中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物

技术特征：
1.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测的特异性引物，其特征在于：根据中华小长臂虾微孢子虫的靶基因序列，合成扩增片段大小为141bp的上下游引物，所述引物的序列如下：上游引物为:5
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attccctcgttcgttgagtcagattg-3’，下游引物为：5
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gtggcattgtcatcatccctttgttg-3’，引物浓度有要求为10μm/μl。2.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的上下游引物以及中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品。3.根据权利要求1所述的用于中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测的试剂盒，其特征在于：所述中华小长臂虾微孢子虫质粒标准品由eb99f/eb99r引物进行扩增得到目的片段制备而成，-20℃保存。4.如权利要求1-2任一项所述的引物在中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测中的应用。5.一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测方法，其特征在于：绝对荧光定量pcr方法的建立：使用2
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chamq universal sybr qpcr master mix试剂进行绝对荧光定量pcr方法的建立，反应体系为20μl，2
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chamq universal sybr qpcr master mix 10.0μl，上下游引物各0.4μl，ddh2o 7.2μl，模板2μl；加样时先将引物和ddh2o均匀混合并分装到反应管，后加均匀混合好的模板和2
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chamq universal sybr qpcr master mix，上机器前离心处理；反应条件为：预变性95℃30s，1个循环；变性95℃10s，退火60℃30s，延伸72℃30s，40个循环。6.根据权利要求5所述的一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量pcr检测方法，其特征在于：所述荧光定量pcr标准曲线的绘制：(1)制备含扩增靶序列的阳性质粒作为阳性标准品；(2)将构建标准重组质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍梯度稀释，从7.7
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100到7.7
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108共设置9个浓度梯度，每个梯度设置6个重复，于荧光定量pcr仪中进行扩增，各取2μl当做模板，同时设置以ddh2o为模板为阴性对照；(3)扩增结束后收集数据，根据扩增屈曲线、ct值，每个浓度重复3次进行检测，得出最佳的检测区间，并绘制标准曲线。

技术总结
一种中华小长臂虾微孢子虫绝对荧光定量PCR检测方法、试剂盒及引物，属于分子生物学技术领域。具体检检测方法：采集样本；中华小长臂虾微孢子虫DNA的提取；合成扩增片段大小为141bp的上下游引物；绝对荧光定量PCR方法的建立；标准曲线的绘制；绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验。本发明建立快速，灵敏的中华小长臂虾微孢子虫分子检测方法，与传统的PCR检测方法相比，具有省事、高效、灵敏、定量的特点。特点。特点。


技术研发人员：姜宏波 刘京慧 包杰 陈启军
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：2022.03.14
技术公布日：2022/6/7