刀快速切下位于141bp的强阳性的目的条带凝胶，并将含有目标条带的凝胶放入1.5ml离心管中，随后，使用fastpuregeldnaextractionminikit 回收dna，此时应注意尽量切除不含目的dna部分的凝胶，提高dna回收率。
[0050]
3.3载体重组：将回收后的dna片段连接于1μlpmd-19-t载体，后续根据试剂盒(pmdtm19-tvectorcloningkit)说明书再加入1μl回收的dna样品和3μlddh2o，组成总体积为5μl(如表4所示)。将配置好的混合后的反应溶液加入等量5μlsolutionⅰ，连接体系共为10μl，置于4℃过夜。
[0051]
表4连接反应体系表如下：
[0052][0053]
3.4菌株的筛选——连接产物的转化：
[0054]
3.4.1将连接pmd-19-t载体混合后10μl的连接溶液加入50μl的dh5α感受态细胞并放入1.5ml离心管，置于冰上冰浴30min；
[0055]
3.4.2 42℃水浴加热45s，然后转移冰上放置1min；
[0056]
3.4.3每管添加890μllb培养基，混匀后置于摇床，37℃振荡培养60min，培养菌液；
[0057]
3.4.4吸取100μl菌液涂布法涂于含有40μl的x-gal和5μl的iptg染色液的已加入amp-lb固体培养基中，采用封口膜封住平板，室温平板正放1h后倒置放入 37℃恒温培养箱过夜(12-16h)；
[0058]
3.4.5重组质粒的提取：挑取平板中白色单个阳性菌落，混于100μlddh20，吸取1μl作为dna样本进行测序鉴定。目的是确认重组质粒的插入片段是否与设计引物扩增片段一致(141bp)，一致的说明构建成功，确保所提取质粒不是假阳性，以提取正确序列的重组质粒。
[0059]
剩余菌液置于装有5ml amp-lb液体离心管内，放入摇床以37℃ 180rpm扩培4-5h左右，直到液体浑浊，看见菌丝即可，扩增菌丝用fastpureplasmid mini kit提取重组质粒，-20℃保存备用。
[0060]
4.含enterocytospora artemiae(eam)质粒的拷贝数计算
[0061]
构建的重组质粒使用超显微分光光度计测定浓度，浓度为24ng/μl。
[0062]
根据以下公式copies/μl＝[初始浓度(ng/μl)
×
10-9
]
×
(6.02
×
10
23
)/[(载体片段碱基数 目的基因碱基数)
×
660]，计算质粒拷贝数作为质粒标准品，重组质粒拷贝数为7.7
×
109copies/μl。u
[0063]
5.荧光定量pcr的建立和条件优化
[0064]
以标准质粒为模板，上下游引物加入反应体系中(表6)，于appliedbiosystems quantstudio 3实时定量pcr仪进行扩增，确定最佳退火温度、反应体系及反应条件(表5和表6)。
[0065]
表5荧光定量pcr反应条件
[0066][0067]
表6荧光定量pcr扩增体系
[0068]
[0069][0070]
6.荧光定量pcr标准曲线的绘制
[0071]
重组质粒进行10倍梯度稀释，选取7.7
×
10
8-7.7
×
100copies/μl梯度的重组质粒作为标准品，每个浓度重复3次进行检测，得到标准曲线(如图4所示)。起始模板浓度的对数值与ct值呈现线性关系，ct＝-3.224logx 37.988扩增效率为104.278％，相关系数r2为0.999(见图4及表7)。
[0072]
表7中华小长臂虾微孢子虫荧光定量pcr灵敏度实验结果
[0073][0074]
7、荧光定量pcr灵敏性检测：
[0075]
用10倍梯度稀释的标准质粒7.7
×
10
8-7.7
×
100copies/μl为模板，进行荧光定量pcr。当标准质粒拷贝数为7.7
×
100时ct值为34.225,为最低检出浓度(如图3 和图4所示)，比常规pcr灵敏度高出100倍。在常规pcr扩增电泳图中，模板到达7.7
×
102时条带亮度较暗(如图1所示)。
[0076]
8、荧光定量pcr特异性检测：
[0077]
分别以中华小长臂虾微孢子虫阳性dna、河蟹微孢子虫总dna、轮虫 dna、二尖梅奇酵母菌dna、肝肠胞虫dna、白斑综合征病毒(wssv) dna、异克常威酵母菌dna、美级梅奇酵母菌dna来检测特异性。
[0078]
用上述遗传物质进行常规pcr(eb99f/eb99r)反应，用含量为1％胶板进行琼脂糖凝胶电泳分析(如图2a所示)，结果显示仅感染enterocytosporaartemiae虾肝胰腺dna出
现明亮且单一的目的条带。同时用荧光定量pcr (eb99f/eb99r)试验再次验证，样品同样为上述各个微生物的dna样品，并以ddh2o为模板做阴性对照，其扩增曲线(如图2b所示)证明，只有含有 enterocytospora artemiae阳性的样品出现扩增曲线外，非目的基因均没有检测到荧光信号。
[0079]
9、荧光定量pcr重复性分析：
[0080]
用10倍梯度稀释的标准质粒7.7
×
10
8-7.7
×
100copies/μl为模板，其中每个模板设置6个重复模板浓度。统计每个梯度6个平行之间的平均值和方差，检测组内重复；将上述标准质粒在同一条件下进行3次独立的荧光定量pcr检测，检测组间重复。根据公式，变异系数＝(sd
÷
mn)
×
100％(sd:标准偏差，mn:ct 平均值)，组内变异系数均小于1％(表8)，表明组内重复性非常好。各组间的变异系数均小于2％(表8)，表明该方法具有较好的重复性，从而确保了试验结果的稳定性及可靠性(表8)。
[0081]
表8荧光定量pcr的重复性实验结果
[0082][0083][0084]
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。