对杂合性丧失作出响应的细胞表面受体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年8月9日提交的美国临时专利申请序列号62/885,093和2020年4月6日提交的美国临时专利申请序列号62/005,670的优先权权益，所述专利申请各自的内容据此以引用的方式整体并入。
3.通过引用并入序列表
4.本技术与序列表一起以电子格式提交。序列表作为名称为a2bi-00903wo_seqlist.txt、于2020年8月5日创建并且大小为404千字节的文件提供。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入。
背景技术：
5.细胞疗法是治疗各种疾病(特别是癌症)的有力工具。在常规过继性细胞疗法中，将免疫细胞工程化以表达特异性受体，例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其通过受体与由靶细胞表达的配体的相互作用将免疫细胞的活性导向细胞靶标。合适的靶分子的鉴定仍然具有挑战性。本领域需要可用于通过细胞疗法治疗疾病(特别是癌症)的组合物和方法。
技术实现要素：
6.本公开总体上涉及在工程化免疫细胞(例如用于过继性细胞疗法的免疫细胞)中表达的双受体系统，其可以被用于将这些免疫细胞靶向表现出杂合性丧失的肿瘤细胞。在该双受体系统中，第一受体用于激活或促进免疫细胞的激活，而第二受体用于抑制被第一受体激活。第一受体和第二受体的配体例如通过编码抑制性配体的基因座的杂合性丧失的差异表达介导表达第一激活剂配体但不表达第二抑制性配体的靶细胞对免疫细胞的激活。
7.本公开提供了免疫细胞，其包含：(a)第一工程化受体，所述第一工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合第一配体的第一配体结合结构域；和(b)第二工程化受体，所述第二工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合第二配体的第二配体结合结构域，其中所述第一配体结合结构域与所述第一配体的结合激活或促进所述受体对所述免疫细胞的激活，并且其中所述第二配体结合结构域与所述第二配体的结合抑制所述第一受体对所述免疫细胞的激活。
8.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体由于编码第二配体的基因的杂合性丧失而不在靶细胞中表达。在一些实施方案中，第二配体是hla i类等位基因或次要组织相容性抗原(miha)。
9.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体是miha。在一些实施方案中，miha选自表8和表9中的一组miha。在一些实施方案中，miha是ha-1。
10.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体是hla i类等位基因。在一些实施方案中，hla i类等位基因包括hla-a、hla-b或hla-c。在一些实施方案中，hla i类等位基因是hla-a*02等位基因。
11.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体由于y染色体的丢失而不在靶细胞中表达。在一些实施方案中，第二配体由y染色体基因编码。
12.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体和第二配体是不相同的。在一些实施方案中，第一配体由靶细胞表达。在一些实施方案中，第一配体由靶细胞和非靶细胞表达。在一些实施方案中，第二配体不由靶细胞表达，并且由多种非靶细胞表达。在一些实施方案中，多种非靶细胞表达第一配体和第二配体两者。
13.在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞并且所述非靶细胞是非癌细胞。
14.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体选自由以下组成的组：细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、参与趋化性的分子、糖蛋白、g蛋白偶联受体、跨膜蛋白、神经递质受体和电压门控性离子通道。在一些实施方案中，第一配体选自表5中的一组抗原。在一些实施方案中，第一配体选自由以下组成的组：转铁蛋白受体(tfrc)、表皮生长因子受体(egfr)、cea细胞粘附分子5(cea)、cd19分子(cd19)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(her2)和间皮素(msln)或它们的肽抗原。在一些实施方案中，第一配体包含hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g。在一些实施方案中，第一配体是泛hla配体。
15.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体选自由以下组成的组：hla i类等位基因、次要组织相容性抗原(miha)和y染色体基因。在一些实施方案中，第二配体的表达因为杂合性丧失而在靶细胞中丢失。在一些实施方案中，miha是ha-1。在一些实施方案中，hla i类等位基因是hla-a*02等位基因。
16.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一工程化受体是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，第二工程化受体是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。
17.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体结合结构域包含单链fv抗体片段(scfv)、β链可变结构域(vβ)、tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域、或可变重链(vh)结构域和可变轻链(vl)结构域。在一些实施方案中，第二配体结合结构域包含scfv、vβ结构域、tcrα链可变结构域和tcrβ链可变结构域、或可变重链(vh)结构域和可变轻链(vl)结构域。
18.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体是egfr或其肽抗原。在一些实施方案中，第一配体结合结构域包含seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:110、seq id no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:118或seq id no:391的序列，或与它们具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，第一配体结合结构域包含选自seq id no:131-166的cdr。
19.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体是msln或其肽抗原。在一些实施方案中，第一配体结合结构域包含seq id no:86、seq id no:88、seq id no:90或seq id no:92的序列，或与它们具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
20.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体是cea或其肽抗原。在一些实施方案中，第一配体结合结构域包含seq id no:94、seq id no:96、seq id no:98、seq id no:100、seq id no:282、seq id no:284或seq id no:286，或与它们具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，第一配体结合结构域包含选自seq id no:294-302的cdr。
21.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体是cd19或其肽抗原，并且第一配体结合结构域包含seq id no:275或seq id no:277，或与它们具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
22.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一配体是泛hla配体。在一些实施方案中，第一配体结合结构域包含seq id no:167、seq id no:169、seq id no:171、seq id no:173、seq id no:175或seq id no:177的序列，或与它们具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
23.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体包含ha-1。在一些实施方案中，并且其中所述第二配体结合结构域包含tcrα可变结构域和tcrβ可变结构域，所述tcrα可变结构域包含seq id no:199或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列，所述tcrβ可变结构域包含seq id no:200或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，第二配体结合结构域包含含有seq id no:199的tcrα可变结构域和含有seq id no:200的tcrβ可变结构域。
24.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二配体包含hla-a*02等位基因。在一些实施方案中，第二配体结合结构域包含seq id no:53-64中的任一者或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，第二配体结合结构域包含选自seq id no:41-52的cdr。
25.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二工程化受体包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。
26.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第二工程化受体包含lilrb1胞内结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1胞内结构域包含与seq id no:76至少95％同一的序列。在一些实施方案中，第二工程化受体包含lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1跨膜结构域或其功能变体包含与seq id no:85至少95％同一的序列。在一些实施方案中，第二工程化受体包含lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体。在一些实施方案中，lilrb1铰链结构域包含与seq id no:84、seq id no:77或seq id no:78至少95％同一的序列。在一些实施方案中，第二工程化受体包含lilrb1胞内结构域和lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1胞内结构域和lilrb1跨膜结构域包含seq id no:80或与seq id no:80至少95％同一的序列。在一些实施方案中，第二工程化受体包含与tcrα可变结构域融合的含有seq id no:80或与其具有至少95％同一性的序列的第一多肽，和与tcrβ可变结构域融合的含有seq id no:80或与其具有至少95％同一性的序列的第二多肽。
27.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，第一受体和第二受体以介于约1:10至10:1之间的第一受体与第二受体比率在免疫细胞表面上表达。在一些实施方案中，第一受体和第二受体以介于约1:3至3:1之间的第一受体与第二受体比率在免疫细胞表面上表达。在一些实施方案中，第一受体和第二受体以约1:1的比率在免疫细胞表面上表达。
28.在本公开的免疫细胞的一些实施方案中，免疫细胞选自由以下组成的组：t细胞、b细胞和天然杀伤(nk)细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是非天然的。在一些实施方案中，免疫细胞是分离的。
29.本公开提供了表达本公开的双受体系统的免疫细胞，用于用作药物。在一些实施
方案中，所述药物用于治疗癌症。
30.本公开提供了包含本公开的免疫细胞的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的免疫细胞。
31.本公开提供了在受试者中增加过继性细胞疗法的特异性的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的多种免疫细胞或药物组合物。
32.本公开提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的免疫细胞或药物组合物。
33.在本公开的方法的一些实施方案中，所述受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症细胞表达第一配体。在一些实施方案中，癌症细胞由于杂合性丧失或y染色体丢失而不表达第二配体。
34.本公开提供了制备本公开的免疫细胞的方法，所述方法包括(a)提供多种免疫细胞；和(b)用编码第一工程化受体的载体和编码第二工程化受体的载体转化所述免疫细胞，所述第一工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合第一配体的第一配体结合结构域，所述第二工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合第二配体的第二配体结合结构域；其中所述第一配体结合结构域与所述第一配体的结合激活或促进所述免疫细胞的激活，并且其中所述第二配体结合结构域与第二配体的结合抑制所述第一配体对所述免疫细胞的激活。
35.本公开提供了包含本公开的免疫细胞或药物组合物的试剂盒。
36.本公开提供了抑制性受体，所述抑制性受体包含能够特异性地结合ha-1次要组织相容性抗原(miha)的胞外配体结合结构域和包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的胞内结构域。
37.在本公开的抑制性受体的一些实施方案中，胞外配体结合结构域对vlhddllea(seq id no:191)的ha-1(h)肽比对vlrddllea(seq id no:266)的ha-1(r)肽具有更高的亲和力。在一些实施方案中，抑制性受体被vlhddllea(seq id no:191)的ha-1(h)肽激活，而不被vlrddllea(seq id no:266)的ha-1(r)肽激活或者以较低的程度被其激活。在一些实施方案中，胞外配体结合结构域包含tcrα可变结构域和tcrβ可变结构域，所述tcrα可变结构域包含seq id no:199或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列，所述tcrβ可变结构域包含seq id no:200或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，胞外配体结合结构域包含含有seq id no:199的tcrα可变结构域和含有seq id no:200的tcrβ可变结构域。
38.在本公开的抑制性受体的一些实施方案中，胞内结构域包含lilrb1胞内结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1胞内结构域或其功能变体包含与seq id no:76至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抑制性受体包含lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1跨膜结构域或其功能变体包含与seq id no:85至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抑制性受体包含lilrb1胞内结构域和lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1胞内结构域和lilrb1跨膜结构域包含seq id no:80或与seq id no:80至少95％同一的序列。在一些实施方案中，抑制性受体包含与tcrα可变结构域融合的含有seq id no:80或与其至少95％同一的序列的第一多肽，和与tcrβ可变结构
域融合的含有seq id no:80或与其至少95％同一的序列的第二多肽。在一些实施方案中，抑制性受体包含seq id no:195的多肽或与其具有至少95％同一性的多肽和seq id no:197的多肽或与其具有至少95％同一性的多肽。
39.本公开提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含：(a)第一工程化受体，所述第一工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合cd19配体的第一配体结合结构域；和(b)第二工程化受体，所述第二工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合hla-a*02等位基因的第二配体结合结构域，其中所述第一配体结合结构域与所述cd19配体的结合激活或促进所述第一受体对所述免疫细胞的激活，并且其中所述第二配体结合结构域与所述hla-a*02等位基因的结合抑制所述第一受体对所述免疫细胞的激活。
40.本公开提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含：(a)第一工程化受体，所述第一工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合egfr配体的第一配体结合结构域；和(b)第二工程化受体，所述第二工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合hla-a*02等位基因的第二配体结合结构域，其中所述第一配体结合结构域与所述egfr配体的结合激活或促进所述受体对所述免疫细胞的激活，并且其中所述第二配体结合结构域与所述hla-a*02等位基因的结合抑制所述第一受体对所述免疫细胞的激活。
41.本公开提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含：(a)第一工程化受体，所述第一工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合间皮素(msln)配体的第一配体结合结构域；和(b)第二工程化受体，所述第二工程化受体包含跨膜区和胞外区，所述胞外区包含能够特异性地结合hla-a*02等位基因的第二配体结合结构域，其中所述第一配体结合结构域与所述msln配体的结合激活或促进所述第一受体对所述免疫细胞的激活，并且其中所述第二配体结合结构域与所述hla-a*02等位基因的结合抑制所述第一受体对所述免疫细胞的激活。
附图说明
42.参考以下列出说明性实施方案的详细描述可获得对本发明特征和优点的更好理解，其中利用了本发明的原理，并且其中附图为：
43.图1是展示相对于构成正常组织的杂合细胞的背景形成肿瘤的半合子肿瘤细胞的图。半合子肿瘤细胞仅表达靶标a并且由于杂合性丧失(loh)而丧失了靶标b，而正常细胞同时表达靶标a和靶标b。这种遗传差异可以用于创建被靶标b阻断并被靶标a激活的肿瘤选择性细胞毒性治疗剂，从而选择性地杀死肿瘤。
44.图2a是显示基于肿瘤中的loh的双靶向治疗剂的示例性结构体系的图。在该实例中，存在激活剂和阻断剂信号的基于细胞的整合。
45.图2b是显示各种激活剂和受体形式及组合的一系列图。
46.图3a是显示呈tcr形式的本公开的示例性双受体构建体的一对图。在该实例中，激活剂和抑制剂(阻断剂)lbd各自分别与tcr的cd3γ亚基融合。
47.图3b是呈car形式的本公开的示例性双受体构建体的图和表。抑制剂car的示例性itim和抑制剂结构域显示在右边的表中。
48.图4a是显示来自gtex数据库的人组织中转铁蛋白受体(tfrc)的rna-seq表达的绘图。转铁蛋白受体(tfrc)是靶标a(激活剂)的候选物。tfrc在rna水平的表达是普遍存在的并且相对均匀。trfc是必需基因：功能丧失纯合突变在小鼠中是胚胎致死的。
49.图4b是显示hla-a和hla-b的rna-seq表达谱的绘图。
50.图5a-5h显示了lir-1阻断剂是模块的并且介导大的ec50位移。
51.图5a显示了评价阻断剂构建体的t2-jurkat实验的示意图。
52.图5b显示了当负载ny-eso-1阻断剂肽时，各种ny-eso-1 scfv lbd阻断剂模块(pd-1、ctla-4、lir-1)对mage-a3 car激活剂(mp1-car)的ec50的影响。误差条表示
±
sd(n＝2)。
53.图5c显示了当负载对应的肽时，具有各种scfv lbd(eso、mp1 lbd 1、mp1 lbd 2、hpv e6 lbd 1、hpv e6 lbd 2、hpv e7)的lir-1阻断剂模块对mage-a3 car激活剂(mp1-car)的ec50的影响。误差条表示
±
sd(n＝2)。
54.图5d显示了当负载ny-eso-1阻断剂肽时，具有ny-eso-1 scfv lbd的lir-1阻断剂模块对不同mage-a3 car激活剂(mp1-car或mp2-car)的ec50的影响。误差条表示
±
sd(n＝2)。
55.图5e显示了当负载ny-eso-1阻断剂肽时，具有ny-eso-1 scfv lbd的lir-1阻断剂模块对不同tcr激活剂(mp1-tcr、mp2-tcr、hpv e6-tcr)的ec50的影响。误差条表示
±
sd(n＝2)。三种不同的tcr激活剂被ny-eso-lir-1阻断，ny-eso-lir-1具有eso scfv、lir-1铰链、lir-1 tm和lir-1 icd。
56.图5f显示具有ny-eso-1 ftcr lbd的lir-1阻断剂模块对mage-a3 car和tcr激活剂(mp1-car、mp1-tcr)的ec50的影响。误差条表示
±
sd(n＝2)。第三代car激活剂或常规tcr激活剂两者均可以被ny-eso-1 ftcr-lir-1阻断，ny-eso-1 ftcr-lir-1具有tcra ecd、lir-1 tm、lir-1 icd和tcrb ecd、lir-1 tm和lir-1 icd。
57.图5g显示了用hpv e7-car或hpv e7-car和a2-lir-1转染的jurkat细胞与展示各种激活剂(hpv e7)与阻断剂(ny-eso-1)抗原比率的珠粒一起共培养，证明了顺式而非反式阻断。
58.图5h显示了a2-lir-1阻断剂模块以各种激活剂与阻断剂比率阻断cd19-car激活剂。e:t比率：效应物:靶标比率。
59.图6a、图6c-6e显示了表达lir-1阻断剂的原代t细胞选择性地杀死具有pmhc和非pmhc概念验证靶标的肿瘤细胞。
60.图6a显示了用hpv e7-tcr激活剂和eso-lir-1阻断剂转导的原代t细胞在原代t细胞杀伤测定中的ec50位移约100倍。误差条表示 /-sd(n＝2)。
61.图6b显示了hla-a*02-lir-1在jurkat细胞中在各种激活剂:阻断剂dna比率下阻断ny-eso-1car激活剂。
62.图6c显示了用cd19 car激活剂和hla-a*02阻断剂转导的原代t细胞在体外细胞毒性测定中区分“肿瘤”细胞与“正常”细胞，并且证明在3:1 e:t下在混合靶细胞测定中选择性地杀伤“肿瘤”细胞。a2-lir-1：具有hla-a2*02 lbd的基于lir-1的受体。
63.图6d-6e显示了用cd19 car激活剂和hla-a*02阻断剂转导的原代t细胞在3:1 e:t下在体外细胞毒性测定中证明在3轮抗原暴露(ab
–a–
ab和a
–
ab
–
a)之后的可逆阻断(图6d)
和激活(图6e)。用三个hla-a*02阴性供体再现原代t细胞细胞毒性测定。
64.图7a-7e显示了修饰的car-t细胞(即表达激活剂和阻断剂受体两者的car-t细胞)选择性地杀死异种移植物模型中的肿瘤。
65.图7a显示了用cd19 car激活剂和hla-a*02阻断剂转导的原代t细胞展示用cd3/28刺激在10天内扩增约20倍。
66.图7b显示了体内研究设计的示意图：向hla-a*02 nsg小鼠皮下施用“肿瘤细胞”(a2-阴性raji细胞)或“正常细胞”(a2-阳性raji细胞)，并且当raji异种移植物平均为约70mm3时，将原代t细胞(人类，hla-a*02-阴性供体)注射到尾静脉中。
67.图7c-7e显示了通过卡尺测量的肿瘤尺寸的读数(图7c)、通过流式细胞术的人血t细胞计数(图7d)和存活(图7e)。误差条是平均值的标准误差(s.e.m.)。utd：未转导。
68.图8显示了激活ec50的肽负载位移通常小于约10x。显示了阻断剂肽负载(ny-eso-1、mage-a3、hpv e6和hpv e7各50um)对激活mage-a3 car(mp2 car)的影响。
69.图9显示了lir-1阻断剂模块是配体依赖性的。显示了当负载各种浓度的ny-eso-1阻断剂肽时，ny-eso-1-lir-1阻断剂对激活mage-a3 car(mp1-car)的ec50的影响。
70.图10显示了不具有icd或具有突变的无功能的icd的阻断剂不会阻断激活。显示了当负载10um的ny-eso-1阻断剂肽时，不含有icd(蓝色)或含有具有ny-eso-1 scfv lbd的突变的icd(紫色)的修饰的lir-1阻断剂模块对mage-a3 car激活剂(mp2-car)的ec50的影响。
71.图11显示了cd19激活和a2-lir-1阻断在hla-a*02 (a2 )raji细胞中的jurkat激活。将用cd19或cd19和a2-lir-1转染的jurkat细胞与wt(a2-)raji细胞或a2 raji细胞一起以各种细胞比率共培养。
72.图12是显示小鼠血液中的hcd3 t细胞与肿瘤生长的相关性的四个小图。显示了在用a2-和a2 raji细胞注射t细胞后10天和17天hcd3 t细胞相对于肿瘤体积的图。
73.图13显示了表达egfr car激活剂和hla-a*02 lir-1阻断剂的jurkat细胞被egfr /hla-a*02-hela靶细胞激活，但不被egfr /hla-a*02 hela靶细胞激活。
74.图14a显示了hla-a*02在用hla-a*02转导的hela细胞和hct116细胞上的表达。用抗hla-a2抗体bb7.2标记hela和hct1116细胞并进行fac分选。绿色：未标记的hela；橙色：未标记的hct116；蓝色：标记有bb7.2的野生型hct116；红色：用hla-a*02转导并用bb7.2标记的hela细胞。
75.图14b显示了egfr在hela细胞和hct116细胞上的表达。用抗egfr抗体标记hela和hct1116细胞并进行fac分选。绿色：未标记的hela；橙色：未标记的hct1116；蓝色：用抗egfr标记的野生型hct116；红色：用hla-a*02转导并用抗egfr标记的hela细胞。
76.图15a显示了表达egfr car的jurkat细胞和hct116靶细胞的egfr car激活。
77.图15b显示了jurkat细胞的egfr car激活可以被hla-a*02 lir-1抑制性受体阻断。当jurkat细胞与表达egfr和hla-a*02的hct116靶细胞一起呈现时，jurkat细胞共表达egfr car和hla-a*02 lir-1抑制性受体导致car emax位移大约1.8x。
78.图16a显示了在基于珠粒的测定中滴定激活剂抗原以确定激活剂与阻断剂抗原的最佳比率。
79.图16b显示了在基于珠粒的测定中在恒定量的激活剂抗原的存在下对阻断剂(抑制性)抗原进行滴定以确定激活剂与阻断剂抗原的最佳比率。
80.图17是显示使用实体瘤细胞系a375作为靶细胞，基于ny-eso-1 scfv lir-1的抑制性受体可以抑制mp1 mage-a3 tcr对jurkat细胞激活的激活的图解(左)和绘图(右)。
81.图18是显示使用b细胞白血病系nalm6作为靶细胞，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体可以抑制cd19 scfv car对jurkat细胞激活的激活的图解(左)和绘图(右)。
82.图19是显示基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体可以以剂量依赖性方式抑制ny-eso-1 scfv car激活剂对jurkat细胞的激活的图解(左)和绘图(右)。
83.图20显示了当使用t2靶细胞和萤光素酶测定在jurkat细胞中测定时，泛hla(泛i类)scfv car被具有可调强度的hal-a*02 lir-1阻断剂表达阻断。
84.图21a显示了基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体在基于无细胞珠粒的测定中可以顺式抑制对jurkat细胞的激活。
85.图21b显示了使用白血病细胞系k562作为靶细胞，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体可以抑制msln scfv car对jurkat细胞的激活。
86.图22是显示使用基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体和使用hla-a*02 hela和siha细胞作为靶细胞，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体可以抑制如通过ifnγ的诱导倍数测量的通过msln scfv car对jurkat细胞的激活的图解(左)和绘图(右)。
87.图23显示了使用hla-a*02 siha细胞而非hla-a*02-siha细胞，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体抑制通过msln car激活剂的杀伤。
88.图24显示了当激活剂和抑制剂抗原以顺式呈递在珠上时，而不是当激活剂和抑制剂抗原以反式呈递在珠粒上时，使用基于珠的测定对表达egfr scfv car的jurkat细胞的激活可以被基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体阻断。
89.图25a显示了使用表达hla-a*02的siha靶细胞(siha a02)，而非通过不表达hla-a*02的siha细胞(siha wt)，egfr scfv car对jurkat细胞的激活可以被基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体阻断。
90.图25b显示了使用表达hla-a*02的hela靶细胞(hela a02)，而非通过不表达hla-a*02的hela细胞(hela wt)，egfr scfv car对jurkat细胞的激活可以被基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体阻断。
91.图26显示了与lir-1抑制结构域融合的另外scfv以剂量依赖性方式抑制组成型car激活剂。将jurkat-nfat萤光素酶报告细胞用表现出高强直信号传导的激活car构建体和识别各种pmhc的抑制构建体转染。通过将转染的jurkat细胞与负载各种量的抑制肽的t2细胞一起共培养来测量对nfat-萤光素酶激活的影响。
92.图27是显示使用t2靶细胞，包含miha-b替代物scfv配体结合结构域(kras g12v scfv阻断剂)的抑制性受体抑制通过靶向miha-a替代物(kras g12d tcr,c-891)的激活剂tcr对jurkat效应细胞的激活的图解(左)和绘图(右)。
93.图28是显示使用t2靶细胞，包含与lir-1铰链、tm和icd融合的miha-b替代物scfv配体结合结构域(kras g12d scfv阻断剂)的抑制性受体抑制通过靶向miha-a替代物(kras g12v tcr,c-913)的tcr对jurkat效应细胞的激活的图解(左)和绘图(右)。
94.图29是显示使用t2靶细胞，包含与lir1 tm和icd融合的miha-b替代物ftcr结合结
构域(kras g12v ftcr阻断剂)的抑制性受体抑制通过靶向miha-a替代物(kras g12d tcr)的tcr对jurkat效应细胞的激活的图解(左)和绘图(右)。
95.图30是显示使用t2靶细胞，包含与lir-1 tm和icd融合的miha-b替代物ftcr结合结构域(kras g12d ftcr阻断剂)的抑制性受体抑制通过靶向miha-a替代物(kras g12v tcr)的tcr对jurkat效应细胞的激活的图解(左)和绘图(右)。
96.图31a是显示使用包含结合一种突变体kras肽[kras g12d]的miha-b scfv配体结合结构域以及结合另一种突变体kras肽(kras g12v)的lir-1铰链、跨膜结构域和细胞内结构域(icd)的抑制性受体通过miha-a tcr对jurkat细胞激活的抑制的绘图。黑色：c-891激活剂；蓝色：c-891激活剂、c-1761抑制剂；红色：c-891激活剂、c-2371和c2369抑制剂。
[0097]
图31b是显示使用包含miha-b ftcr配体结合结构域和lir-1跨膜结构域和细胞内结构域(icd)的抑制性受体通过miha-a tcr对jurkat细胞激活的抑制的绘图。黑色：c-913激活剂；蓝色：c-913激动剂、c-1761抑制剂；红色：c-913激动剂、c2365和c2367抑制剂。
[0098]
图32是显示小鼠miha-y tcr可以激活jurkat效应细胞的绘图。
[0099]
图33a是显示ha-1 ftcr在ha-1(h)肽的存在下可以特异性地阻断ny-eso-1 tcr的绘图和表格。
[0100]
图33b是显示在非特异性等位基因变体ha-1(r)肽的存在下ha-1 ftcr基本上不阻断ny-eso-1 tcr的绘图和表格。
[0101]
图34a是显示ha-1 ftcr在ha-1(h)阻断剂肽的存在下可以特异性地阻断kras tcr的绘图和表格。
[0102]
图34b是显示在非特异性等位基因变体ha-1(r)肽的存在下ha-1 ftcr基本上不阻断kras tcr的绘图和表格。
[0103]
图35是通过流式细胞术比较t2细胞中ha-1(r)、ha-1(h)和ny-eso-1肽的肽负载的绘图。
[0104]
图36a是显示使用mage-a3 mp1 scfv car和ny-eso-1 scfv lir1阻断剂的激活剂量响应的绘图和表格。
[0105]
图36b是显示使用mage-a3 mp1 scfv car和ny-eso-1 scfv lir1阻断剂的抑制剂量响应的绘图和表格。
[0106]
图36c是显示归一化为用于每条曲线的恒定激活剂mage肽浓度并绘制在x轴上的来自图36b的x值阻断剂ny-eso-1肽浓度的绘图。b：ny-eso-1lir1阻断剂，a：mage-a3肽2 scfv car。
[0107]
图37是显示当hla-a*02 scfv lir1抑制剂与不同egfr scfv car激活剂一起使用时观察到不同程度的阻断的一系列绘图和表格。
[0108]
图38a是显示在将表达不同egfr scfv car和hla-a*02 scfv lir1抑制剂的t细胞与表达单独egfr激活剂(靶标a)、单独的抑制剂靶标(靶标b)或激活剂和抑制剂靶标(靶标ab)的hela细胞一起孵育后，t细胞表达egfr scfv car激活剂受体的一系列荧光激活细胞分选(facs)绘图。
[0109]
图38b是显示在暴露于靶细胞之前和在与表达单独的激活剂配体(靶标a)的靶细胞或表达激活剂和阻断剂配体两者的靶细胞(靶标ab)一起共培养120小时之后定量激活剂受体表达的绘图。
[0110]
图39a是显示在与表达egfr(靶标a)、表达hla-a*02(靶标b)、在同一细胞上表达egfr和hla-a*02的组合(靶标ab)的hela细胞群体、在不同细胞上表达靶标a和靶标ab的hela细胞的混合群体、或在不同细胞上表达靶标b和靶标ab的hela细胞的混合群体一起共培养后在表达egfr scfv car(ct-482)激活剂和hla-a*02 scfv lir1抑制剂(c1765)的t细胞上的激活剂受体的细胞表面表达的绘图。
[0111]
图39b是显示在与表达egfr(靶标a)、表达hla-a*02(靶标b)、在同一细胞上表达egfr和hla-a*02的组合(靶标ab)的hela细胞群体、在不同细胞上表达靶标a和靶标ab的hela细胞的混合群体、或在不同细胞上表达靶标b和靶标ab的hela细胞的混合群体一起共培养后在表达egfr scfv car(ct-482)激活剂和hla-a*02 scfv lir1抑制剂(c1765)的t细胞上的抑制剂受体的细胞表面表达的绘图。
[0112]
图40是确定t细胞的激活剂受体表达丢失是否为可逆的实验的图。
[0113]
图41a是显示激活剂表面表达丢失是可逆的并且对应于t细胞细胞毒性的一系列绘图。在顶部：显示了t细胞对hela靶细胞的杀伤百分比。在底部：如通过facs测定的激活剂和抑制剂受体表达。
[0114]
图41b是显示激活剂表面表达丧失是可逆的并且对应于t细胞细胞毒性的一系列绘图。在顶部：显示了t细胞对hela靶细胞的杀伤百分比。在底部：如通过facs测定的激活剂和抑制剂受体表达。
具体实施方式
[0115]
本发明人已经开发了解决在用细胞疗法治疗疾病(特别是癌症)中鉴定合适的标记和实现细胞选择性的问题的方案。本发明的主要目标是基于杂合性丧失来靶向细胞(图1)。使用其中激活信号和抑制信号在细胞水平上整合的双受体系统(图2a、2b、3a和3b)，实现了对肿瘤而不是非肿瘤细胞的选择性靶向。在靶细胞中不存在或丧失但在正常细胞中存在的表面蛋白的表达的差异由此被转化为靶向抗肿瘤细胞疗法。这些差异改善了细胞疗法的靶向，并且保护正常细胞免受使用过继性细胞疗法的效应细胞的细胞毒性作用。
[0116]
在一些实施方案中，本文所公开的此方法使用两种工程化受体，第一种包含针对激活剂配体的配体结合结构域并且第二种包含针对抑制剂配体的配体结合结构域，其使用“and not”布尔逻辑(boolean logic)在靶细胞中被选择性地激活(图2a、2b、3a和3b)。正常细胞表达激活剂和抑制剂配体两者，但是通过第一受体激活效应细胞被包含抑制剂lbd的第二受体与抑制剂配体的结合所阻断，该抑制剂配体发挥保护作用并且支配第一激活剂受体的活性。相反，在表达激活剂配体但不表达抑制剂配体的靶细胞中，激活剂lbd对激活剂配体的结合导致对细胞的激活。本公开的双重激活剂/抑制剂受体策略的优点包括调节激活剂和抑制剂组合以创建有效但特异性的肿瘤靶向过继性细胞疗法的能力。此外，此方法可以克服身体中可变的效应细胞与靶细胞比率(e:t比率)，以及当用过继性细胞疗法靶向肿瘤细胞时看到的潜在大量过量的正常细胞与肿瘤细胞(例如10
13
个正常细胞与109个肿瘤细胞)的挑战。此外，本发明人已经鉴定了覆盖大的潜在患者组合的激活剂和抑制剂，使得这是商业上可行的方法。
[0117]
过继性细胞疗法对特定细胞类型的特异性可以通过第一受体和第二受体的不同活性以及第一配体和第二配体的差异表达来实现。第一配体与第一受体的结合提供激活信
号，而第二配体与第二受体的结合甚至在第一配体的存在下也阻止或减少对效应细胞的激活。第一配体可以比第二配体更广泛地表达，例如在被过继性细胞疗法靶向的细胞中和在不是过继性细胞疗法的靶细胞的健康细胞(非靶细胞)两者中。相反，第二配体在非靶细胞中表达，而不在靶细胞中表达。仅靶细胞而不是非靶细胞表达第一配体而非第二配体，从而在这些细胞的存在下激活包含本公开的双受体的效应细胞。
[0118]
本公开提供了通过使用两种工程化受体的基于杂合性丧失而靶向细胞(例如肿瘤细胞)的组合物和方法。两种工程化受体(一种是抑制剂，一种是激活剂)各自包含识别不同配体的不同配体结合结构域。当仅存在第一激活剂配体时，第一配体和第二配体的表达差异用于选择性地激活表达两种受体的效应细胞。因此，在一些实施方案中，第一配体结合结构域和第二配体结合结构域在不同的受体分子上；即，不是单个遗传构建体、融合蛋白或蛋白质复合物的一部分的单独受体。在一些实施方案中，当每种受体结合其同源配体时，一种受体激活细胞而另一种受体抑制细胞。在一些实施方案中，包含第二抑制剂配体结合结构域的受体支配信号传导，使得如果靶细胞表达两种靶标，则结果是抑制效应细胞。只有当细胞中不存在抑制性靶标时，第一激活剂配体才通过包含第一激活剂配体结合结构域的受体诱导对效应细胞的激活。
[0119]
任何广泛表达的细胞表面分子(例如细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、涉及趋化性的分子、糖蛋白、g蛋白偶联受体、跨膜、神经递质受体或电压门控性离子通道、或者任何这些的肽抗原)都可以用作第一配体。作为另一个实例，第一配体可以是转铁蛋白受体(tfrc)。任何不在靶细胞表面上表达的细胞表面分子都可以用作第二配体。在其中工程化受体用于过继性细胞疗法以治疗癌症并且靶细胞是癌细胞的那些实施方案中，可以基于癌细胞中第二配体的杂合性丧失来选择第二配体。例如由于导致杂合性丧失的突变而经常在癌细胞中丧失其表达的示例性基因包括hla i类等位基因、次要组织相容性抗原(miha)和y染色体基因。
[0120]
本公开还提供了编码本文所述的工程化受体的载体和多核苷酸。
[0121]
本公开还提供了制备包含本文所述的工程化受体的免疫细胞群体的方法，以及使用其治疗病症的方法。
[0122]
定义
[0123]
在更详细地阐述本公开之前，提供对本文将使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
[0124]
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或测试特定实施方案，但是本文描述了组合物、方法和材料的优选实施方案。出于本公开的目的，下面定义以下术语。在整个本公开中还阐述了另外的定义。
[0125]
冠词“一个/种(a/an)”和所述在本文中用来指代一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种或一个/种或多个/种)的冠词的语法对象。举例来说，“一个/种要素”是指一个/种要素或一个/种或多个/种要素。
[0126]
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为是指替代方案中的一个、两个或其任何组合。
[0127]
术语“和/或”应理解为是指一种或两种替代方案。
[0128]
本说明书全文中，除非上下文另外要求，词语“包含(comprise/co mprises/comprising)”将理解为意味着包含规定的步骤、或要素、或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤、或要素、或步骤或要素的组。“由...组成”是指包括并限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”指示所列的元素是必需的或强制性的，并且不可能存在其他元素。“基本上由...组成”是指包括在短语之后列出的任何元素，并且仅限于不干扰或促成本公开中针对所列元素所指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但不存在实质上影响所列要素的活性或作用的其他要素。
[0129]
在本说明书通篇中提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定的实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“另一实施方案”或“其他实施方案”或其组合是指结合实施方案加以描述的特定特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇在各个地方出现前述短语不必要全部是指相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以任何适合的方式组合在一个或多个实施方案中。还应当理解，对一个实施方案中的特征的肯定叙述用作排除特定实施方案中的特征的基础。
[0130]
如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、大小、尺寸、量、重量或长度相比变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、大小、尺寸、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、大小、尺寸、量、重量或长度的
±
15％、
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％、或
±
1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、大小、尺寸、量、重量或长度范围。
[0131]
如本文所用，术语“分离的”是指大体或基本上不含通常伴随在其自然状态下的组分的材料。在特定的实施方案中，术语“获得”或“源自”与分离同义使用。
[0132]
术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。也涵盖在体内获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。如本文所使用的“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可使用本文所设想的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如患者)包括实验动物(诸如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(诸如猫或狗)。包括非人灵长类动物，并且任选人患者。
[0133]
如本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括任何有益或期望的效果，并且可以包括症状的甚至最小的改善。“治疗”并不一定指示完全根除或治愈疾病或病状，或其相关症状。
[0134]
如本文所用，“防止(prevent)”和类似的词，诸如“防止(prevented)”、“防止(preventing)”等，指示用于防止、抑制或降低疾病症状的可能性的方法。其还指延迟疾病或病状的发作或复发或延迟疾病症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似的词还包括在发病或复发之前减轻疾病的强度、效果、症状和/或负担。
[0135]
如本文所用，术语“量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的病毒的“有效的量”或“有效量”。
[0136]“预防有效量”是指有效实现期望的预防结果的病毒的量。通常但不一定，因为预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段用于受试者，所以预防有效量少于治疗有效量。
[0137]
病毒或细胞的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因
素，以及病毒或细胞在个体中引起期望响应的能力而变化。治疗有效量还是其中病毒或细胞的任何毒性或有害效果都超过治疗有益效果的量。术语“治疗有效量”包括对“治疗”受试者(例如，患者)有效的量。
[0138]
生理响应的“增加”或“升高”量(例如，电生理活性或细胞活性)通常是“统计上显著”的量，并且可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未治疗的细胞中活性水平的增加。
[0139]
生理响应的“降低”或“减小”量(例如，电生理活性或细胞活性)通常是“统计上显著”的量，并且可包括1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1与大于1之间的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)未治疗的细胞中的活性水平的降低。
[0140]
通过“保持”、或“保留”、或“维持”、或“无变化”、或“无实质性变化”或“无实质性减少”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的响应相当的生理响应。相当的响应是与参考响应无显著差异或可测量差异的响应。
[0141]
一般来讲，“序列同一性”或“序列同源性”分别是指两个多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的精确对应。通常，用于测定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，以及将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过测定它们的“同一性百分比”来比较。无论是核酸还是氨基酸序列，两个序列的同一性百分比，是两个比对序列之间的精确匹配数目除以较短序列的长度，再乘以100。例如，还可使用可购自美国国立卫生研究院(national institutes of health)的高级blast计算机程序(包括版本2.2.9)来比较序列信息，从而确定同一性百分比。blast程序基于以下比对方法：karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa 87:2264-2268(1990)并且讨论于altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)；karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-5877(1993)；和altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997)中。简而言之，blast程序将同一性定义为相同的比对符号(通常是核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短符号的总数。程序可用于确定所比较的整个蛋白质长度上的同一性百分比。例如，在blastp程序中，提供了默认参数来用短查询序列优化搜索。程序还允许使用seg过滤器屏蔽由wootton和federhen,computers and chemistry 17:149-163(1993)的seg程序确定的查询序列段。期望的序列同一性程度的范围为约80％至100％，以及介于它们之间的整数值。典型地，所公开序列与所要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
[0142]
在本文使用的术语“外源性”是指来源于生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相比之下，术语“内源性”是指来源于生物体内部的任何分子(即生物体自然产生的)。
[0143]
本文使用的术语“moi”是指感染复数，也就是剂(例如病毒颗粒)与感染靶标(例如细胞)的比率。
[0144]
本文所有出版物和提及的专利特此以引用的方式整体并入，如同将每个单独的出版物或专利特定地和单独地指示未以引用的方式并入。在冲突的情况下，以本技术(包括本
文中的任何定义)为准。然而，本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请，并不也不应被视为承认或任何形式的建议，它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。
[0145]
在本说明书中，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当情况下，其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。当紧跟在数字或数值前面时，术语“约”是指数字或数值范围的正或负10％。
[0146]
如本文所用，“靶细胞”是指通过过继性细胞疗法靶向的细胞。例如，靶细胞可以是癌细胞，其可以被过继性细胞疗法的移植t细胞杀死。本公开的靶细胞表达如本文所述的激活剂配体，并且不表达抑制剂配体。
[0147]
激活剂
[0148]
本公开提供了第一配体(激活剂)和第一工程化受体，所述第一工程化受体包含与第一激活剂配体结合的第一配体结合结构域。
[0149]
本公开提供了包含胞外区的第一工程化受体，所述胞外区包含能够特异性地结合第一配体的第一配体结合结构域，所述第一配体激活或促进对所述受体的激活，这促进对表达所述受体的效应细胞的激活。本公开还提供了包含能够结合第二配体的第二配体结合结构域的第二工程化受体，其中即使在与第一配体结合的第一受体的存在下，所述第二配体结合结构域对第二配体的结合也抑制或减少对效应细胞的激活。
[0150]
如本文所用，“激活剂”或“激活剂配体”是指结合本公开的工程化受体(诸如car或tcr)的第一激活剂配体结合结构域(lbd)，从而介导对表达工程化受体的t细胞的激活的第一配体。激活剂由靶细胞(例如癌细胞)表达，并且也可以被比仅靶细胞更广泛地表达。例如，激活剂可以在一些或所有类型的正常非靶细胞上表达。
[0151]
在一些实施方案中，第一配体是来自本文所公开的任何激活剂靶标的肽配体。在一些实施方案中，第一配体是与主要组织相容性(mhc)i类复合物(肽mhc或pmhc)(例如包含人白细胞抗原a*02等位基因(hla-a*02)的mhc复合物)复合的肽抗原。
[0152]
包含与含有人白细胞抗原(hla)hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f和hla-g中任一者的pmhc复合的肽抗原的靶细胞特异性第一激活剂配体被设想在本公开的范围内。在一些实施方案中，第一配体包含含有hla-a的pmhc。hla-a受体是包含重α链和较小β链的异二聚体。α链由hla-a的变体编码，而β链(β2微球蛋白)是不变的。有几千种hla-a基因变体，所有这些都落入本公开的范围内。在一些实施方案中，mhc-i包含人白细胞抗原a*02等位基因(hla-a*02)。
[0153]
在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-b的pmhc。hla-b基因的数百种形式(等位基因)是已知的，其每一种都提供有特定的编号(例如hla-b*27)。
[0154]
在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-c的pmhc。hla-c属于hla i类重链旁系同源物(paralogue)。该i类分子是由重链和轻链组成的异二聚体(β-2微球蛋白)。本领域已知超过一百种hla-c等位基因。
[0155]
在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-a的pmhc。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-b的pmhc。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-c的pmhc。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-e的pmhc。在一些实施方案中，
第一激活剂配体包含含有hla-f的pmhc。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含含有hla-g的pmhc。
[0156]
在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-a。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-b。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-c。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-e。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-f。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-g。在一些实施方案中，第一激活剂配体包含hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f或hla-g。
[0157]
在一些实施方案中，第一激活剂配体结合结构域包含scfv结构域。
[0158]
在一些实施方案中，第一激活剂配体结合结构域包含仅vβ配体结合结构域。
[0159]
在一些实施方案中，第一激活剂配体结合结构域包含分离自或源自t细胞受体(tcr)的抗原结合结构域。例如，第一激动剂配体结合结构域包含tcrα和β链可变结构域。
[0160]
在一些实施方案中，第一激活剂配体和第二抑制剂配体是不同的。
[0161]
在一些实施方案中，第一激活剂配体由靶细胞表达，并且不由非靶细胞(即未被过继性细胞疗法靶向的正常细胞)表达。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞并且所述非靶细胞是非癌细胞。
[0162]
在一些实施方案中，激活剂配体在靶细胞上具有高细胞表面表达。这种高细胞表面表达赋予递送大激活信号的能力。测量细胞表面表达的方法对于本领域普通技术人员而言将是已知的，并且包括但不限于，使用针对激活剂配体的适当抗体进行免疫组织化学，随后进行显微镜检查或荧光激活细胞分选(facs)。
[0163]
在一些实施方案中，激活剂配体由具有必要细胞功能的基因编码。必要细胞功能是细胞生存所需的功能，包括蛋白质和脂质合成、细胞分裂、复制、呼吸、代谢、离子转运和为组织提供结构支持。选择由具有必要细胞功能的基因编码的激活剂配体防止了由于癌细胞中的非整倍性导致的激活剂配体的丢失，并使得编码激活剂配体的基因在癌症演化期间不太可能经历诱变。在一些实施方案中，激活剂配体由单倍剂量不足(haploinsufficient)(即编码激活剂配体的基因的拷贝的丢失不被细胞耐受并且导致细胞死亡或不利的突变表型)的基因编码。
[0164]
在一些实施方案中，激活剂配体存在于所有靶细胞上。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。
[0165]
在一些实施方案中，激活剂配体存在于多种靶细胞上。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，激活剂配体存在于至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的靶细胞上。在一些实施方案中，激活剂配体存在于至少95％的靶细胞上。在一些实施方案中，激活剂配体存在于至少99％的靶细胞上。
[0166]
在一些实施方案中，激活剂配体存在于所有细胞上(普遍存在的激活剂配体)。如果例如第二抑制剂配体也在除靶细胞之外的所有细胞上表达，则激活剂配体可能在所有细胞上表达。
[0167]
在一些实施方案中，第一激活剂配体由多种靶细胞和多种非靶细胞表达。在一些实施方案中，所述多种非靶细胞表达第一激活剂配体和第二抑制剂配体两者。
[0168]
在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:100至约100:1
的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:50至约50:1的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:25至约25:1的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:10至约10:1的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:5至约5:1的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:3至约3:1的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:2至约2:1的第一配体与第二配体的比率存在于多种非靶靶细胞上。在一些实施方案中，并且第一激活剂配体和第二抑制剂配体以约1:1的的比率存在于多种非靶靶细胞上。
[0169]
第一激活剂配体被第一配体结合结构域(在本文中有时称为激活剂lbd)识别。
[0170]
示例性激活剂配体包括选自由以下组成的组的配体：细胞粘附分子、细胞-细胞信号传导分子、细胞外结构域、参与趋化性的分子、糖蛋白、g蛋白偶联受体、跨膜蛋白、神经递质受体和电压门控性离子通道。在一些实施方案中，第一激活剂配体是转铁蛋白受体(tfrc)或其肽抗原。人转铁蛋白受体描述于ncbi记录号aaa61153.1中，其内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，tfrc由以下的序列编码：
[0171][0172]
在一些实施方案中，激活剂配体是肿瘤特异性抗原(tsa)。在一些实施方案中，肿瘤特异性抗原是间皮素(msln)、cea细胞粘附分子5(ceacam5或cea)、表皮生长因子受体(egfr)或其肽抗原。在一些实施方案中，tsa是msln、cea、egfr、delta样典型notch配体4(dll4)、细胞表面相关粘蛋白16(muc 16，也称为ca125)、神经节苷脂gd2(gd2)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、erb-b2受体酪氨酸激酶2(her2/neu)或其肽抗原。靶向tsa的示例性小鼠和人源化scfv抗原结合结构域示于下表1中：
[0173]
表1.靶向肿瘤特异性抗原(tsa)的示例性scfv抗原结合结构域
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178][0179]
在一些实施方案中，激活剂配体是msln或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域包含msln结合结构域。在一些实施方案中，msln配体结合结构域包含scfv结构域。在一些实施方案中，msln配体结合结构域包含seq id no:86、seq id no:88、seq id no:90或seq id no:92的序列。在一些实施方案中，msln配体结合结构域包含与seq id no:86、seq id no:88、seq id no:90或seq id no:92至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，msln配体结合结构域由包含seq id no:87、seq id no:89、seq id no:91或seq id no:93的序列编码。在一些实施方案中，msln配体结合结构域由与seq id no:87、seq id no:89、seq id no:91或seq id no:93的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0180]
在一些实施方案中，激活剂配体是cea或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域包含cea结合结构域。在一些实施方案中，cea配体结合结构域包含scfv结构域。在一些实施方案中，cea配体结合结构域包含seq id no:94、seq id no:96、seq id no:98、seq id no:100、seq id no:282、seq id no:284或seq id no:286的序列。在一些实施方案中，cea配体结合结构域包含与seq id no:94、seq id no:96、seq id no:98、seq id no:100、seq id no:282、seq id no:284或seq id no:286至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，cea配体结合结构域由包含seq id no:95、seq id no:97、seq id no:99、seq id no:101、seq id no:283、seq id no:285或seq id no:287的序列编码。在一些实施方案中，cea配体结合结构域由与seq id no:95、seq id no:97、seq id no:99、seq id no:101、seq id no:283、seq id no:285或seq id no:287的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0181]
在一些实施方案中，激活剂配体是cea或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域包含cea结合结构域。在一些实施方案中，cea配体结合结构域包含efgmn(seq id no:294)的cdr-h1、wintktgeatyveefkg(seq id no:295)的cdr-h2、wdfayyveamdy(seq id no:296)或wdfahyfqtmdy(seq id no:297)的cdr-h3、kasqnvgtnva(seq id no:298)或kasaavgtyva(seq id no:299)的cdr-l1、sasyrys(seq id no:300)或sasyrkr(seq id no:301)的cdr-l2和hqyytyplft(seq id no:302)的cdr-l3或与它们具有至少85％或至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，cea scfv包含efgmn(seq id no:294)的cdr-h1、wintktgeatyveefkg(seq id no:295)的cdr-h2、wdfayyveamdy(seq id no:296)或wdfahyfqtmdy(seq id no:297)的cdr-h3、kasqnvgtnva(seq id no:298)或kasaavgtyva(seq id no:299)的cdr-l1、sasyrys(seq id no:300)或sasyrkr(seq id no:301)的cdr-l2和hqyytyplft(seq id no:302)的cdr-l3。在一些实施方案中，cea结合结构域包含efgmn(seq id no:294)的cdr-h1、wintktgeatyveefkg(seq id no:295)的cdr-h2、wdfayyveamdy
(seq id no:296)的cdr-h3、kasqnvgtnva(seq id no:298)的cdr-l1、sasyrys(seq id no:300)的cdr-l2和hqyytyplft(seq id no:302)的cdr-l3。在一些实施方案中，cea scfv包含efgmn(seq id no:294)的cdr-h1、wintktgeatyveefkg(seq id no:295)的cdr-h2、wdfayyveamdy(seq id no:296)的cdr-h3、kasaavgtyva(seq id no:299)的cdr-l1、sasyrkr的cdr-l2、和hqyytyplft(seq id no:302)的cdr-l3。在一些实施方案中，cea结合结构域包含efgmn(seq id no:294)的cdr-h1、wintktgeatyveefkg(seq idno:295)的cdr-h2、wdfahyfqtmdy(seq id no:297)的cdr-h3、kasaavgtyva(seq id no:299)的cdr-l1、sasyrkr的cdr-l2、和hqyytyplft(seq id no:302)的cdr-l3。
[0182]
在一些实施方案中，激活剂配体是cea或其肽抗原，并且激活剂受体是cea car。在一些实施方案中，cea car包含与seq id no:288、seq id no:290或seq id no:292至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，cea car包含seq id no:288、seq id no:290或seq id no:292或基本上由其组成。在一些实施方案中，cea car由包含seq id no:289、seq id no:291或seq id no:293或基本上由其组成的序列编码。在一些实施方案中，cea car由与seq id no:289、seq id no:291或seq id no:293具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0183]
在一些实施方案中，激活剂配体是egfr或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域包含egfr结合结构域。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含scfv结构域。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:110、seq id no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:118或seq id no:391的序列。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含与seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:110、seq id no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:118或seq id no:391至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域由包含seq id no:103、seq id no:104、seq id no:107、seq id no:109、seq id no:111、seq id no:113、seq id no:115、seq id no:117或seq id no:119的序列编码。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域由与seq id no:103、seq id no:104、seq id no:107、seq id no:109、seq id no:111、seq id no:113、seq id no:115、seq id no:117或seq id no:119的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0184]
在一些实施方案中，激活剂配体是egfr或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域包含egfr配体结合结构域。在一些实施方案中，egfr结合结构域包含选自表2中公开的组的vh和/或vl结构域或与其具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:120、seq id no:122、seq id no:124、seq id no:126、seq id no:128和seq id no:130组成的组的vh结构域。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:120、seq id no:122、seq id no:124、seq id no:126、seq id no:128和seq id no:130组成的组的vh或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:121、seq id no:123、seq id no:125、seq id no:127、seq id no:129和seq id no:131组成的组的vl结构域。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:121、seq id no:123、seq id no:125、seq id no:127、seq id no:129和seq id no:131组成的组的vh或与其具有至少90％、
至少95％或至少99％同一性的序列。
[0185]
表2.egfr可变重链(vh)和可变轻链(vl)结构域
[0186][0187][0188]
在一些实施方案中，激活剂配体是egfr或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域是egfr配体结合结构域。在一些实施方案中，egfr结合结构域包含选自表3中公开的一组
cdr的互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含与表3中公开的cdr具有至少95％序列同一性的cdr。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自seq id no:131-166的cdr。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:132-137组成的组的重链cdr 1(cdr h1)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:138-143组成的组的重链cdr 2(cdr h2)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:144-149组成的组的重链cdr 3(cdr h3)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:150-155组成的组的轻链cdr 1(cdr l1)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:156-160组成的组的轻链cdr 2(cdr l2)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自由seq id no:161-166组成的组的轻链cdr 3(cdr l3)。在一些实施方案中，egfr配体结合结构域包含选自seq id no:132-137的cdr h1、选自seq id no:138-143的cdr h2、选自seq id no:144-149的cdr h3、选自seq id no:150-155的cdr l1、选自seq id no:156-160的cdr l2和选自seq id no:156-160的cdr l3。
[0189]
表3.egfr抗原结合结构域cdr。
[0190][0191]
在一些实施方案中，激活剂配体是泛hla配体，并且激活剂结合结构域是泛hla结合结构域，即结合并识别在hla a、b和c基因座的产物之间共有的抗原决定簇的结合结构域。本领域已知的或本文所公开的各种单一可变结构域适合用于实施方案中。此类scfv包括例如但不限于下列小鼠和人源化泛hla scfv抗体。示例性泛hla配体是w6/32，其识别构象表位，与hla i类α3和α2结构域发生反应。
[0192]
表4.源自w6/32的泛hla scfv结合结构域
[0193]
[0194][0195]
在一些实施方案中，激活剂配体是泛hla配体，并且激活剂配体结合结构域包含泛hla配体结合结构域。在一些实施方案中，泛hla配体结合结构域包含scfv结构域。在一些实施方案中，泛hla配体结合结构域包含seq id no:167、seq id no:169、seq id no:171、seq id no:173、seq id no:175或seq id no:177的序列。在一些实施方案中，泛hla配体结合结构域包含与seq id no:167、seq id no:169、seq id no:171、seq id no:173、seq id no:175或seq id no:177至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，泛hla配体结合结构域由包含seq id no:168、seq id no:170、seq id no:172、seq id no:174、seq id no:176或seq id no:178的序列编码。在一些实施方案中，泛hla配体结合结构域由与seq id no:168、seq id no:170、seq id no:172、seq id no:174、seq id no:176或seq id no:178的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0196]
在一些实施方案中，激活剂配体是cd19分子(cd19)或其肽抗原，并且激活剂配体结合结构域包含cd19配体结合结构域。在一些实施方案中，cd19配体结合结构域包含scfv结构域。在一些实施方案中，cd19配体结合结构域包含与seq id no:275或seq id no:277至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，cd-19配体结合结构域包含seq id no:275或seq id no:277的序列。在一些实施方案中，cd19配体结合结构域由包含seq id no:276或seq id no:278的序列编码。在一些实施方案中，cd19配体结合结构域由与seq id no:276或seq id no:278的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0197]
在一些实施方案中，激活剂配体是cd19分子(cd19)或其肽抗原，并且激活剂受体是car。在一些实施方案中，cd19 car包含与seq id no:279或seq id no:281至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，cd19 car包含seq id no:279或seq id no:281或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd19car由与seq id no:280或seq id no:390的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。在一些实施方案中，cd19 car由包含seq id no:280或seq id no:390或基本上由其组成的序列编码。普通技术人员将理解，针对第一受体的第一激活剂配体结合结构域可以分离自或源自本领域已知的任何来源，包括但不限于本领域公认的t
细胞受体、嵌合抗原受体和抗体结合结构域。例如，第一配体结合结构域可以源自表5中公开的任何抗体，并且结合选自表5中所描述的抗原的第一配体。因此，包含所描述的双受体系统的免疫细胞可以用于治疗表5中所描述的任何疾病或病症。选择适当的第一激活剂受体配体结合结构域来治疗本文所述的任何癌症对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0198]
表5.示例性抗体
[0199][0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204][0205]
抑制剂
[0206]
本公开提供了第二配体(抑制剂)和第二工程化受体，所述第二工程化受体包含与抑制剂配体结合的第二配体结合结构域。
[0207]
本公开提供了包含胞外区的第二工程化受体，所述胞外区包含能够特异性地结合第二配体的第二配体结合结构域，所述第二配体抑制表达所述第一受体和第二受体的效应细胞的激活，其中所述效应细胞通过所述第一配体与所述第一工程化受体的结合而被激活。
[0208]
如本文所用，“抑制剂”或“抑制剂配体”(有时称为“阻断剂”)是指与本公开的工程化受体的第二配体结合结构域(抑制剂lbd)结合、但抑制表达工程化受体的免疫细胞的激活的第二配体。所述抑制剂不被靶细胞表达。抑制剂配体还在多种正常的非靶细胞(包括表达激活剂配体的正常的非靶细胞)中表达，从而保护这些细胞免受过继性细胞疗法的细胞毒性作用。不希望受理论束缚，抑制剂配体可以通过多种机制阻断效应细胞的激活。例如，抑制剂配体与抑制剂lbd的结合可以阻断在激活剂配体与激活剂lbd结合时发生的信号传递，所述信号传递在不存在抑制剂的情况下将导致表达本文所述的工程化受体的免疫细胞的激活。
[0209]
可替代地或另外，抑制剂配体与第二工程化受体的结合可以导致第一激活剂受体从包含本文所述的双受体系统的免疫细胞表面上的细胞表面表达的丢失。不希望受理论束缚，据认为激活剂配体和抑制剂配体在正常细胞上的免疫细胞接合导致抑制剂受体从免疫细胞表面上除去附近的激活剂受体分子。此过程使免疫细胞局部脱敏，可逆地提高其激活阈值。仅与靶细胞上的激活剂配体接合的免疫细胞导致局部激活信号，该局部激活信号不
受来自第二抑制性受体的信号的阻碍。这种局部激活增加直到细胞毒性颗粒的释放导致靶细胞选择性细胞死亡。然而，调节表面受体表达水平可能不是阻断剂受体抑制第一激活剂受体激活免疫细胞的唯一机制。不希望受理论束缚，其他机制可能发挥作用，包括但不限于在激活剂和阻断剂受体信号传导途径之间的串扰。
[0210]
在一些实施方案中，第二配体不由靶细胞表达，并且由非靶细胞表达。在一些实施方案中，所述靶细胞是癌细胞并且所述非靶细胞是非癌细胞。
[0211]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体结合结构域包含scfv结构域。
[0212]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体结合结构域包含仅vβ配体结合结构域。
[0213]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体结合结构域包含分离自或源自t细胞受体(tcr)的抗原结合结构域。例如，第二抑制剂配体结合结构域包含tcrα和β链可变结构域。
[0214]
抑制剂靶标
[0215]
在一些实施方案中，抑制剂配体包含具有跨组织的高度均一的表面表达的基因或其肽抗原。不希望受理论束缚，跨组织的高度均一的表面表达允许抑制剂配体递送大的、甚至抑制性信号。可替代地或另外，激活剂和抑制剂靶标的表达可以是相关的，即二者在非靶细胞上以相似水平表达。
[0216]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体是肽配体。在一些实施方案中，第二抑制剂配体是与主要组织相容性(mhc)i类复合物(肽mhc或pmhc)复合的肽抗原。包含与含有hla-a、hla-b或hla-c中任一者的pmhc复合的肽抗原的抑制剂配体被设想在本公开的范围内。
[0217]
在一些实施方案中，抑制剂配体由在许多肿瘤中不存在或多态的基因编码。
[0218]
区分抑制剂配体在靶细胞与非靶细胞之间的差异表达的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，在非靶细胞和靶细胞中抑制剂配体的存在或不存在可以通过以下方式来测定：用与抑制剂配体结合的抗体的免疫组织化学、随后进行显微镜检查或facs、对靶细胞和非靶细胞的进行rna表达谱分析、或对非靶细胞和靶细胞进行dna测序以确定抑制剂配体的基因组基因座是否在靶细胞或非靶细胞中包含突变。
[0219]
由于杂合性丧失(loh)而导致的等位基因丢失
[0220]
原发性肿瘤中的纯合性缺失是罕见且很少的，因此不可能产生靶标b候选物。例如，在对21种人类癌症类型的2218个原发性肿瘤的分析中，前四种候选物是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2a(cdkn2a)、rb转录辅阻遏物1(rb1)、磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)和n3pb2。然而，在所有癌症中仅在5％纯合缺失中缺失cdkn2a(p16)。在少于0.2％的癌症中发现了纯合hla-a缺失(cheng等人,nature comm.8:1221(2017))。相反，由于半合子状态丧失而导致在癌细胞中基因单拷贝的缺失发生得频繁得多。
[0221]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含由于杂合性丧失而导致在靶细胞中丢失的基因的等位基因。在一些实施方案中，靶细胞包含癌细胞。癌细胞经历频繁的基因组重排，包括复制和缺失。这些缺失可能导致癌细胞中一个或多个基因的一个拷贝的缺失。
[0222]
如本文所用，“杂合性丧失(loh)”是指在癌症中以高频率发生的遗传改变，由此缺失两个等位基因中的一个等位基因，留下单个单等位基因(半合子)基因座。
[0223]
hla i类等位基因
[0224]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含hla i类等位基因。主要组织相容性复合物(mhc)i类是向免疫系统的细胞展示抗原、触发免疫响应的蛋白质复合物。与mhc i类对应
的人白细胞抗原(hla)包括hla-a、hla-b和hla-c。
[0225]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含hla i类等位基因。在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含通过loh在靶细胞中丧失的hla i类的等位基因。hla-a是由hla-a基因座编码的主要组织相容性复合物(mhc)的一组人白细胞抗原(hla)。hla-a是人mhc i类细胞表面受体的三种主要类型之一。所述受体是包含重的α链和较小的β链的异二聚体。α链由hla-a的变体编码，而β链(β2微球蛋白)是不变的。有几千种hla-a变体，所有这些都落入本公开的范围内。
[0226]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含hla-b等位基因。hla-b基因具有许多可能的变异(等位基因)。hla-b基因的数百种形式(等位基因)是已知的，其每一种都提供有特定的编号(例如hla-b27)。
[0227]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含hla-c等位基因。hla-c属于hla i类重链旁系同源物(paralogue)。该i类分子是由重链和轻链组成的异二聚体(β-2微球蛋白)。已经描述了100种以上hla-c等位基因。
[0228]
在一些实施方案中，hla i类等位基因具有广泛或普遍存在的rna表达。
[0229]
在一些实施方案中，hla i类等位基因具有已知的或通常高的次要等位基因频率。
[0230]
在一些实施方案中，hla i类等位基因不需要肽-mhc抗原，例如当hla i类等位基因被泛hla配体结合结构域识别时。
[0231]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含hla-a等位基因。在一些实施方案中，hla-a等位基因包含hla-a*02。本本领域已知的或本文索公开的结合并识别hla-a*02的各种单一可变结构域适合用于实施方案中。此类scfv包括例如但不限于以不依赖肽的方式结合hla-a*02的以下小鼠和人源化scfv抗体，如下表6所示(互补决定区为加下划线的)：
[0232]
表6.hla-a*02 scfv结合结构域
[0233]
[0234]
[0235][0236]
hla-a*02配体结合结构域的示例性重链和轻链cdr(分别为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，或cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)示于下表7中。
[0237]
表7.与hla-a*02抗原结合结构域对应的cdr
[0238][0239]
在一些实施方案中，scfv包含seq id no:41-52中任一者的互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，scfv包含与seq id no:41-52中任一者至少95％同一的序列。在一些实施方案中，scfv包含与seq id no:41-52中任一者同一的序列。在一些实施方案中，抗体的重链包含seq id no:53-64中任一者的重链cdr，并且其中抗体的轻链包含seq id no:53-64中任一者的轻链cdr。在一些实施方案中，抗体的重链包含与seq id no:53-64中任一者的重链部分至少95％同一的序列，并且其中抗体的轻链包含与seq id no:53-64中任一者的轻链部分至少95％同一的序列。
[0240]
在一些实施方案中，抗体的重链包含与seq id no:53-64中任一者的重链部分同一的序列，并且其中抗体的轻链包含与seq id no:53-64中任一者的轻链部分同一的序列。
[0241]
在一些实施方案中，scfv包含与seq id no:53-64中任一者至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或同一的序列。
[0242]
在一些实施方案中，第二抑制性配体是hla-a*02，并且抑制性配体结合结构域包含hla-a*02配体结合结构域。在一些实施方案中，第二配体结合结构域独立于包含hla-a*02的pmhc复合物中的肽结合hla-a*02。在一些实施方案中，hla-a*02配体结合结构域包含scfv结构域。在一些实施方案中，hla-a*02配体结合结构域包含seq id no:53-64中任一者的序列。在一些实施方案中，hla-a*02配体结合结构域包含与seq id no:53-64中任一者的序列至少90％、至少95％或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，hla-a*02配体结合结构域由包含seq id no:179-190中任一者的序列编码。在一些实施方案中，hla-a*02配体结合结构域由与seq id no:179-190中任一者的序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少99％同一性的序列编码。
[0243]
次要组织相容性抗原
[0244]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含次要组织相容性抗原(miha)。在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含通过loh在靶细胞中丧失的miha的等位基因。
[0245]
miha是衍生自在等位基因之间含有非同义差异并由共同hla等位基因展示的蛋白质的肽。所述非同义差异可以由编码miha的基因的编码序列中的snp、缺失、移码突变或插入引起。示例性miha的长度可以为约9-12个氨基酸，并且可以结合mhc i类和mhc ii类蛋白。tcr与展示miha的mhc复合物的结合可以激活t细胞。miha的遗传和免疫学特性将是本领域普通技术人员已知的。候选miha是由已知hla i类等位基因呈现的已知肽，已知其在临床中(例如在移植物抗宿主疾病或移植排斥中)引发t细胞响应，并且允许通过简单的snp基因分型进行患者选择。
[0246]
在一些实施方案中，miha具有广泛或普遍存在的rna表达。
[0247]
在一些实施方案中，miha具有高的次要等位基因频率。
[0248]
在一些实施方案中，miha包含衍生自y染色体基因的肽。
[0249]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含选自表8和表9中所公开的一组miha的miha。
[0250]
下表8中公开了设想在本发明的范围内的示例性但非限制性miha实例。表8中的列从左到右指示miha的名称、其所来源的基因、可以展示miha的mhc i类变体和肽变体[括号中指示a/b变体]的序列)。
[0251]
表8.hla i类常染色体miha。
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256][0257]
下表9中公开了设想在本发明的范围内的示例性但非限制性miha实例。表9中的列从左到右指示miha的名称、其所来源的基因、可以展示miha的mhc i类变体和肽变体[括号中指示a/b变体]的序列)。
[0258]
表9.hla i类y连锁miha
[0259][0260]
在一些实施方案中，miha包含ha-1。ha-1是具有vl[h/r]ddllea(seq id no:273)的序列的肽抗原，并且源自rho型gtp酶激活蛋白45(ha-1)基因。
[0261]
选择性地结合ha-1变体h肽(vlhddllea(seq id no:191))的示例性配体结合结构域示于下表10中。在seq id no:193中的tcrα和tcrβ序列由具有n末端gsg接头的序列atnfsllkqagdveenpgp(seq id no:192)的p2a自切割多肽分开。
[0262]
表10.ftcr ha-1(h)抑制性受体序列
[0263]
[0264][0265]
在一些实施方案中，第二抑制性配体包含ha-1(h)。在一些实施方案中，第二抑制性配体结合结构域分离自或衍生自tcr。在一些实施方案中，第二抑制性配体结合结构域包含tcrα和tcrβ可变结构域。在一些实施方案中，tcrα和tcrβ可变结构域由自切割多肽序列分开。在一些实施方案中，由自切割多肽序列分开的tcrα和tcrβ可变结构域包含seq id no:193。在一些实施方案中，由自切割多肽序列分开的tcrα和tcrβ可变结构域包含seq id no:193或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，tcrα和tcrβ可变结构域由seq id no:194的序列或与其具有至少80％同一性、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列编码。在一些实施方案中，tcrα可变结构域包含seq id no:199或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，tcrβ可变结构域包含seq id no:200或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
[0266]
y染色体抗原的丢失
[0267]
在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含y染色体基因，即由y染色体上的基因编码的肽。在一些实施方案中，第二抑制剂配体包含由y染色体基因编码的肽，所述y染色体基因通过y染色体(loy)丢失而在靶细胞中丢失。例如，约三分之一的特征miha来自y染色体。y染色体含有200个以上的蛋白质编码基因，所有这些基因都设想在本公开的范围内。
[0268]
如本文所用，“y丢失”或“loy”是指在肿瘤中以高频率发生的遗传改变，由此缺失一个拷贝的部分或全部y染色体，导致y染色体编码基因的丢失。
[0269]
已知在某些癌症中发生y染色体丢失。例如，在肾透明细胞癌中报告了40％的y染色体的体细胞丢失(arseneault等人,sci.rep.7:44876(2017))。类似地，在31名男性乳腺癌受试者中的5名受试者中报告了y染色体的克隆丢失(wong等人,oncotarget 6(42):44927-40(2015))。已经将来自男性患者的肿瘤中的y染色体的丢失描述为头颈癌患者的“一致特征”(el-naggar等人,am j clin pathol 105(1):102-8(1996))。此外，在7名胃癌男性患者中的4名患者中，y染色体丢失与x染色体二体性有关(saal等人,virchows arch b cell pathol(1993))。因此，y染色体基因可以在多种癌症中丢失，并且可以与本公开的靶向癌细胞的工程化受体一起用作抑制剂配体。
[0270]
抗原结合结构域
[0271]
本公开提供了第一配体结合结构域和第二配体结合结构域，所述第一配体结合结构域激活第一工程化受体，从而激活表达所述第一工程化受体的免疫细胞，所述第二配体结合结构域激活第二工程化受体，所述第二工程化受体甚至在与所述第一配体结合的第一
工程化受体的存在下抑制对表达所述第二工程化受体的免疫细胞的激活。
[0272]
可以以配体依赖性方式调节受体活性的任何类型的配体结合结构域被设想在本公开的范围内。在一些实施方案中，配体结合结构域是抗原结合结构域。示例性抗原结合结构域尤其包括scfv、sdab、仅vβ结构域以及衍生自tcrα和β链可变结构域的tcr抗原结合结构域。
[0273]
在一些实施方案中，第一激活剂lbd包含抗原结合结构域。在一些实施方案中，第二抑制剂lbd包含抗原结合结构域。任何类型的抗原结合结构域都设想在本公开的范围内。
[0274]
例如，第一激活剂lbd和/或第二抑制剂lbd可以包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域可以表达为连续多肽链的一部分，所述连续多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdab)或重链抗体hcab、从鼠、人源化或人抗体来源的单链抗体(scfv)(harlow等人,1999,于：using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,n.y.；harlow等人,1989,于：antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor,n.y.；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；bird等人,1988,science 242:423-426)。在一些方面，第一激活剂lbd和/或第二抑制剂lbd包含含有抗体片段的抗原结合结构域。在另外的方面，激活剂lbd包含含有scfv或sdab的抗体片段。在另外的方面，抑制剂lbd包含含有scfv或sdab的抗体片段。
[0275]
如本文所用，术语“抗体”是指衍生自与抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以源自天然来源或重组来源。
[0276]
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体的至少一个部分或其重组变体，其含有足以赋予抗体片段对靶标诸如抗原及其限定表位的识别和特异性结合的抗原结合结构域(即完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab
′
、f(ab
′
)2和fv片段、单链(sc)fv(“scfv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdab”)(vl或vh)、骆驼科动物vhh结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0277]
术语“scfv”是指包含含有轻链可变区的至少一个抗体片段和含有重链可变区的至少一个抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链可变区和所述重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接并且能够表达为单个多肽链，并且其中所述scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。
[0278]
关于抗体的“重链可变区”或“vh”(或在单结构域抗体(例如纳米抗体)的情况下，“vhh”)是指重链的片段，其含有插入在称为框架区的侧翼延伸段之间的三个cdr，这些框架区通常比cdr更高度保守并且形成支架以支持cdr。
[0279]
除非另有说明，如本文所用的scfv可以具有以任一顺序(例如，相对于多肽的n末端和c末端)的vl和vh可变区，scfv可以包含vl-接头-vh或可以包含vh-接头-vl。
[0280]
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的那种。卡帕(“k”)和兰布达(“λ”)轻链是指两种主要抗体轻链同种型。
[0281]
术语“重组抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语也应解释为意指通过合成编码抗体的dna分子产生的抗体，并且该dna分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中所述dna或氨基酸序列是使用本领域可用和熟知的重组dna或氨基酸序列技术获得的。
[0282]
术语“vβ结构域”、“仅vβ结构域”、“β链可变结构域”或“单一可变结构域tcr(svd-tcr)”是指在不存在第二tcr可变结构域的情况下与抗原特异性地结合的、基本上由单一t细胞受体(tcr)β可变结构域组成的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd包含仅vβ结构域或基本上由其组成。在一些实施方案中，第二抑制剂lbd包含仅vβ结构域或基本上由其组成。
[0283]
在一些实施方案中，仅vβ结构域可以包括除tcr可变结构域之外的另外元件，包括另外的氨基酸序列、另外的蛋白质结构域(与tcr可变结构域共价缔合、非共价缔合或共价和非共价缔合)、tcr可变结构域与其他类型的大分子(例如多核苷酸、多糖、脂质或其组合)的融合物或非共价缔合物、tcr可变结构域与一种或多种小分子、化合物或配体的融合物或非共价缔合物、或它们的组合。如所描述的，可以组合任何另外的元件，条件是tcr可变结构域被配置成在不存在第二tcr可变结构域的情况下特异性地结合表位。
[0284]
在其他实施方案中，如本文所述的仅vβ结构域独立于缺乏vα区段的α链起作用。例如，在一些实施方案中，所述一个或多个仅vβ结构域与能够响应于抗原而激活t细胞的跨膜结构域蛋白(例如cd3ζ和cd28)和胞内结构域蛋白(例如cd3ζ、cd28和/或4-1bb)融合。
[0285]
在一些实施方案中，仅vβ结构域使用互补决定区(cdr)接合抗原。每个仅vβ结构域含有三个互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)。
[0286]
在一些实施方案中，第一仅vβ结构域包含tcr vβ结构域或其抗原结合片段。
[0287]
在人类中，α和γ链的tcr可变区各自由v和j区段编码，然而β和δ链的可变区各自另外由d区段编码。存在多个可变(v)、多样性(d)和连接(j)基因区段(例如52个vβ基因区段、2个dβ基因区段和13个jβ基因区段)(janeway等人(编辑),2001,immunobiology:the immune system in health and disease.第5版,new york,图4.13)，其可以使用识别与v、d和j基因区段的编码序列相邻的重组信号序列(rss)的酶rag-1和rag-2以不同的v(d)j排列进行重组。rss由被12或23bp的间隔区隔开的保守七聚体和九聚体组成。在每个v区段的3'侧、在每个d区段的5'和3'两侧、以及在每个j区段的5'侧发现有rss。在重组期间，rag-1和rag-2导致在连接产物的编码末端形成dna发夹(编码连接产物)并除去rss和在它们之间的间插序列(信号连接产物)。通过可变数量的编码末端核苷酸的缺失、通过末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)随机添加核苷酸、以及由于不对称切割的编码发夹的模板介导的填充而产生的回文核苷酸，可变区在连接处进一步多样化。
[0288]
专利申请wo 2009/129247(以引用的方式整体并入本文中)公开了利用v(d)j重组以在体外产生从头抗体的一种体外系统(称为hutarg系统)。通过使用tcr特异性v、d和j元件，使用与在专利申请wo 2017/091905(以引用的方式整体并入本文中)中此相同的系统产生仅vβ结构域的可变区。在天然的体内系统中，编码cdr1和cdr2的核酸序列包含在v(α、β、γ或δ)基因区段内，并且编码cdr3的序列由v和j区段的部分组成(对于vα或vγ)或由v区段的一部分、整个d区段以及j区段的一部分组成(对于vβ或vδ)，但由于tdt和其他重组和dna修复酶的作用在v-j和v-d-j重组连接处具有核苷酸的随机插入和缺失。重组的t细胞受体基因包含交替的框架(fr)和cdr序列，由此表达的所得t细胞受体(即fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4)也是如此。使用体外v(d)j重组(即v-j或v-d-j重组)，可以在cdr1、cdr2和/或cdr3(即不仅仅是cdr3)之中或附近添加随机化插入和缺失，可以使用重组底物中的侧翼序列在cdr1、cdr2和/或cdr3之前和/或之后添加另外的插入，并且可以通过缺失在cdr1、
cdr2和/或cdr3之中或附近的重组底物中的序列来进行另外的缺失。
[0289]
在一些实施方案中，鉴定了在不存在tcr vα链的情况下特异性地结合表位的tcr vβ链。在不存在tcr vα链的情况下结合表位的示例性cdr3氨基酸序列列于下表11中。
[0290]
表11.鉴定的vβ结构域的cdr3氨基酸序列
[0291][0292][0293]
在一些实施方案中，仅vβ结构域在不存在第二tcr可变结构域的情况下特异性地结合表位，并且由位于由fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4区域限定的可变结构域侧翼的任选的n末端和/或c末端氨基酸序列(具有任何长度或序列)组成。fr1、fr2、fr3和fr4可以从天然vα、vβ、vγ或vδ结构域获得或由天然vα、vβ、vγ或vδ基因区段编码，但任选地包括独立地在fr1的c末端、fr2的n末端、fr2的c末端、fr3的n末端、fr3的c末端和fr4的n末端中的一个或多个处的氨基酸(例如0个、1个、2个、3个、4个、5个或多于5个氨基酸)的缺失或插入。cdr1、cdr2和cdr3可以从天然vα、vβ、vγ或vδ结构域获得或由天然vα、vβ、vγ或vδ基因区段编码，但其中cdr1、cdr2和cdr3中的一个或多个独立地在c末端、n末端或在cdr序列内的任何地方含有插入(例如0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或多于10个氨基酸)和/或缺失(例如0个、1个、2个、3个、4个、5个或多于5个氨基酸)。在一些实施方案中，cdr1在n末端、c末端或在内部含有氨基酸的插入或缺失，其中保留了至少50％(或任选地60％、70％或80％)的天然cdr氨基酸残基。在一些实施方案中，cdr2在n末端、c末端或在内部含有氨基酸的插入或缺失，其中保留了至少50％(或任选地60％、70％或80％)的天然cdr氨基酸残基。在一些实施方案中，cdr3在n末端、c末端或在内部含有氨基酸的插入或缺失，其中保留了至少50％(或任选地60％、70％或80％)的天然cdr氨基酸残基。插入和/或缺失可以由于体外v(d)j重组方法或通过tdt和重组酶和dna修复酶(例如artemis核酸酶、nda依赖性蛋白激酶(dna-pk)、x射线修复交叉互补蛋白4(xrcc4)、dna连接酶iv、非同源末端连接因子1(nhej1)、paxx和dna聚合酶λ和μ中的一种或多种)的体外作用产生。插入和/或缺失(其包括置换)可以进一步由体外v(d)j重组底物的cdr核酸序列的插入和/或缺失引起。仅vβ结构域还可以包含tcr恒定区或其部分。仅vβ结构域可以与另外的蛋白质结构域融合和/或复合。可以在体外使用上述重组酶和dna修复酶之前在dna中引入双链断裂。仅vβ结构域可以是(或可以掺入)融合蛋白。如本文所用，术语“融合蛋白”意指由至少一种核酸编码序
列编码的蛋白质，所述核酸编码序列由来自单独基因的两种或更多种编码序列的融合物组成，无论那些基因的生物体来源是相同的还是不同的。
[0294]
在一些实施方案中，第一激活剂lbd包含scfv结构域，并且第二抑制剂lbd包含仅vβ结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd包含仅vβ结构域，并且第二抑制剂lbd包含scfv结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd和第二抑制剂lbd两者都是scfv结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd和第二抑制剂lbd两者都是仅vβ结构域。
[0295]
与本公开的激活剂和/或抑制剂受体一起使用的另外的抗原结合结构域描述于下表12中。在表12中，将构建体的名称描述为scfv抑制剂名称[b]/scfv激活剂名称[a]。在一些实施方案中，第一配体结合结构域或第二配体结合结构域包含seq id no:210、seq id no:212、seq id no:214、seq id no:216、seq id no:218、seq id no:220、seq id no:222或seq id no:224中任一者的序列或与其具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
[0296]
表12.另外的抗原结合结构域序列
[0297]
[0298]
[0299][0300]
工程化受体
[0301]
本公开提供了包含本文所述的第一激活剂配体结合结构域的第一工程化受体和包含第二抑制剂配体结合结构域的第二工程化受体。
[0302]
嵌合抗原受体(car)
[0303]
在一些实施方案中，第一工程化受体或第二工程化受体是嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，第一工程化受体和第二工程化受体是嵌合抗原受体。所有car架构都被设想为在本公开的范围内。
[0304]
胞外结构域
[0305]
在一些实施方案中，第一配体结合结构域或第二配体结合结构域与car的胞外结构域融合。
[0306]
铰链区
[0307]
在一些实施方案中，本公开的car包含胞外铰链区。铰链区的掺入可以影响car-t细胞的细胞因子产生并改善car-t细胞的体内扩增。示例性铰链可以分离自或衍生自igd和cd8结构域，例如igg1。
[0308]
在一些实施方案中，铰链分离自或衍生自cd8α或cd28。在一些实施方案中，cd8α铰链包含与tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no:1)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd8α铰链包含seq id no:1。在一些实施方案中，cd8α铰链基本上由seq id no:1组成。在一些实施方案中，cd8α铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0309]
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat(seq id no:2)。
[0310]
在一些实施方案中，所述cd8α铰链由seq id no:2编码。
[0311]
在一些实施方案中，cd28铰链包含与ctievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp(seq id no:3)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd28铰链包含seq id no:3或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd28铰链由与tgtaccattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc(seq id no:4)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码。
[0312]
在一些实施方案中，所述cd28铰链由seq id no:4编码。
[0313]
跨膜结构域
[0314]
本公开的car可以被设计成包含与car的胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施方案中，使用与car中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。例如，包含cd28共刺激结构
域的car也可以使用cd28跨膜结构域。在一些情形中，可以通过氨基酸置换来选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
[0315]
跨膜结构域可以源自天然来源或来自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区可以分离自或源自t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154，或来自免疫球蛋白诸如igg4(即至少包含它们的跨膜区)。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基(诸如亮氨酸和缬氨酸)。在一些实施方案中，将在合成跨膜结构域的每个末端找到苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度在2个与10个氨基酸之间)可以在car的跨膜结构域和胞质信号结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
[0316]
在本公开的car的一些实施方案中，car包含cd28跨膜结构域。在一些实施方案中，cd28跨膜结构域包含与fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no:5)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd28跨膜结构域包含seq id no:5或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd28跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0317][0318]
在一些实施方案中，cd28跨膜结构域由seq id no:6编码。
[0319]
在本公开的car的一些实施方案中，car包含il-2rβ跨膜结构域。在一些实施方案中，il-2rβ跨膜结构域包含与ipwlghllvglsgafgfiilvylli(seq id no:7)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，il-2rβ跨膜结构域包含seq id no:7或基本上由其组成。在一些实施方案中，il-2rβ跨膜结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0320][0321]
在一些实施方案中，il-2rβ跨膜结构域由seq id no:8编码。
[0322]
胞质结构域
[0323]
本发明的car的胞质结构域或另外胞内信号传导结构域负责激活其中已经放置car的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。调节t细胞的效应子功能例如包括抑制或下调效应t细胞的诱导或增殖。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的一部分。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个结构域。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用此类截短部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号即可。在一些情况下，可以组合多个胞内结构域以实现本公开的car-t细胞的期望功能。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括一个或多个胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
[0324]
用于本公开的car中的胞内信号传导结构域的实例包括t细胞受体(tcr)和协同起作用以引发抗原受体接合后的信号转导的共同受体的胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
[0325]
因此，本公开的car的胞内结构域包含至少一个胞质激活结构域。在一些实施方案中，胞内激活结构域确保存在激活car t细胞的效应子功能所必需的t细胞受体(tcr)信号传导。在一些实施方案中，所述至少一个胞质激活是cd247分子(cd3ζ)激活结构域、刺激性杀伤免疫球蛋白样受体(kir)kir2ds2激活结构域或12kda dnax激活蛋白(dap12)激活结构域。在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域包含与rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:9)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。
[0326]
在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域包含seq id no:9或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0327][0328]
在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域由seq id no:10编码。
[0329]
已知通过单独的tcr产生的信号通常不足以完全激活t细胞并且还需要二级或共刺激信号。因此，t细胞激活可以说是由两个不同类别的胞质信号传导序列介导：通过tcr引发抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
[0330]
初级胞质信号传导序列以刺激性方式或以抑制性方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激性方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam)。在一些实施方案中，itam含有通过任何两个其他氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸分开的酪氨酸(yxxl)(seq id no:21)。
[0331]
在一些实施方案中，胞质结构域含有1个、2个或3个itam。在一些实施方案中，胞质结构域含有1个itam。在一些实施方案中，胞质结构域含有2个itam。在一些实施方案中，胞质结构域含有3个itam。在一些实施方案中，胞质结构域含有4个itam。在一些实施方案中，胞质结构域含有5个itam。
[0332]
在一些实施方案中，胞质结构域是cd3ζ激活结构域。在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域包含单个itam。在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域包含两个itam。在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域包含三个itam。
[0333]
在一些实施方案中，包含单个itam的cd3ζ激活结构域包含与rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvlhmqalppr(seq id no:11)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域包含seq id no:11。在一些实施方案中，包含单个itam的cd3ζ激活结构域基本上由rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvlhmqalppr(seq id no:11)组成。在一些实施方案
中，包含单个itam的cd3ζ激活结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0334][0335]
在一些实施方案中，cd3ζ激活结构域由seq id no:12编码。
[0336]
可以用于本公开的car中的含有初级胞质信号传导序列的itam的另外实例包括衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。特别优选的是，本发明的car中的胞质信号传导分子包含衍生自cd3ζ的胞质信号传导序列。
[0337]
共刺激结构域
[0338]
在一些实施方案中，car的胞质结构域可以被设计为包含cd3ζ信号传导结构域本身或与在本公开的car的上下文中有用的任何其他期望的胞质结构域组合。例如，car的胞质结构域可以包含cd3ζ链部分和共刺激结构域。共刺激结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的car的一部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效响应所需的。此类分子的实例包括共刺激结构域，其选自由以下组成的组：il-2rβ、fc受体γ(fcrγ)、fc受体β(fcrβ)、cd3g分子γ(cd3γ)、cd3δ、cd3ε、cd5分子(cd5)、cd22分子(cd22)、cd79a分子(cd79a)、cd79b分子(cd79b)、癌胚抗原相关细胞粘附分子3(cd66d)、cd27分子(cd27)、cd28分子(cd28)、tnf受体超家族成员9(4-1bb)、tnf受体超家族成员4(ox40)、tnf受体超家族成员8(cd30)、cd40分子(cd40)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、t细胞可诱导共刺激分子(icos)、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2分子(cd2)、cd7分子(cd7)、tnf超家族成员14(light)、杀伤细胞凝集素样受体c2(nkg2c)和cd276分子(b7-h3)共刺激结构域、或它们的功能片段。
[0339]
本公开的car的胞质信号传导部分内的胞质结构域可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头(例如长度在2个与10个氨基酸之间)可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了合适接头的实例。
[0340]
在一些实施方案中，本公开的car的胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域分离自或衍生自cd28。在一些实施方案中，cd28共刺激结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：
[0341][0342]
在一些实施方案中，cd28共刺激结构域包含seq id no:13或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd28共刺激结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0343][0344]
在一些实施方案中，cd28共刺激结构域由seq id no:14编码。
[0345]
在一些实施方案中，本公开的car的胞内结构域包含白细胞介素-2受体β链(il-2rβ或il-2r-β)胞质结构域。在一些实施方案中，il-2rβ结构域是截短的。在一些实施方案中，il-2rβ胞质结构域包含一个或多个stat5募集基序。在一些实施方案中，car在il-2rβ胞质
结构域之外包含一个或多个stat5募集基序。
[0346]
在一些实施方案中，il-2rβ胞内结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：
[0347][0348]
在一些实施方案中，il2r-β胞内结构域包含seq id no:15或基本上由其组成。在一些实施方案中，il-2r-β胞内结构域由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0349][0350]
在一些实施方案中，il-2r-β胞内结构域由seq id no:16编码。
[0351]
在一个实施方案中，il-2r-β胞质结构域包含一个或多个stat5募集基序。示例性stat5募集基序由以下参考文献提供：passerini等人(2008)stat5-signaling cytokines regulate the expression of foxp3 in cd4 cd25 regulatory t cells and cd4 cd25 effector tcells.international immunology,第20卷,第3期,第421-431页，以及kagoya等人(2018)a novel chimeric antigen receptor containing a jak
–
stat signaling domain mediates superior antitumor effects.nature medicine doi:10.1038/nm.4478。
[0352]
在一些实施方案中，stat5募集基序由序列tyr-leu-ser-leu(seq id no:17)组成。
[0353]
抑制性结构域
[0354]
在一些实施方案中，例如在提供抑制性信号的本公开的第二工程化受体中，抑制性信号通过受体的胞内结构域传递。在一些实施方案中，工程化受体包含抑制性胞内结构域。在一些实施方案中，第二工程化受体是包含抑制性胞内结构域的car(抑制性car)。
[0355]
在一些实施方案中，抑制性胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。在一些实施方案中，包含itim的抑制性胞内结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，诸如ctla-4和pd-1。ctla-4和pd-1是在t细胞表面上表达的免疫抑制性受体，并且在减弱或终止t细胞响应中起关键作用。
[0356]
抑制性结构域可以分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)受体和cd200受体1。
[0357]
在一些实施方案中，抑制性结构域包含胞内结构域、跨膜结构域或它们的组合。在一些实施方案中，抑制结构域包含胞内结构域、跨膜结构域、铰链区或它们的组合。在一些实施方案中，抑制性结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。在一些实施方案中，包含itim的抑制性结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，诸如ctla-4和pd-1。
[0358]
抑制性结构域可以分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)受体和cd200受体1。在一些实施方案中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白，例如人trail受体、
ctla-4或pd-1蛋白。在一些实施方案中，trail受体包含tr10a、tr10b或tr10d。
[0359]
内源性trail表达为281个氨基酸的ii型跨膜蛋白，其锚定在质膜上并呈递在细胞表面上。trail由自然杀伤细胞表达，其在细胞-细胞接触建立后可以诱导靶细胞中的trail依赖性凋亡。在生理学上，显示trail信号传导系统对于免疫监视，对于通过调节t辅助细胞1与t辅助细胞2以及“无帮助”cd8 t细胞数量来塑造免疫系统以及对于抑制自发肿瘤形成是必需的。
[0360]
在一些实施方案中，抑制性结构域包含分离自或衍生自cd200受体的胞内结构域。细胞表面糖蛋白cd200受体1(uniprot参考：q8td46)代表本发明的抑制性胞内结构域的另一个实例。cd200/ox2细胞表面糖蛋白的这种抑制性受体通过抑制促炎症分子(包括tnf-α、干扰素和诱导型一氧化氮合酶(inos))响应于所选刺激的表达来限制炎症。
[0361]
在一些实施方案中，工程化受体包含一个从杀伤细胞免疫球蛋白样受体分离或衍生的抑制性结构域、三个ig结构域和长胞质尾2(kir3dl2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个ig结构域和长胞质尾3(kir3dl3)、白细胞免疫球蛋白样受体b1(lir1，也称为lir-1和lilrb1)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、fcγ受体iib(fcgriib)、杀伤细胞凝集素样受体k1(nkg2d)、ctla-4、含有合成共有itim的结构域、zap70 sh2结构域(例如，n和c末端sh2结构域中的一个或两个)或zap70 ki_k369a(激酶失活zap70)。
[0362]
在一些实施方案中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白质。
[0363]
在一些实施方案中，第二抑制性受体包含从相同蛋白质(例如含itim的蛋白质)分离或衍生的胞质结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，第二抑制性受体包含分离自或衍生自分离自或衍生自相同蛋白质(例如含itim的蛋白质)的胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，第二抑制性受体包含从与胞内结构域和/或跨膜结构域相同的蛋白质(例如含itim的蛋白质)分离或衍生分离或衍生的铰链区。
[0364]
在一些实施方案中，第二抑制性工程化受体包含抑制性结构域。在一些实施方案中，第二抑制性工程化受体包含抑制性胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施方案中，第二工程化受体是包含抑制性结构域的car(抑制性car)。在一些实施方案中，抑制性胞内结构域与car的胞内结构域融合。在一些实施方案中，抑制性胞内结构域与car的跨膜结构域融合。
[0365]
t细胞受体(tcr)
[0366]
在一些实施方案中，第一工程化受体或第二工程化受体是t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，第一工程化受体和第二工程化受体是t细胞受体(tcr)。
[0367]
如本文所用，“tcr”(有时也称为“tcr复合物”或“tcr/cd3复合物”)是指包含tcrα链、tcrβ链和一种或多种不变cd3链(ζ、γ、δ和ε)(有时称为亚基)的蛋白质复合物。tcrα和β链可以是二硫键连接的，以作为异二聚体结合肽-mhc复合物。一旦tcrα/β异二聚体接合肽-mhc，就会诱导缔合的不变cd3亚基中的tcr复合物的构象变化，这导致它们的磷酸化并与下游蛋白质缔合，从而转导初级刺激信号。在示例性tcr复合物中，tcrα和tcrβ多肽形成异二聚体，cd3ε和cd3δ形成异二聚体，cd3ε和cd3γ形成异二聚体，并且两个cd3ζ形成同二聚体。
[0368]
胞外结构域
[0369]
本公开提供了包含第一胞外配体结合结构域的第一工程化受体和包含第二胞外配体结合结构域的第二工程化受体。第一工程化受体、第二工程化受体或二者可以为tcr。
任何合适的配体结合结构域都可以与本文所述的工程化tcr的胞外结构域、铰链结构域或跨膜结构域融合。
[0370]
在一些实施方案中，第一配体结合结构域和/或第二配体结合结构域与tcr亚基的胞外结构域融合。tcr亚基可以是tcrα、tcrβ、cd3δ、cd3ε或cd3γ。在一些实施方案中，第一配体结合结构域和第二配体结合结构域两者与不同tcr受体中的相同tcr亚基融合。在一些实施方案中，第一配体结合结构域和第二配体结合结构域与不同tcr受体中的不同tcr亚基融合。在一些实施方案中，第一激活剂配体结合结构域与第一工程化受体中的第一tcr亚基融合，并且第二抑制剂配体结合结构域与第二工程化受体中的第二tcr亚基融合。在一些实施方案中，第一和第二tcr亚基是不同的亚基。在一些实施方案中，第一和第二tcr亚基是相同的亚基。例如，第一配体结合结构域可以与tcrα融合，并且第二配体结合结构域可以与tcrβ融合。作为另外的实例，第一配体结合结构域与tcrβ融合，并且第二配体结合结构域与tcrα融合。
[0371]
在一些实施方案中，第一激活剂lbd包含scfv结构域，并且第二抑制剂lbd包含仅vβ结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd包含仅vβ结构域，并且第二抑制剂lbd包含scfv结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd和第二抑制剂lbd两者都是scfv结构域。在一些实施方案中，第一激活剂lbd和第二抑制剂lbd两者都是仅vβ结构域。
[0372]
在一些实施方案中，本公开的第一工程化tcr包含含有仅vβ结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含一个或多个外源结构域。
[0373]
在一些实施方案中，本公开的第一工程化tcr包含含有scfv结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含一个或多个外源结构域。
[0374]
在一些实施方案中，本公开的第二工程化tcr包含含有仅vβ结构域的胞外结构域、跨膜结构域和抑制性胞内结构域。
[0375]
在一些实施方案中，本公开的第二工程化tcr包含含有scfv结构域的胞外结构域、跨膜结构域和抑制性胞内结构域。
[0376]
tcr亚基包括tcrα、tcrβ、cd3ζ、cd3δ、cd3γ和cd3ε。tcrα、tcrβ链、cd3γ、cd3δ或cd3ε或它们的片段或衍生物中的任一者或多者可以与能够提供本公开的刺激信号的一个或多个结构域融合，从而增强tcr功能和活性。tcrα、tcrβ链、cd3γ、cd3δ或cd3ε或它们的片段或衍生物中的任一者或多者可以与本公开的抑制性胞内结构域融合。
[0377]
在一些实施方案中，例如其中第一工程化受体或第二工程化受体包含第一多肽和第二多肽的那些实施方案中，抗原结合结构域分离自或衍生自t细胞受体(tcr)胞外结构域或抗体。
[0378]
在一些实施方案中，第一工程化受体和第二工程化受体包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。可以在与胞内结构域相同或不同的多肽上提供工程化受体的一个或多个抗原结合结构域。
[0379]
在一些实施方案中，第一工程化受体和/或第二工程化受体的抗原结合结构域包含单链可变片段(scfv)。
[0380]
在一些实施方案中，第一工程化受体和/或第二工程化受体包含第二多肽。本公开提供了具有两个多肽的受体，所述两个多肽各自具有配体结合结构域的一部分(例如异二聚体ldb(诸如基于tcrα/β或fab的lbd)的同源物)。本公开还提供了具有两个多肽的受体，
所述两个多肽各自具有配体结合结构域的一部分(例如异二聚体ldb(诸如基于tcrα/β或fab的lbd)的同源物)以及与铰链或跨膜结构域融合的配体结合结构域的一部分，而所述配体结合结构域的另一部分不具有胞内结构域。另外的变异包括其中每个多肽具有铰链结构域并且其中每个多肽具有铰链和跨膜结构域的受体。在一些实施方案中，铰链结构域不存在。在其他实施方案中，铰链结构域是近膜胞外区(mper)，诸如lilrb1 d3d4结构域。
[0381]
在一些实施方案中，例如在第一工程化受体和/或第二工程化受体包含至少两个多肽的那些实施方案中，第一多肽包含抗体的第一条链并且第二多肽包含所述抗体的第二条链。
[0382]
在一些实施方案中，所述受体包含抗体的fab片段。在实施方案中，第一多肽包含抗体重链的抗原结合片段和胞内结构域，并且第二多肽包含抗体轻链的抗原结合片段。在一些实施方案中，第一多肽包含抗体轻链的抗原结合片段和胞内结构域，并且第二多肽包含抗体重链的抗原结合片段。
[0383]
在一些实施方案中，第一工程化受体和/或第二工程化受体包含t细胞受体(tcr)的胞外片段。在一些实施方案中，第一多肽包含tcrα链的抗原结合片段和胞内结构域，并且第二多肽包含tcrβ链的抗原结合片段。在一些实施方案中，第一多肽包含tcrβ链的抗原结合片段和胞内结构域，并且第二多肽包含tcrα链的抗原结合片段。
[0384]
包含仅vβ结构域的tcr
[0385]
本公开的某些实施方案涉及包含tcr可变结构域的工程化tcr，所述tcr可变结构域在不存在第二tcr可变结构域(仅vβ结构域)的情况下特异性地结合抗原。
[0386]
在一些实施方案中，工程化tcr包含除tcr可变结构域之外的另外元件，包括另外的氨基酸序列、另外的蛋白质结构域(与tcr可变结构域共价缔合、非共价缔合或共价和非共价缔合)、tcr可变结构域与其他类型的大分子(例如多核苷酸、多糖、脂质或其组合)的融合物或非共价缔合物、tcr可变结构域与一种或多种小分子、化合物或配体的融合物或非共价缔合物、或它们的组合。如所描述的，可以组合任何另外的元件，条件是tcr可变结构域被配置成在不存在第二tcr可变结构域的情况下特异性地结合表位。
[0387]
如本文所述的包含仅vβ结构域的工程化tcr可以包含单一tcr链(例如α、β、γ或δ链)，或者其可以包含单一tcr可变结构域(例如α、β、γ或δ链的)。如果工程化tcr为单一tcr链，则tcr链包含跨膜结构域、恒定结构域(或c结构域)和可变结构域(或v结构域)，并且不包含第二tcr可变结构域。因此，工程化tcr可以包含tcrα链、tcrβ链、tcrγ链或tcrδ链或由其组成。工程化tcr可以是膜结合蛋白。可替代地，工程化tcr可以是膜相关蛋白。
[0388]
在一些实施方案中，如本文所述的工程化tcr利用缺乏vα区段的替代α链，其形成与六个cd3亚基复合的具有激活能力的tcr。
[0389]
在其他实施方案中，如本文所述的工程化tcr独立于缺乏vα区段的替代α链起作用。例如，在一些实施方案中，所述一种或多种工程化tcr与能够响应于抗原而激活t细胞的跨膜结构域蛋白(例如cd3ζ和cd28)和胞内结构域蛋白(例如cd3ζ、cd28和/或4-1bb)融合。
[0390]
在一些实施方案中，工程化tcr包含与本文所述的仅vβ结构域融合的一条或多条单一tcr链。例如，工程化tcr可以包含与一个或多个仅vβ结构域融合的单一αtcr链、单一βtcr链、单一γtcr链或单一δtcr链或基本上由其组成。
[0391]
在一些实施方案中，工程化tcr使用互补决定区(cdr)接合抗原。每种工程化tcr含
有三个互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)。
[0392]
第一配体和/或第二配体仅vβ结合结构域可以是人tcr可变结构域。可替代地，第一和/或第二仅vβ结构域可以是非人tcr可变结构域。第一和/或第二仅vβ结构域可以是哺乳动物tcr可变结构域。第一和/或第二仅vβ结构域可以是脊椎动物tcr可变结构域。
[0393]
在实施方案中，其中仅vβ结构域掺入融合蛋白(例如包含tcr亚基和任选地另外的刺激性胞内结构域的融合蛋白)中。融合蛋白可以包含仅vβ结构域和一个或多个任何其他蛋白质结构域。
[0394]
跨膜结构域
[0395]
本公开提供了包含第一激活剂lbd的第一融合蛋白和包含第二抑制剂lbd和抑制剂胞内结构域的第二融合蛋白。在一些实施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白包含跨膜结构域。
[0396]
本公开提供了包含跨膜结构域和能够提供刺激信号或抑制信号的胞内结构域的多肽。在一些实施方案中，工程化tcr包含多个能够提供刺激信号的胞内结构域。
[0397]
如本文所用的“跨膜结构域”是指跨越细胞膜的蛋白质的结构域。跨膜结构域通常主要由非极性氨基酸组成，并且可以横穿脂质双层一次或几次。跨膜结构域通常包含α螺旋，这是一种使内部氢键最大化的构型。
[0398]
从任何来源分离或衍生的跨膜结构域被设想在本公开的融合蛋白的范围内。
[0399]
在一些实施方案中，跨膜结构域是与融合蛋白的其他结构域中的一个结构域缔合的跨膜结构域，或从与融合蛋白的其他结构域中的一个结构域相同的蛋白质分离或衍生的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域和第二胞内结构域来自相同的蛋白质，例如tcr复合物亚基，诸如tcrα、tcrβ、cd3δ、cd3ε或cd3γ。在一些实施方案中，胞外结构域(svd-tcr)、跨膜结构域和第二胞内结构域来自相同的蛋白质，例如tcr复合物亚基，诸如tcrα、tcrβ、cd3δ、cd3ε或cd3γ。在其他实施方案中，胞外结构域(包含一个或多个配体结合结构域，诸如仅vβ结构域和scfv结构域)、跨膜结构域和胞内结构域来自不同的蛋白质。例如，在一些实施方案中，工程化svd-tcr包含cd28跨膜结构域与cd28、4-1bb和cd3ζ胞内结构域。
[0400]
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
[0401]
在一些实施方案中，每当tcr复合物已结合靶标时，跨膜结构域都能够将信号传导至胞内结构域。本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如tcr的α、β或ζ链、cd3δ、cd3ε或cd3γ、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154的跨膜区。
[0402]
在一些实施方案中，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白的铰链)附接至融合蛋白的胞外区，例如tcrα或β链的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(ig)铰链，例如igg4铰链或cd8a铰链。
[0403]
在一些实施方案中，铰链分离自或衍生自cd8α或cd28。在一些实施方案中，cd8α铰链包含与tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no:1)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd8α铰链包含seq id no:1。在一些实施方案中，cd8α铰链基本上由seq id no:1组成。在一些实施方案中，cd8α铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少
90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0404]
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat(seq id no:2)。
[0405]
在一些实施方案中，所述cd8α铰链由seq id no:2编码。
[0406]
在一些实施方案中，cd28铰链包含与ctievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskp(seq id no:3)的序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd28铰链包含seq id no:3或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd28铰链由与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或同一的核苷酸序列编码：
[0407]
tgtaccattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc(seq id no:4)。
[0408]
在一些实施方案中，所述cd28铰链由seq id no:4编码。
[0409]
在一些实施方案中，跨膜结构域包含tcrα跨膜结构域。在一些实施方案中，tcrα跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：vigfrilllkvagfnllmtlrlw(seq id no:26)。在一些实施方案中，tcrα跨膜结构域包含seq id no:26或基本上由其组成。在一些实施方案中，tcrα跨膜结构域由以下序列编码：
[0410]
gtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtgg(seq id no:27)。
[0411]
在一些实施方案中，跨膜结构域包含tcrβ跨膜结构域。在一些实施方案中，tcrβ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：tilyeillgkatlyavlvsalvl(seq id no:28)。在一些实施方案中，tcrβ跨膜结构域包含seq id no:28或基本上由其组成。在一些实施方案中，tcrβ跨膜结构域由以下序列编码：
[0412]
accatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctg(seq id no:20)。
[0413]
在一些实施方案中，跨膜结构域包含cd3ζ跨膜结构域。在一些实施方案中，cd3ζ跨膜结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：lcylldgilfiygviltalfl(seq id no:29)。在一些实施方案中，cd3ζ跨膜结构域包含seq id no:29或基本上由其组成。
[0414]
跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与衍生出跨膜区的蛋白质的胞外区缔合的一个或多个氨基酸(例如，胞外区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或至多15个氨基酸)和/或与衍生出跨膜蛋白的蛋白质的胞内区缔合的一个或多个另外的氨基酸(例如，胞内区的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或至多15个氨基酸)。
[0415]
在一些实施方案中，可以通过氨基酸置换来选择或修饰跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互
作用最小化。
[0416]
当存在时，跨膜结构域可以是天然tcr跨膜结构域、来自异源膜蛋白的天然跨膜结构域或人工跨膜结构域。跨膜结构域可以是膜锚定结构域。在没有限制的情况下，天然或人工跨膜结构域可以包含约20个氨基酸的疏水性α螺旋，通常在跨膜区段侧翼带有正电荷。跨膜结构域可以具有一个跨膜区段或多于一个跨膜区段。跨膜结构域/区段的预测可以使用公众可获得的预测工具(例如tmhmm，krogh等人journal of molecular biology 2001；305(3):567-580；或tmpred,hofmann和stoffel biol.chem.hoppe-seyler 1993；347:166)进行。膜锚定系统的非限制性实例包括血小板衍生的生长因子受体(pdgfr)跨膜结构域、糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定(翻译后添加到信号序列)等。
[0417]
胞内结构域
[0418]
本公开提供了包含胞内结构域的融合蛋白。如本文所用的术语“胞内结构域”是指蛋白质的细胞内部分。
[0419]
在一些实施方案中，胞内结构域包含能够向跨膜结构域提供刺激信号的一个或多个结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一胞内结构域和能够提供刺激信号的第二胞内结构域。在其他实施方案中，胞内结构域包含能够提供刺激信号的第一、第二和第三胞内结构域。能够提供刺激信号的胞内结构域选自由以下组成的组：cd28分子(cd28)结构域、lck原癌基因、src家族酪氨酸激酶(lck)结构域、tnf受体超家族成员9(4-1bb)结构域、tnf受体超家族成员18(gitr)结构域、cd4分子(cd4)结构域、cd8a分子(cd8a)结构域、fyn原癌基因、src家族酪氨酸激酶(fyn)结构域、t细胞受体相关蛋白激酶70ζ链(zap70)结构域、激活t细胞的接头(lat)结构域、淋巴细胞细胞溶质蛋白2(slp76)结构域、(tcr)α、tcrβ、cd3δ、cd3γ和cd3ε胞内结构域。
[0420]
在一些实施方案中，胞内结构域包含至少一个胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域产生促进细胞功能(例如含tcr的细胞(例如表达tcr的t细胞)的免疫效应子功能)的信号。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的胞内结构域包含至少一个胞内信号传导结构域。例如，cd3γ、δ或ε的胞内结构域包含信号传导结构域。
[0421]
在一些实施方案中，胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域分离自或衍生自相同的蛋白质，例如t细胞受体(tcr)α、tcrβ、cd3δ、cd3γ或cd3ε。
[0422]
用于本公开的融合蛋白中的胞内结构域的实例包括tcrα、tcrβ、cd3ζ和4-1bb的胞质序列、以及在抗原受体接合后共同起作用以启动信号转导的胞内信号传导共受体、以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
[0423]
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括衍生自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的蛋白质的那些。
[0424]
胞内信号传导结构域通常负责激活其中已经引入了融合蛋白的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的一部分。
[0425]
虽然在一些情况下可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个胞内信号传导结构域。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用此类截短部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号即可。因此，术语胞内信号传导结构域意
指包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
[0426]
在一些实施方案中，胞内结构域包含cd3δ胞内结构域。在一些实施方案中，cd3δ胞内结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：
[0427]
ghetgrlsgaadtqallrndqvyqplrdrddaqyshlggnwarnkggsrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:30)。
[0428]
在一些实施方案中，cd3δ胞内结构域包含seq id no:30或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd3δ胞内结构域由以下序列编码：
[0429][0430]
在一些实施方案中，胞内结构域包含cd3ε胞内结构域。在一些实施方案中，cd3ε胞内结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：knrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerpppvpnpdyepirkgqrdlysglnqrriggsrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:32)。在一些实施方案中，cd3ε胞内结构域包含seq id no:32或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd3ε胞内结构域由以下序列编码：
[0431][0432]
在一些实施方案中，胞内结构域包含cd3γ胞内结构域。在一些实施方案中，cd3γ胞内结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：
[0433]
gqdgvrqsrasdkqtllpndqlyqplkdreddqyshlqgnqlrrnggsrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:33)。
[0434]
在一些实施方案中，cd3γ胞内结构域包含seq id no:33或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd3γ胞内结构域由以下序列编码：
[0435][0436]
在一些实施方案中，胞内结构域包含cd3ζ胞内结构域。在一些实施方案中，cd3ζ胞内结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：
[0437]
rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:9)或其子序列。
[0438]
在一些实施方案中，cd3ζ胞内结构域包含seq id no:9或基本上由其组成。
[0439]
在一些实施方案中，胞内结构域包含tcrα胞内结构域。在一些实施方案中，tcrα胞内结构域包含ser-ser。在一些实施方案中，tcrα胞内结构域由tccagc序列编码。
[0440]
在一些实施方案中，胞内结构域包含tcrβ胞内结构域。在一些实施方案中，tcrβ胞内结构域包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性或同一的氨基酸序列：mamvkrkdsr(seq id no:35)。在一些实施方案中，tcrβ胞内结构域包含seq id no:35或基本上由其组成。在一些实施方案中，tcrβ胞内结构域由以下序列编码：
[0441]
atggccatggtcaagagaaaggattccaga(seq id no:36)。
[0442]
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含至少一个刺激性胞内结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域，诸如cd3δ、cd3γ和cd3ε胞内结构域、以及一个另外的刺激性胞内结构域(例如共刺激结构域)。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级胞内信号传导结构域，诸如cd3δ、cd3γ和cd3ε胞内结构域、以及两个另外的刺激性胞内结构域。
[0443]
示例性共刺激胞内信号传导结构域包括从负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的蛋白质衍生的那些。
[0444]
术语“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性地结合，从而介导t细胞的共刺激响应，诸如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体以外的细胞表面分子。共刺激分子及其配体是有效免疫响应所必需的。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla、toll配体受体、以及dap10、dap12、cd30、light、ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)4-1bb(cd137、tnf受体超家族成员9)和cd28分子(cd28)。
[0445]“共刺激结构域”(有时称为“共刺激胞内信号传导结构域”)可以是共刺激蛋白的胞内部分。共刺激结构域可以是共刺激蛋白的转导共刺激信号的结构域。共刺激蛋白可以代表以下蛋白质家族：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(slam蛋白)和激活nk细胞受体。此类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、gitr、cd30、cd40、icos、baffr、hvem、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3、特异性地结合cd83的配体、cd4等。共刺激结构域可以包含衍生其的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域、或其功能片段。
[0446]
在一些实施方案中，刺激结构域包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含cd28或4-1bb共刺激结构域。cd28和4-1bb是完全t细胞激活所必需的且已知增强t细胞效应子功能的充分表征的共刺激分子。例如，cd28和4-1bb已经在嵌合抗原受体(car)中用于促进细胞因子释放、细胞溶解功能和超过仅含有cd3ζ信号传导结构域的第一代car的持久性。同样地，在工程化tcr中包含共刺激结构域(例如cd28和4-1bb结构域)可以增加t细胞效应子功能，并且在不存在共刺激配体的情况下特异性地允许共刺激，所述共刺激配体通常在肿瘤细胞表面上被下调。
[0447]
在一些实施方案中，刺激结构域包含cd28胞内结构域。在一些实施方案中，cd28胞内结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少
96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:37)。在一些实施方案中，cd28胞内结构域包含rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:37)或基本上由其组成。在一些实施方案中，cd28胞内结构域由包含以下的核苷酸序列编码：
[0448]
aggagcaagcggagcagactgctgcacagcgactacatgaacatgaccccccggaggcctggccccacccggaagcactaccagccctacgcccctcccagggatttcgccgcctaccggagc(seq id no:38)。
[0449]
在一些实施方案中，刺激结构域包含4-1bb胞内结构域。在一些实施方案中，4-1bb胞内结构域包含与以下序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或同一的氨基酸序列：krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no:39)。在一些实施方案中，4-1bb胞内结构域包含krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no:39)或基本上由其组成。在一些实施方案中，4-1bb胞内结构域由包含以下的核苷酸序列编码：aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgaggccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg(seq id no:40)。
[0450]
抑制性结构域
[0451]
本发明提供了抑制性胞内结构域，其可以与任何tcr亚基的跨膜结构域或胞内结构域融合以产生抑制性tcr。
[0452]
在一些实施方案中，抑制性胞内结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。在一些实施方案中，包含itim的抑制性胞内结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，诸如ctla-4和pd-1。ctla-4和pd-1是在t细胞表面上表达的免疫抑制性受体，并且在减弱或终止t细胞响应中起关键作用。
[0453]
抑制性结构域可以分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)受体和cd200受体1。
[0454]
在一些实施方案中，抑制性结构域包含胞内结构域、跨膜结构域或它们的组合。在一些实施方案中，抑制结构域包含胞内结构域、跨膜结构域、铰链区或它们的组合。在一些实施方案中，抑制性结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。在一些实施方案中，包含itim的抑制性结构域可以分离自或衍生自免疫检查点抑制剂，诸如ctla-4和pd-1。
[0455]
抑制性结构域可以分离自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)受体和cd200受体1。在一些实施方案中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白，例如人trail受体、ctla-4或pd-1蛋白。在一些实施方案中，trail受体包含tr10a、tr10b或tr10d。
[0456]
内源性trail表达为281个氨基酸的ii型跨膜蛋白，其锚定在质膜上并呈递在细胞表面上。trail由自然杀伤细胞表达，其在细胞-细胞接触建立后可以诱导靶细胞中的trail依赖性凋亡。在生理学上，显示trail信号传导系统对于免疫监视，对于通过调节t辅助细胞1与t辅助细胞2以及“无帮助”cd8 t细胞数量来塑造免疫系统以及对于抑制自发肿瘤形成是必需的。
[0457]
在一些实施方案中，抑制性结构域包含分离自或衍生自cd200受体的胞内结构域。细胞表面糖蛋白cd200受体1(uniprot参考：q8td46)代表本发明的抑制性胞内结构域的另一个实例。cd200/ox2细胞表面糖蛋白的这种抑制性受体通过抑制促炎症分子(包括tnf-α、干扰素和诱导型一氧化氮合酶(inos))响应于所选刺激的表达来限制炎症。
[0458]
在一些实施方案中，工程化受体包含一个从杀伤细胞免疫球蛋白样受体分离或衍生的抑制性结构域、三个ig结构域和长胞质尾2(kir3dl2)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、三个ig结构域和长胞质尾3(kir3dl3)、白细胞免疫球蛋白样受体b1(lir1)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、fcγ受体iib(fcgriib)、杀伤细胞凝集素样受体k1(nkg2d)、ctla-4、含有合成共有itim的结构域、zap70 sh2结构域(例如，n和c末端sh2结构域中的一个或两个)或zap70ki_k369a(激酶失活zap70)。
[0459]
在一些实施方案中，抑制性结构域分离自或衍生自人蛋白质。
[0460]
在一些实施方案中，第二抑制性受体包含从相同蛋白质(例如含itim的蛋白质)分离或衍生的胞质结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，第二抑制性受体包含分离自或衍生自分离自或衍生自相同蛋白质(例如含itim的蛋白质)的胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，第二抑制性受体包含从与胞内结构域和/或跨膜结构域相同的蛋白质(例如含itim的蛋白质)分离或衍生分离或衍生的铰链区。
[0461]
在一些实施方案中，第二工程化受体是包含抑制性结构域的tcr(抑制性tcr)。在一些实施方案中，抑制性tcr包含抑制性胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施方案中，抑制性胞内结构域与tcrα、tcrβ、cd3δ、cd3γ或cd3ε的胞内结构域或tcr它们的一部分融合。在一些实施方案中，抑制性胞内结构域与tcrα、tcrβ、cd3δ、cd3γ或cd3ε的跨膜结构域融合。
[0462]
在一些实施方案中，第二工程化受体是包含抑制性结构域的tcr(抑制性tcr)。在一些实施方案中，抑制性结构域分离自或衍生自lilrb1。
[0463]
lilrb1抑制性受体
[0464]
本公开提供了第二抑制性受体，所述第二抑制性受体包含lilrb1抑制结构域和任选地lilrb1跨膜和/或铰链结构域或其功能变体。与具有另一个跨膜结构域或另一个铰链结构域的参考抑制性受体相比，在抑制性受体中包含lilrb1跨膜结构域和/或lilrb1铰链结构域可以增加由抑制性受体产生的抑制信号。包含lilrb1抑制性结构域的第二抑制性受体可以是car或tcr，如本文所述。如本文所述，任何合适的配体结合结构域可以与基于lilrb1的第二抑制性受体融合。
[0465]
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员1(lilrb1)(也称为白细胞免疫球蛋白样受体b1)以及ilt2、lir1、mir7、pirb、cd85j、ilt-2 lir-1、mir-7和pir-b是白细胞免疫球蛋白样受体(lir)家族的成员。lilrb1蛋白属于lir受体的亚家族b类。这些受体含有两至四个胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和两至四个基于胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。lilrb1受体在免疫细胞上表达，其中其结合抗原呈递细胞上的mhc i类分子并转导抑制对免疫响应的刺激的负信号。lilrb1被认为调节炎症响应以及细胞毒性，并且在限制自身反应性中发挥作用。存在编码lilrb1的不同亚型的多种转录物变体，所有这些都被认为在本公开的范围内。
[0466]
在本文所述的抑制性受体的一些实施方案中，抑制性受体包含一个或多个分离自或衍生自lilrb1的结构域。在具有一个或多个分离自或衍生自lilrb1的结构域的受体的一些实施方案中，lilrb1的一个或多个结构域包含与seq id no:65的序列或子序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，lilrb1的一个或多个结构域包含与seq id no:65的序列或子序列同一
的氨基酸序列。在一些实施方案中，lilrb1的一个或多个结构域由与seq id no:65的序列或子序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或同一的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，lilrb1的一个或多个结构域由与seq id no:65的序列或子序列同一的氨基酸序列组成。
[0467]
在具有一个或多个分离自或衍生自lilrb1的结构域的受体的一些实施方案中，lilrb1的一个或多个结构域由与seq id no:66的序列或子序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或同一的多核苷酸序列编码。
[0468]
在具有lilrb1的一个或多个结构域的受体的一些实施方案中，lilrb1的一个或多个结构域由与seq id no:66的序列或子序列同一的多核苷酸序列编码。
[0469]
在各种实施方案中，提供了包含多肽的抑制性受体，其中所述多肽包含以下中的一种或多种：lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体；lilrb1跨膜结构域或其功能变体；和lilrb1胞内结构域或包含至少一个或至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的胞内结构域，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0470]
如本文所用的“基于免疫受体酪氨酸的抑制基序”或“itim”是指具有存在于免疫系统的许多抑制性受体的胞质尾中的共有序列s/i/v/lxyxxi/v/l(seq id no:274)等的氨基酸保守序列。在拥有itim的抑制性受体与其配体发生相互作用之后，itim基序被磷酸化，从而允许抑制性受体募集其他酶，诸如磷酸酪氨酸磷酸酶shp-1和shp-2或称为ship的肌醇磷酸酶。
[0471]
在一些实施方案中，所述多肽包含胞内结构域，所述胞内结构域包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)、至少两个itim、至少3个itim、至少4个itim、至少5个itim或至少6个itim。在一些实施方案中，所述胞内结构域具有1个、2个、3个、4个、5个或6个itim。
[0472]
在一些实施方案中，所述多肽包含含有至少一个itim的胞内结构域，所述至少一个itim选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0473]
在另外的特定实施方案中，所述多肽包含含有至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的胞内结构域，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0474]
在一些实施方案中，胞内结构域包含nlyaav(seq id no:67)和vtyaev(seq id no:68)两个itim。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:71至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:71同一的序列或基本上由其组成。
[0475]
在一些实施方案中，胞内结构域包含vtyaev(seq id no:68)和vtyaql(seq id no:69)两个itim。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:72至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:72同一的序列或基本上由其组成。
[0476]
在一些实施方案中，胞内结构域包含vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)两个itim。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:73至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:73同一的序列或基本上由其组成。
[0477]
在一些实施方案中，胞内结构域包含以下itim：nlyaav(seq id no:67)、vtyaev
(seq id no:68)和vtyaql(seq id no:69)。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:74至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:74同一的序列或基本上由其组成。
[0478]
在一些实施方案中，胞内结构域包含以下itim：vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:75至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:75同一的序列或基本上由其组成。
[0479]
在一些实施方案中，胞内结构域包含以下itim：nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。在实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:76至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与seq id no:76同一的序列或基本上由其组成。
[0480]
在一些实施方案中，胞内结构域包含与lilrb1胞内结构域(seq id no:81)至少95％同一的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含与lilrb1胞内结构域(seq id no:81)同一的序列或基本上由其组成。
[0481]
本公开的lilrb1胞内结构域或其功能变体可以具有至少1个、至少2个、至少4个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个itim。在一些实施方案中，lilrb1胞内结构域或其功能变体具有2个、3个、4个、5个或6个itim。
[0482]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含两个、三个、四个、五个或六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0483]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含至少三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的胞内结构域，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0484]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含三个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0485]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含四个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0486]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含五个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0487]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含六个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0488]
在特定的实施方案中，胞内结构域包含至少7个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，其中每个itim独立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0489]
lilrb1蛋白具有称为d1、d2、d3和d4的四个免疫球蛋白(ig)样结构域。在一些实施
方案中，lilrb1铰链结构域包含lilrb1d3d4结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1 d3d4结构域包含与seq id no:77至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或同一的序列。在一些实施方案中，lilrb1 d3d4结构域包含seq id no:77或基本上由其组成。
[0490]
在一些实施方案中，所述多肽包含lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体。在实施方案中，lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体包含与seq id no:84、seq id no:77或seq id no:78至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一或同一的序列。在实施方案中，lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体包含与seq id no:84、seq id no:77或seq id no:78至少95％同一的序列。
[0491]
在一些实施方案中，lilrb1铰链结构域包含与seq id no:84、seq id no:77或seq id no:78同一的序列。
[0492]
在一些实施方案中，lilrb1铰链结构域基本上由与seq id no:84、seq id no:77或seq id no:78同一的序列组成。
[0493]
在一些实施方案中，跨膜结构域是lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施方案中，lilrb1跨膜结构域或其功能变体包含与seq id no:85至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一或至少99％同一的序列。在一些实施方案中，lilrb1跨膜结构域或其功能变体包含与seq id no:85至少95％同一的序列。在一些实施方案中，lilrb1跨膜结构域包含与seq id no:85同一的序列。在实施方案中，lilrb1跨膜结构域基本上由与seq id no:85同一的序列组成。
[0494]
在一些实施方案中，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白的铰链)附接到第二抑制性受体的胞外区，例如抗原结合结构域或配体结合结构域。例如，在一些实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(ig)铰链，例如igg4铰链、cd8a铰链或lilrb1铰链。
[0495]
在一些实施方案中，第二抑制性受体包含抑制性结构域。在一些实施方案中，第二抑制性受体包含抑制性胞内结构域和/或抑制性跨膜结构域。在一些实施方案中，抑制性结构域分离自或衍生自lilr1b。
[0496]
包含lilrb1结构域的组合的抑制性受体
[0497]
在一些实施方案中，本公开的基于lilrb1的抑制性受体包含多于一个lilrb1结构域或其功能等效物。例如，在一些实施方案中，抑制性受体包含lilrb1跨膜结构域和胞内结构域，或者lilrb1铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
[0498]
在特定的实施方案中，抑制性受体包含lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体和lilrb1跨膜结构域或其功能变体。在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:79至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或同一的序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:79至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:79同一的序列。
[0499]
在另外的实施方案中，抑制性受体包含：lilrb1跨膜结构域或其功能变体，以及lilrb1胞内结构域和/或包含至少一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的胞内结构域，其中所述itim选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。在一些实施方案中，所述多肽包含lilrb1跨膜结构域或其功能变体和lilrb1胞内结构域和/或包含至少两个itim的胞内结构域，其中每个itim独
立地选自nlyaav(seq id no:67)、vtyaev(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:70)。
[0500]
在一些实施方案中，抑制性受体包含lilrb1跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:80至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或同一的序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:80至少95％同一的序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:80同一的序列。在一些实施方案中，抑制性受体包含lilrb1跨膜结构域和与胞外配体结合结构域融合的seq id no:80的胞内结构域。在一些实施方案中，抑制性受体包含与tcrα可变结构域融合的含有seq id no:80的第一多肽和与tcrβ可变结构域融合的含有seq id no:80的第二多肽。
[0501]
在优选的实施方案中，抑制性受体包含：lilrb1铰链结构域或其功能片段或变体；lilrb1跨膜结构域或其功能变体；和lilrb1胞内结构域和/或包含至少两个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的胞内结构域，其中每个itim独立地选自lyaav(seq id no:67)、vtyae(seq id no:68)、vtyaql(seq id no:69)和siyatl(seq id no:11)。
[0502]
在一些实施方案中，抑制性受体包含与seq id no:82或seq id no:83至少95％同一、或与seq id no:82或seq id no:83至少99％同一、或与seq id no:82或seq id no:83同一的序列。
[0503]
在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:79至少99％同一、或与seq id no:79至少99％同一、或与seq id no:79同一的序列。
[0504]
在一些实施方案中，所述多肽包含与seq id no:80至少99％同一、或与seq id no:80至少99％同一、或与seq id no:80同一的序列。
[0505]
表13.基于lilrb1的说明性抑制性受体的多肽序列
[0506]
[0507][0508]
接头
[0509]
在一些实施方案中，工程化受体包含连接工程化受体的两个结构域的接头。本文提供了在一些实施方案中可以用于连接本文所述的工程化受体的结构域的接头。
[0510]
如在连接蛋白质结构域(例如胞内结构域或scfv内的结构域)的语境中使用的术语“接头”和“柔性多肽接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基)组成的将两个结构域连接在一起的肽接头。
[0511]
可以使用任何接头，并且许多融合蛋白接头形式是已知的。例如，接头可以是柔性的或刚性的。chen等人(adv drug deliv rev.2013；65(10):1357-1369)提供了刚性和柔性接头的非限制性实例。
[0512]
本文所述的抗原结合结构域可以按随机或特定的顺序彼此连接。
[0513]
本文所述的抗原结合结构域可以按n至c末端的任何取向彼此连接。
[0514]
任选地，长度为例如在2个与40个氨基酸之间(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短的寡肽或多肽接头可在结构域之间形成连接。
[0515]
在一些实施方案中，接头是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或多于30个氨基酸残基的肽。接头中存在的氨基酸的非限制性实例包括gly、ser、glu、gin、ala、leu、iso、lys、arg、pro等。在一些实施方案中，接头是[(gly)n1ser]n2，其中n1和n2可以是任何数字(例如n1和n2可以独立地是1、2、4、5、6、7、8、9、l0或大于10)。在一些实施方案中，n1是4。
[0516]
在一些实施方案中，柔性多肽接头是gly/ser接头并且包含可以被重复n次的氨基酸序列(gly-gly-ser)、(gly-gly-gly-ser,seq id no:231)或(gly-gly-gly-gly-ser,seq id no:226)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一些实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于ggs、ggggs(seq id no:226)、ggggs ggggs(seq id no:227)、ggggs ggggs ggggs(seq id no:228)、ggggs ggggs ggggs gg(seq id no:229)或ggggs ggggs ggggs ggggs(seq id no:230)。
[0517]
在一些实施方案中，接头包括(gly gly ser)、(gly ser)或(gly gly gly ser(seq id no:231))的多个重复。在wo2012/138475(以引用的方式并入本文)中描述的接头也包括在本发明的范围内。
[0518]
在一些实施方案中，接头序列包含长接头(ll)序列。在一些实施方案中，长接头序列包含重复四次的ggggs(seq id no:226)。在一些实施方案中，ggggs ggggs ggggs ggggs(seq id no:230)用于连接本公开的tcrα融合蛋白中的胞内结构域。
[0519]
在一些实施方案中，长接头序列包含重复三次的ggggs(seq id no:226)。在一些实施方案中，ggggs ggggs ggggs(seq id no:228)用于连接本公开的tcrβ融合蛋白中的胞内结构域。
[0520]
在一些实施方案中，接头序列包含短接头(sl)序列。在一些实施方案中，短接头序列包含ggggs(seq id no:226)。
[0521]
在一些实施方案中，可以将甘氨酸-丝氨酸双联体用作合适的接头。
[0522]
在一些实施方案中，结构域通过肽键彼此直接融合而不使用接头。
[0523]
测定
[0524]
本文提供了可以用于测量本公开的工程化受体的活性的测定。
[0525]
可以使用经工程化以表达受体活性报告子(诸如萤光素酶报告子)的细胞系来测定工程化受体的活性。示例性细胞系包括jurkat t细胞，但是可以使用本领域已知的任何合适的细胞系。例如，表达在nfat启动子控制下的萤光素酶报告子的jurkat细胞可以用作效应细胞。该细胞系对萤光素酶的表达反映了tcr介导的信号传导。
[0526]
可以用本文所述的各种融合蛋白构建体、融合蛋白构建体的组合或对照中的每一
者转染报告细胞。
[0527]
通过使用荧光标记的mhc四聚体(例如alexa fluor 647标记的ny-eso-1-mhc四聚体)来检测融合蛋白的表达，可以证实融合蛋白在报告细胞中的表达。
[0528]
为了测定工程化受体的活性，靶细胞在暴露于包含报告子和工程化受体的效应细胞之前负载抗原。例如，靶细胞可以在暴露于效应细胞前至少12、14、16、18、20、22或24小时负载抗原。示例性靶细胞包括a375细胞，但是可以使用本领域已知的任何合适的细胞。在一些情况下，靶细胞可以负载连续稀释浓度的抗原，诸如ny-eso-1肽。然后可以将效应细胞与靶细胞一起共培养合适的时间段，例如6小时。然后通过共培养后的发光读数测量萤光素酶。可以将萤光素酶发光归一化为最大和最小强度，以允许比较每种工程化受体构建体的激活肽浓度。
[0529]
本文提供了确定本公开的工程化受体的相对ec50的方法。如本文所用，“ec50”是指其中响应(或结合)减少一半的抑制剂或药剂的浓度。本公开的工程化受体的ec50是指其中工程化受体与抗原的结合减少一半的抗原浓度。可以通过用标记的肽或标记的肽-mhc复合物(例如与荧光团缀合的mhc:ny-eso-1pmhc复合物)染色来测量抗原或探针与工程化受体的结合。可以通过报告子信号与肽滴定的非线性回归曲线拟合获得ec50。可以将探针结合和ec50归一化为不含融合蛋白的基准tcr(例如ny-eso-1(克隆1g4))的水平。
[0530]
多核苷酸
[0531]
本公开提供了编码本文所述的工程化受体的序列的多核苷酸。
[0532]
在一些实施方案中，第一融合蛋白和/或第二融合蛋白的序列与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白的序列与第一启动子可操作地连接，并且编码第二融合蛋白的序列与第二启动子可操作地连接。
[0533]
本公开提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。
[0534]
本公开提供了编码本文所述的任何工程化受体的一个或多个编码序列的载体。在一些实施方案中，第一融合蛋白和/或第二融合蛋白的序列与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码第一融合蛋白的序列与第一启动子可操作地连接，并且编码第二融合蛋白的序列与第二启动子可操作地连接。
[0535]
在一些实施方案中，第一工程化受体由第一载体编码，并且第二工程化受体由第二载体编码。在一些实施方案中，两种工程化受体均由单一载体编码。
[0536]
在一些实施方案中，第一受体和第二受体由单一载体编码。使用单一载体编码多种多肽的方法将是本领域普通技术人员已知的，并且尤其包括编码在不同启动子的控制下的多种多肽，或者如果使用单一启动子控制多种多肽的转录，使用编码内部核糖体进入位点(ires)和/或自切割肽的序列。示例性自切割肽包括t2a、p2a、e2a和f2a自切割肽。在一些实施方案中，t2a自切割肽包含egrgslltcgdveenpgp(seq id no:271)的序列。在一些实施方案中，p2a自切割肽包含atnfsllkqagdveenpgp(seq id no:192)的序列。在一些实施方案中，e2a自切割肽包含qctnyallklagdvesnpgp(seq id no:272)的序列。在一些实施方案中，f2a自切割肽包含vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seq id no:273)的序列。
[0537]
在一些实施方案中，载体是表达载体，即用于在合适的细胞中表达融合蛋白。
[0538]
源自逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定的整合和其在子细胞中的传递。慢病毒载体具有优于源自肿瘤逆转
录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体的附加优势，因为它们可以转导非增殖细胞(诸如肝细胞)。它们还具有低免疫原性的附加优势。
[0539]
编码融合蛋白的天然或合成核酸的表达通常通过将编码融合蛋白或其部分的核酸可操作地连接到启动子上并且将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适合于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有可用于调节所期望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
[0540]
可以将编码融合蛋白的多核苷酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将多核苷酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
[0541]
此外，可以将表达载体以病毒载体的形式提供给细胞(诸如免疫细胞)。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如sambrook等人(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)中和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来讲，合适的载体含有至少一种生物体内的复制功能起点、启动子序列、便利的限制性内切核酸酶位点、以及一个或多个可选择标记(例如，wo 01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0542]
已经开发出多个基于病毒的系统以将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
[0543]
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始频率。通常，这些位于起始位点上游30-110碱基对(bp)的区域中，但是最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。在启动子元件之间的间隔经常是柔性的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp后活性才开始下降。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
[0544]
合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子1α(ef-1α)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、rous肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被设想为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够在期望这种表达时开启其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的分子开关，或者当不期望表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0545]
为了评估融合蛋白的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有可选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细
胞。在其它方面，可选择标记可以携带在单独的dna片段上并在共转染程序中使用。可选择标记和报告基因两者均可以侧接适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。
[0546]
报告基因用于鉴定潜在转染或转导的细胞并且用于评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受者生物体或组织中或不由接受者生物体或组织表达并且编码其表达由一些易于检测的特性(例如，酶促活性)表现的多肽的基因。在将dna引入接受者细胞中之后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因、或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tei等人,2000 febs letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术来制备或可商业获得。通常，构建体中显示出最高的报告基因表达水平的最小5
′
侧接区被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接并且用于评价药剂的调节启动子驱动的转录的能力。
[0547]
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的语境中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
[0548]
将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，sambrook等人(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞中的一种方法是磷酸钙转染。
[0549]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体以及尤其是逆转录病毒载体已经成为将基因插入哺乳动物(例如人)细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0550]
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
[0551]
不管用于将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了证实重组dna序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(elisa和western印迹)或通过本文所述的鉴定落入本发明范围内的药剂的测定。
[0552]
免疫细胞
[0553]
本文提供了包含本文所述的多核苷酸、载体、融合蛋白和工程化受体的免疫细胞。
[0554]
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与先天或适应性(获得性)免疫系统的细胞。示例性的先天性免疫细胞包括吞噬细胞诸如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞、天然杀伤(nk)细胞、多形核白细胞(诸如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)以及单核细胞(诸如单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。在获得性免疫中起作用的免疫细胞包括淋巴细胞诸如t细胞和b细胞。
[0555]
如本文所用，“t细胞”是指源自在胸腺中发育的骨髓前体的淋巴细胞类型。有几种
不同类型的t细胞在迁移到胸腺后发育，包括辅助cd4 t细胞、细胞毒性cd8 t细胞、记忆t细胞、调节性cd4 t细胞和干记忆t细胞。不同类型的t细胞可以由普通技术人员基于其标记的表达来区分。在t细胞类型之间作出区分的方法对于普通技术人员而言将是显而易见的。
[0556]
在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约100:1至1:100的第一受体与第二受体比率表达第一受体和第二受体。在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约50:1至1:50的第一受体与第二受体比率表达第一受体和第二受体。在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约10:1至1:10的第一受体与第二受体比率表达第一受体和第二受体。在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约5:1至1:5的第一受体与第二受体比率表达第一受体和第二受体。在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约3:1至1:3的第一受体与第二受体比率表达第一受体和第二受体。在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约2:1至1:2的第一受体与第二受体比率表达第一受体和第二受体。在一些实施方案中，工程化免疫细胞以约1:1的比率表达第一受体和第二受体。
[0557]
在一些实施方案中，包含本公开的工程化受体的工程化免疫细胞是t细胞。在一些实施方案中，t细胞是效应t细胞或调节性t细胞。
[0558]
用本公开的载体转化免疫细胞(诸如t细胞)群的方法对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。例如，cd3 t细胞可以使用cd3 t细胞阴性分离试剂盒(miltenyi)根据制造商的说明书从pbmc中分离。在cd3/28dynabeads(1:1细胞与珠粒比率)和300单位/ml的il-2(miltenyi)的存在下在补充有5％人a/b血清和1％pen/strep的x-vivo15培养基中以1x 10^6个细胞/ml的密度培养t细胞。在2天后，可以使用本领域已知的方法用病毒载体诸如慢病毒载体转导t细胞。在一些实施方案中，病毒载体以5的感染复数(moi)转导。然后在富集前在il-2或其他细胞因子诸如il-7/15/21的组合中将细胞再培养5天。分离和培养其他免疫细胞(诸如b细胞)群或其他t细胞群的方法对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。尽管此方法概述了潜在的方法，但是应当注意，这些方法正快速发展。例如，在生长5天后可实现对外周血单核细胞的优异病毒转导，以产生》99％的cd3 高转导细胞群。
[0559]
激活和培养包含本公开的工程化tcr、car、融合蛋白或编码融合蛋白的载体的t细胞群的方法对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
[0560]
无论是在对t细胞进行遗传修饰以表达工程化tcr之前还是之后，通常都可以使用例如在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041，10040846；和美国专利申请公开号2006/0121005中所描述的方法来激活和扩增t细胞。
[0561]
在一些实施方案中，在体外扩增和激活本公开的t细胞。通常，本公开的t细胞在体外通过跟与其附接了刺激cd3/tcr复合相关信号的药剂和刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增。特别地，可以如本文所述刺激t细胞群，诸如通过与抗cd3抗体接触。为了在t细胞表面上共刺激辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激t细胞增殖的条件下使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。为了刺激cd4 t细胞或cd8 t细胞的增殖，可以使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括可以用于本领域通常已知的其他方法中的9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone,france)(berg等
人,transplant proc.30(8):3975-3977,1998；haanen等人,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等人,j.immunol meth.227(1-2):53-63,1999)。
[0562]
在一些实施方案中，可以通过不同的方案提供t细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的药剂可以是在溶液中或与表面偶联。当与表面偶联时，药剂可以与同一表面偶联(即，以“顺式”形式)或与分开的表面偶联(即，以“反式”形式)。可替代地，一种药剂可以在溶液中与表面和另一种药剂偶联。在一些实施方案中，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的药剂是在溶液中或与表面偶联。在某些实施方案中，两种药剂都可以是在溶液中。在另一个实施方案中，药剂可以是可溶形式，并且然后交联到表面，诸如表达fc受体的细胞或抗体或将结合药剂的其他结合剂。关于这一点，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的预期用于激活和扩增本发明t细胞的人工抗原呈递细胞(aapc)。
[0563]
在一些实施方案中，将两种药剂固定在珠粒上，固定在同一珠粒上(即“顺式”)或者固定在分开的珠粒上(即“反式”)。举例来说，提供初级激活信号的药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以相等的分子量共同固定到相同的珠粒上。在一个实施方案中，对于cd4 t细胞扩增和t细胞生长使用1:1比率的与珠粒结合的每种抗体。在一些实施方案中，与珠粒结合的cd3:cd28抗体的比率在100:1至1:100以及其间的所有整数值的范围内。在本发明的一个方面，与颗粒结合的抗cd28抗体比抗cd3抗体多，即cd3:cd28的比率为小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠粒结合的抗cd28抗体与抗cd3抗体的比率为大于2:1。
[0564]
在1:500至500:1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比率可以用于刺激t细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比率可能取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小尺寸的珠粒只能结合少数细胞，而较大的珠粒可以结合许多细胞。在某些实施方案中，范围为1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率以及在另外的实施方案中包括1:9至9:1以及其间的任何整数值的比率也可以用于刺激t细胞。在一些实施方案中，使用1:1的细胞与珠粒的比率。本领域技术人员将理解，多种其他比率可能适合用于本发明。特别地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。
[0565]
在本发明的另外实施方案中，将细胞(诸如t细胞)与药剂包被的珠粒组合，随后分离珠粒和细胞，然后培养细胞。在替代性的实施方案中，在培养之前，不分离药剂包被的珠粒和细胞，而是一起培养。在另外的实施方案中，首先通过施加力(诸如磁力)浓缩珠粒和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
[0566]
举例来说，可以通过允许附接有抗cd3和抗cd28的顺磁珠粒与t细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，细胞(例如cd4 t细胞)和珠粒(例如比例为1:1的dynabeads cd3/cd28 t顺磁珠粒)在缓冲液中组合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。在某些实施方案中，可能期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另外的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml
的浓度。在一些实施方案中，使用以1x106个细胞/ml的密度培养的细胞。
[0567]
在一些实施方案中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，将珠粒和t细胞一起培养2-3天。适合于t细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基(minimal essential media)或rpmi培养基1640或x-vivo 15(lonza))，其可以含有增殖和存活力(viability)所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi 1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo 15和x-vivo 20、optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，是无血清的或补充有适当量的血清(或血浆)或限定的一组激素和/或一定量的足以使t细胞生长和扩增的细胞因子。在一些实施方案中，培养基包括补充有5％人a/b血清、1％青霉素/链霉素(pen/strep)和300单位/ml il-2(miltenyi)的x-vivo-15培养基。
[0568]
将t细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％co2)下。
[0569]
在一些实施方案中，包含本公开的工程化tcr的t细胞是自体的。在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得t细胞来源。免疫细胞诸如t细胞可以从许多来源获得，所述来源包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域中可用的任何数量的t细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用对本领域技术人员而言已知的任何数量的技术(诸如ficoll
tm
分离)从受试者收集的血液单位获得t细胞。
[0570]
在一些实施方案中，通过单采术获得来自个体循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过采集术收集的细胞以去除血浆级分，并且将细胞置于适当的缓冲液或介质中用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞。在替代性的实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是所有)二价阳离子。如本领域普通技术人员将容易了解的，可以通过本领域技术人员已知的方法(诸如通过使用半自动“流过”离心机(例如，cobe 2991细胞处理器、baxter cytomate或haemonetics cell saver 5)根据制造商的说明书)来实现洗涤步骤。在洗涤之后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如，无ca2 、无mg2 的pbs、plasmalyte a或其他具有或不具有缓冲液的盐水溶液)中。可替代地，可以去除单采术样品的不期望组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
[0571]
在一些实施方案中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞，例如通过经由percoll
tm
梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离免疫细胞诸如t细胞。免疫细胞的特定亚群(诸如t细胞、b细胞或cd4 t细胞)可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施方案中，通过与抗cd4缀合的珠粒一起孵育持续足以阳性选择期望的t细胞的时间段来分离t细胞。
[0572]
通过阴性选择富集免疫细胞群(诸如t细胞群)可以用针对阴性选择的细胞所独特的表面标记的抗体的组合来实现。一种方法是经由使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞
表面标记的单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过阴性选择富集cd4 细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd 14、cd20、cd 11b、cd 16、hla-dr和cd8的抗体。
[0573]
为了通过阳性或阴性选择分离期望的免疫细胞群，细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的浓度可以变化。在某些实施方案中，可能期望显著降低其中珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。
[0574]
在一些实施方案中，细胞可以在旋转器上以不同的速度在2-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
[0575]
也可以在洗涤步骤后将用于刺激的t细胞或从其分离出免疫细胞(诸如t细胞)的pbmc冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和在一定程度上除去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且可用于此语境中，但是一种方法涉及使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso、或者31.25％plasmalyte-a、31.25％葡萄糖5％、0.45％nacl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso的培养基或含有例如羟乙基淀粉(hespan)和plasmalyte a的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1
°
/分钟的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的蒸气相中。可以使用其他受控冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控冷冻。
[0576]
药物组合物
[0577]
本公开提供了药物组合物，其包含含有本公开的工程化受体的免疫细胞和药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。
[0578]
此类组合物可以包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；和防腐剂。
[0579]
治疗疾病的方法
[0580]
本文提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含含有本公开的工程化受体的免疫细胞的组合物。免疫细胞在同一细胞中表达两种工程化受体。
[0581]
在一些实施方案中，所述有需要的受试者患有癌症。癌症是异常细胞不受控制地分裂并扩散到附近组织的疾病。在一些实施方案中，癌症包括液体肿瘤或实体瘤。示例性液体肿瘤包括白血病和淋巴瘤。作为液体肿瘤的另外的癌症可以是发生在例如血液、骨髓和淋巴结中的那些，并且可以包括例如白血病、髓性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、黑素瘤和多发性骨髓瘤。白血病包括例如急性成淋巴细胞性白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性髓细胞性白血病(cml)和毛细胞白血病。示例性实体瘤包括肉瘤和癌。癌症实际上可以发生在身体的器官中，包括血液、骨髓、肺、乳腺、结肠、骨骼、中枢神经系统、胰腺、前列腺和卵巢中。作为实体瘤的另外的癌症包括例如前列腺癌；睾丸癌；乳腺癌；脑癌；胰腺癌；结肠癌；甲状腺癌；胃癌；肺癌；卵巢癌；卡波西肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞皮肤癌；肾癌；头颈癌；喉癌；在鼻、口、喉的湿润粘膜内衬上形成的鳞状癌；膀胱癌；骨肉瘤；宫颈癌；子宫内膜癌；食管癌；肝癌和肾癌。在一些实施方案中，
通过本文所述的方法治疗的病状是黑素瘤细胞、前列腺癌细胞、睾丸癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、甲状腺癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、卡波西肉瘤细胞、皮肤癌细胞、肾癌细胞、头颈癌细胞、喉癌细胞、鳞状癌细胞、膀胱癌细胞、骨肉瘤细胞、子宫颈癌细胞、子宫内膜癌细胞、食管癌细胞、肝癌细胞或肾癌细胞的转移。
[0582]
其中多个癌细胞表达第一激活剂配体而不表达第二抑制剂配体的任何癌症被设想为在本公开的范围内。例如，可以使用本文所述的方法治疗的cea阳性癌症包括结直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、肺腺癌、头颈癌、弥漫性大b细胞癌或急性髓性白血病癌症。
[0583]
治疗癌症可以导致肿瘤尺寸减小。肿瘤尺寸的减小也可以被称为“肿瘤消退”。优选地，在治疗后肿瘤尺寸相对于其在治疗前的尺寸减小了5％或更多；更优选地，肿瘤尺寸减小了10％或更多；更优选地，减小了20％或更多；更优选地，减小了30％或更多；更优选地，减小了40％或更多；甚至更优选地，减小了50％或更多；并且最优选地，减小了大于75％或更多。肿瘤的尺寸可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤的尺寸可以测量为肿瘤的直径。
[0584]
治疗癌症可以导致肿瘤体积减小。优选地，在治疗后，肿瘤体积相对于其在治疗前的尺寸减小了5％或更多；更优选地，肿瘤体积减小了10％或更多；更优选地，减小了20％或更多；更优选地，减小了30％或更多；更优选地，减小了40％或更多；甚至更优选地，减小了50％或更多；并且最优选地，减小了大于75％或更多。肿瘤体积可以通过任何可再现的测量手段来测量。
[0585]
治疗癌症导致肿瘤数量减少。优选地，在治疗后，肿瘤数量相对于治疗前的数量减少了5％或更多；更优选地，肿瘤数量减少了10％或更多；更优选地，减少了20％或更多；更优选地，减少了30％或更多；更优选地，减少了40％或更多；甚至更优选地，减少了50％或更多；并且最优选地，减少了大于75％。肿瘤的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。肿瘤的数量可以通过计数肉眼可见的肿瘤或在指定的放大倍数下计数肿瘤来测量。优选地，指定的放大倍数是2x、3x、4x、5x、10x或50x。
[0586]
治疗癌症可以导致远离原发性肿瘤部位的其他组织或器官中转移病灶的数量减少。优选地，在治疗后，转移病灶的数量相对于治疗前的数量减少了5％或更多；更优选地，转移病灶的数量减少了10％或更多；更优选地，减少了20％或更多；更优选地，减少了30％或更多；更优选地，减少了40％或更多；甚至更优选地，减少了50％或更多；并且最优选地，减少了大于75％。转移病灶的数量可以通过任何可再现的测量手段来测量。转移病灶的数量可以通过计数肉眼可见的转移病灶或在指定放大倍数下计数转移病灶来测量。优选地，指定的放大倍数是2x、3x、4x、5x、10x或50x。
[0587]
与接受单独的载剂的群体相比，治疗癌症可以导致受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；并且最优选地增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加还可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
[0588]
与未治疗的受试者群体相比，治疗癌症可以导致受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，
增加了超过90天；并且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加还可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
[0589]
与接受使用不是本发明的化合物的药物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可以导致受治疗的受试者群体的平均存活时间增加。优选地，平均存活时间增加了超过30天；更优选地，增加了超过60天；更优选地，增加了超过90天；并且最优选地，增加了超过120天。群体的平均存活时间的增加可以通过任何可再现的手段来测量。群体的平均存活时间的增加可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后的平均存活长度来测量。群体的平均存活时间的增加还可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后的平均存活长度来测量。
[0590]
与接受单独的载剂的群体相比，治疗癌症可以导致受治疗的受试者群体的死亡率降低。与未治疗的群体相比，治疗癌症可以导致受治疗的受试者群体的死亡率降低。与接受使用不是本发明的化合物的药物或其药学上可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的单一疗法的群体相比，治疗癌症可以导致受治疗的受试者群体的死亡率降低。优选地，死亡率降低了超过2％；更优选地，降低了超过5％；更优选地，降低了超过10％；并且最优选地，降低了超过25％。受治疗的受试者群体的死亡率降低可以通过任何可再现的手段来测量。群体死亡率的降低可以例如通过计算群体在开始用活性化合物治疗后每单位时间的平均疾病相关死亡数量来测量。群体死亡率的降低还可以例如通过计算群体在用活性化合物完成第一轮治疗后每单位时间的平均疾病相关死亡数量来测量。
[0591]
治疗癌症可以导致肿瘤生长速率降低。优选地，在治疗后，肿瘤生长速率相对于治疗前的数值降低了至少5％；更优选地，肿瘤生长速率降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少50％；并且最优选地，降低了至少75％。肿瘤生长速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。可以根据每单位时间的肿瘤直径变化来测量肿瘤生长速率。
[0592]
治疗癌症可以导致肿瘤再生长的减少。优选地，在治疗后，肿瘤再生长小于5％；更优选地，肿瘤再生长小于10％；更优选地，小于20％；更优选地，小于30％；更优选地，小于40％；更优选地，小于50％；甚至更优选地，小于50％；以及最优选地，小于75％。肿瘤再生长可以通过任何可再现的测量手段来测量。例如，通过测量在治疗后的先前肿瘤缩小后肿瘤直径的增加来测量肿瘤再生长。在治疗停止后肿瘤复发失败表明肿瘤再生长减少。
[0593]
治疗或预防细胞增殖性病症可以导致细胞增殖速率降低。优选地，在治疗后，细胞增殖速率降低了至少5％；更优选地，降低了至少10％；更优选地，降低了至少20％；更优选地，降低了至少30％；更优选地，降低了至少40％；更优选地，降低了至少50％；甚至更优选地，降低了至少50％；并且最优选地，降低了至少75％。细胞增殖速率可以通过任何可再现的测量手段来测量。例如，通过测量每单位时间在组织样品中分裂细胞的数量来测量细胞增殖速率。
[0594]
治疗或预防细胞增殖性病症可以导致增殖细胞的比例减少。优选地，在治疗后，增殖细胞的比例减少了至少5％；更优选地，减少了至少10％；更优选地，减少了至少20％；更
优选地，减少了至少30％；更优选地，减少了至少40％；更优选地，减少了至少50％；甚至更优选地，减少了至少50％；并且最优选地，减少了至少75％。增殖细胞的比例可以通过任何可再现的测量手段来测量。优选地，例如通过定量组织样品中相对于未分裂细胞数量的分裂细胞数量来测量增殖细胞的比例。增殖细胞的比例可以等于有丝分裂指数。
[0595]
治疗或预防细胞增殖性病症可以导致细胞增殖区域或增殖区的尺寸减小。优选地，在治疗后，细胞增殖区域或增殖区的尺寸相对于其在治疗前的尺寸减小了至少5％；更优选地，减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；并且最优选地，减小了至少75％。细胞增殖区域或增殖区的尺寸可以通过任何可再现的测量手段来测量。细胞增殖区域或增殖区的尺寸可以测量为细胞增殖区域或增殖区的直径或宽度。
[0596]
治疗或预防细胞增殖性病症可以导致具有异常外观或形态的细胞的数量或比例减少。优选地，在治疗后，具有异常形态的细胞数量相对于其在治疗前的数量减少了至少5％；更优选地，减小了至少10％；更优选地，减小了至少20％；更优选地，减小了至少30％；更优选地，减小了至少40％；更优选地，减小了至少50％；甚至更优选地，减小了至少50％；并且最优选地，减小了至少75％。异常细胞外观或形态可以通过任何可再现的测量手段来测量。异常细胞形态可以通过显微镜检查，例如使用倒置组织培养显微镜来测量。异常的细胞形态可以采取核多态性的形式。
[0597]
试剂盒和制品
[0598]
本公开提供了包含编码本文所述的工程化受体的多核苷酸和载体的试剂盒和制品，以及包含本文所述的工程化受体的免疫细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含物品，诸如小瓶、注射器和使用说明书。
[0599]
在一些实施方案中，试剂盒包含多核苷酸或载体，所述多核苷酸或载体包含编码本公开的一种或多种工程化受体的序列。
[0600]
在一些实施方案中，试剂盒包含多个包含如本文所述的工程化受体的免疫细胞。在一些实施方案中，所述多个免疫细胞包含多个t细胞。
[0601]
实施例
[0602]
实施例1：激活剂靶配体的选择
[0603]
本发明人调查了针对激活剂配体的gtex基因表达数据库(gtexportal.org/home/)。激活剂配体应具有以下特性：首先，一种类型的激活剂配体应具有高表面表达，其赋予递送大的激活信号的潜力。可替代地，激活剂诸如miha可以在细胞表面上具有低密度。其次，激活剂配体可以具有必要的细胞功能，这防止激活剂配体的等位基因由于肿瘤细胞中的非整倍性而丢失，并使它们在肿瘤演化期间不太可能经历诱变。最后，激活剂配体应存在于所有肿瘤细胞上。如果抑制剂配体也在除靶细胞之外的所有细胞上表达，则激活剂配体可能在所有细胞上表达。激活剂也应在癌细胞上表达。当与抑制剂组合使用时，激活剂可以例如在所有细胞上广泛表达。
[0604]
图4a显示了示例性激活剂配体，即转铁蛋白受体(tfrc)的rna表达谱。从图4a中看出，tfrc在rna水平上的表达是普遍存在的并且相对均匀。此外，tfrc是必需的基因：功能丧失纯合tfrc突变在小鼠中是胚胎致死的。
[0605]
图4b显示了候选阻断剂hla-a和候选激活剂hla-b的表达谱。从图4b中可以看出，
候选激活剂和阻断剂hla i类表达一起追踪，从而减轻优化激活剂和阻断剂对的挑战。
[0606]
实施例2：癌细胞中丢失的抑制剂靶配体的选择
[0607]
杂合性丧失
[0608]
抑制剂配体的一个潜在集合是由于杂合性丧失而在肿瘤细胞中丢失的配体。在对26种组织学类型中的3131个肿瘤样品的分析中，beroukhim等人发现在典型的肿瘤中，25％的基因组受到臂数单拷贝数改变(复制和缺失)的影响，并且10％的基因组受到局灶性单拷贝数改变的影响，具有2％的重叠。(beroukhim等人,nature 463:899-905(2010))。此外，许多loh区域在肿瘤类型之间重叠，并且仅22％的区域对于一种肿瘤类型是独特的。例如，beroukhim等人发现80％的扩增峰和78％的缺失峰是17种最具代表性肿瘤类型共有的。因此，可以被抑制剂lbd选择性地结合的loh丧失的等位基因是靶细胞不表达的潜在抑制剂靶标。
[0609]
对于通过杂合性丧失而在癌症中丢失的潜在抑制剂配体，本发明人调查了癌症基因组图谱程序(cancer genome atlas program)(http://portals.broadinstitute.org/tcga/home)。数据集所有癌症数据集(all_cancers)由来自33种癌症类型的10,844个癌症样品组成。一种类型的抑制剂配体应具有以下特性：首先，抑制剂配体应该在组织中具有高的均一的表面表达。这赋予了递送大的不偏不倚的抑制信号的能力。抑制剂配体在许多肿瘤中应该是不存在的或多态的。此外，通过常规方法诸如抗体染色或遗传分析，应当易于区分肿瘤细胞中抑制剂配体的丢失。其他类型的抑制剂配体(诸如miha)可以具有低表面表达。
[0610]
抑制剂配体的一个集合是通过loh在癌细胞中丢失的主要组织相容性复合物(mhc)等位基因。使用这些等位基因作为抑制剂配体不需要肽mhc靶标(pmhc)，例如，可以使用泛hla-a*02等位基因。
[0611]
y染色体丢失
[0612]
成年雄性表达的y染色体基因是通过y染色体丢失的潜在抑制剂配体。y染色体上存在至少60个蛋白质编码基因。几个y染色体基因在成年雄性中广泛表达，并且可能通过y染色体丢失而在癌症中丢失。几种其他广泛表达的胞质蛋白质是pmhc抑制剂候选物(例如tmsb4y、eif1ay)。nlgn4y是在雄性中广泛表达的i型整合膜蛋白，并且也是候选物。
[0613]
实施例3：用配对的a和b受体靶向缺乏表面抗原的细胞
[0614]
我们显示杂合性丧失的靶向系统在体外和在小鼠癌症模型中起作用。
[0615]
在正常细胞与肿瘤细胞之间的区别取决于两种功能：(i)识别在正常细胞表面上的也保留在肿瘤上的表位的激活剂(“a”)受体；和(ii)识别从肿瘤细胞丢失的等位基因产物上的第二表面表位的阻断剂(“b”)受体。在本实施例中，我们对a和b两者都使用了肽-mhc(pmhc)靶标(参见图5a)：
[0616]
·
包含针对hla-a*02-mage-a3(flwgpralv)pmhc的scfv作为a受体的嵌合抗原受体；以及
[0617]
·
包含结合hla-a*02-ny-eso-1(sllmwitqc/v)的scfv作为b受体并且包含pd-1胞内结构域(icd)、ctla-4胞内结构域(icd)或lilrb1(lir1)胞内结构域(icd)的嵌合抗原受体。
[0618]
具有pd-1 icd或ctla-4-icd的每种阻断剂(b)受体介导jurkat细胞中《10x的激活
ec50位移，如通过滴定在t2细胞上负载的肽作为刺激物所测量的(图5b)。令人惊讶地，包含ny-eso-1lbd和lir-1(lilrb1)受体的胞内、跨膜和铰链结构域的b受体介导》5,000x的ec50位移(还有图5b)。除了sllmwitqc/v之外的不相关对照hla-a*02结合肽的滴定提供了由t2细胞上负载的肽竞争可获得的hla分子引起的位移的估值，对总位移的贡献通常《10x(图8)。对于这里报告的ec50位移值，我们通常与仅激活剂构建体的ec50进行比较。
[0619]
对于四种不同的pmhc靶标，总共六种接枝到lir-1上的不同scfv介导ec50的显著位移，范围为10x至1,000x(图5c)。当与标准car融合时，ec50位移的程度(即阻断强度)与scfv的ec50相关(数据未显示)。lir-1b信号传导阻断了来自多个a靶标和scfv的a信号传导(图5d、图26)。阻断是配体依赖性的(图9)。具有lbd但缺乏icd或含有在icd的关键元件中的突变的对照b受体不会阻断通过a受体信号的激活(图10)。具有a受体和b受体的工程化t细胞在多个靶抗原和抗原结合结构域(即，lbd序列)中起作用。
[0620]
当与具有三种不同pmhc靶标的t细胞受体(tcr)胞外结构域融合时，lir-1 icd也起作用(参见方法)。测定了针对三种不同pmhc靶标(两种来自mage-a3，并且一种来自hpv)的tcr。在每种情况下，基于lir-1的b受体使激活ec50大量位移，范围为1,000x至10,000x。具有与其融合的ny-eso-1 tcr可变结构域lbd“eso(ftcr)”的基于lir-1的b受体也能够阻断通过car或tcr的激活。这包括以下受体对：
[0621]
1.包含结合mage-a3
flwgpralv
肽:mhc复合物的tcr lbd的激活剂(a)tcr(“mp1-tcr”)被包含scfv ny-eso-1 scfv lbd(“eso”)和lir-1 icd的b受体阻断，所述b受体使激活ec50位移了很大的量(图5e)；
[0622]
2.包含结合mage-a3
mpkvaelvhfl
肽:mhc复合物的第二tcr lbd的a tcr(“mp2-tcr”)被包含scfv ny-eso-1 scfv lbd(“eso”)和lir-1 icd的b受体阻断，所述b受体使激活ec50位移了很大的量(图5e)；
[0623]
3.包含结合hpv
tihdiilecv
肽:mhc复合物的tcr lbd的a tcr(“hpv e6-tcr”)被包含scfv ny-eso-1 scfv lbd(“eso”)和lir-1 icd的b受体阻断，所述b受体使激活ec50位移了很大的量(图5e)；
[0624]
4.包含结合mage-a3
flwgpralv
肽:mhc复合物的tcr lbd的a tcr(“mp1-tcr”)被包含ny-eso-1 tcr lbd(“eso(ftcr)”)和lir-1 icd的b受体阻断，此阻断剂使激活ec50位移了很大的量(图5f)；
[0625]
5.包含结合mage-a3
flwgpralv
肽:mhc复合物的scfv lbd的a car(“mp1-car”)被包含tcr ny-eso-1 tcr可变结构域lbd(“eso(ftcr)”)和lir-1 icd的b受体阻断。此阻断剂使激活ec50位移了很大的量(图5f)。
[0626]
确认顺式效应
[0627]
工程化效应细胞应从作为双重a 和b 的那些靶细胞中区分出仅a (即仅展示激活剂)的潜在靶细胞。为了确认我们的受体系统如预期那样工作，用具有a受体和b受体的工程化效应细胞(jurkat细胞)测试大致为细胞大小(d～2.8μm)的负载靶标的珠粒(图5g)。甚至当a 珠粒仅占总珠粒的20％时，效应细胞确实被a 和b 珠粒的混合物激活。这证实效应细胞能够识别在包含正常细胞(由b 珠粒表示)的混合群体中的具有杂合性丧失的靶标(由a 珠粒表示)。
[0628]
确认靶标浓度非依赖性
[0629]
在患者中，靶标密度将根据a靶标和b靶标的表达水平而变化。我们确认，当a靶标密度变化时(数据未示出)和当b靶标密度变化时(图5h)，该系统在高密度和低密度靶标两种情况下都工作。在图5h中，测试了以不依赖肽的方式结合b细胞标记cd19或hla-a*02的scfv。这些非pmhc靶标代表了可以延伸到100,000个表位/细胞范围内的表面抗原。在这种情况下，在瞬时转染测定中使用不同的dna浓度改变a模块与b模块表达的比率。观察到10x以上的emax位移。这些实验表明，对pmhc靶标观察到的双受体系统的特性对于高密度靶标通常是相同的。
[0630]
原代t细胞中的b受体功能
[0631]
将负载有一定滴度的靶标肽的表达海肾萤光素酶(biosettia)的mcf7肿瘤细胞用作靶细胞，其中萤光素酶用作细胞存活力的读数。原代t细胞用作为a受体的hpv tcr(“hpv e7 tcr”)和包含与lir-1铰链、跨膜结构域和icd融合的抗ny-eso-1 scfv的b受体(“eso-lir-1”)进行转导，或者不转导(“未转导”)。使用与结合至b受体lbd的hla-a*02四聚体偶联的珠粒通过物理选择富集转导的t细胞。为了改变靶标浓度，靶细胞负载有不同量的hpv肽。原代t细胞以剂量依赖性方式被激活。b受体的表达使ec50曲线位移了约100x(图6a)。在jurkat细胞中，在a受体与b受体的各种比率(通过转染各种激活剂:阻断剂dna比率实现)下，对于与包含抗hla-a*02lbd和lir-1铰链、跨膜结构域和icd的b受体配对的抗ny-eso-1car a受体获得了类似的结果(图6b)。用t细胞中用与hla-a*02阻断剂配对的cd19 car激活剂证实了此结果(图6c)。因此，尽管它们具有复杂性、异质性和供体-与-供体的可变性，但是激活剂和阻断剂受体对的基本功能在原代t细胞中得以再现。
[0632]
实施例4：用配对的a受体和b受体靶向杂合性丧失
[0633]
hla基因座是多态性的，仅群体的一个亚组具有hla-a*02等位基因。不依赖于负载的肽结合hla*a02等位基因的mhc的配体-结合结构域(“泛hla-a*02”lbd)可以用于靶向在肿瘤细胞中hla杂合的且具有hla-a*02等位基因的loh的受试者中的肿瘤。
[0634]
hla-a*02特异性scfv与lir-1模块融合，并且显示在jurkat细胞中在存在pmhc-依赖性激活剂(eso-car，图6b)的情况下作为阻断剂起作用。此外，在表达包含抗cd19 scfv的a受体和包含hla-a*02特异性scfv和lir-1lbd的b受体两者的原代t细胞中，b受体根据需要阻断a受体(图6c)。
[0635]
呈cd19 和hla-a*02阴性的raji靶细胞可以用于模拟通过loh丢失hla-a*02的肿瘤细胞。稳定地表达hla-a*02的相同细胞系可以用作正常细胞的模型。如果raji靶细胞仅表达cd19，则raji细胞系激活表达cd19 car和hla-a*02 lir-1阻断剂的jurkat效应细胞。当raji靶细胞用编码hla-a*02的多核苷酸转染时，jurkat效应细胞的激活被阻断(图11)。
[0636]
如上文所述，结合cd19的a受体和结合hla-a*02的b受体在原代t细胞以及jurkat细胞中起作用。工程化t细胞在不存在hla-a*02表达的情况下杀死表达cd19的raji细胞(图6c，上图)。表达cd19和hla-a*02两者的raji细胞被仅表达激活模块的t细胞杀死，但当与表达激活剂和阻断剂模块两者的t细胞一起共培养时，阻断γ-干扰素(ifng)分泌(数据未显示)和细胞毒性(图6c，中间图)两者。携带激活剂和阻断剂模块的原代t细胞在混合培养物中区分cd19 “肿瘤”(图6c，下图)与cd19 /hla-a*02 “正常”细胞(图6c，右图)。
[0637]
基于激活剂和阻断剂机制的t细胞治疗应该能够可逆地起作用，即能够从阻断状态循环至激活状态并返回至阻断状态。将效应细胞与呈cd19 或d19 /hla-a2*02 的raji细
胞一起共培养多轮，所述raji细胞在各轮次之间从培养物中除去。根据需要，对于靶细胞暴露的阻断-杀死-阻断(图6d)和杀死-阻断-杀死程序(图6e)两者，当暴露于raji靶细胞时，暴露于正常细胞的效应细胞不被激活。效应t细胞能够从阻断状态循环到细胞毒性状态和返回，这取决于它们所暴露的靶细胞。
[0638]
实施例5：用配对的a受体和b受体在体内靶向杂合性丧失
[0639]
为了准备好进行体内实验，我们显示在原代t细胞中工程化的cd19/hla-a*02激活剂/阻断剂对允许使用标准cd3/cd28刺激在体外大量扩增(图7a)。因此，可以产生足够量的细胞产物用于患者中作为治疗剂。
[0640]
通过将raji靶细胞注射到免疫受损的(ngs-hla-a2.1)小鼠的胁腹中来产生cd19 /hla-a*02 或cd19 /hla-a*02-肿瘤细胞小鼠异种移植物(图7b)。以2e6或1e7个t细胞的两个剂量注射raji细胞，并且随时间分析肿瘤的生长和植入的t细胞的持久性。在小鼠中仅杀死cd19 /hla-a*02-肿瘤细胞，并且用转移的t细胞数跟踪肿瘤对照，促进宿主小鼠的存活(图7c-7e和图12)。设计用于模拟正常细胞的正常cd19 /hla-a*02 细胞不受治疗的影响。
[0641]
概要
[0642]
我们已经开发了可以利用从loh来源的一大类新的癌症靶标的合成信号整合系统。所述系统无需过多实验即可满足具有loh的患者对细胞治疗的需要。所述系统在jurkat细胞、原代t细胞中和在体内稳健地工作。此系统也是(i)模块化和灵活的，并且在不同靶标密度下跨car和tcr模态工作；(ii)当阻断剂和激活剂靶标以顺式存在于一个表面上时被沉默，但当少数细胞仅表达激活剂时则不沉默；以及(iii)可逆地转换状态，符合在整个身体中搜寻肿瘤细胞的需要。
[0643]
实施例6：实施例3-5的方法
[0644]
细胞培养
[0645]
从bps bioscience获得编码nfat萤光素酶报告子的jurkat细胞。本研究中使用的所有其他细胞系获自atcc。在培养中，将jurkat细胞维持在补充有10％fbs、1％pen/strep和0.4mg/ml g418/遗传霉素的rpmi培养基中。按照atcc的建议维持t2、mcf7和raji细胞。通过用hla-a*02慢病毒(定制慢病毒，alstem)以moi 5转导raji细胞来制备“正常”raji细胞。使用facsmelody细胞分选仪(bd)分选hla-a*02-阳性raji细胞。
[0646]
质粒构建
[0647]
通过将ny-eso-1 scfv lbd与包含白细胞免疫球蛋白样受体亚家族b成员1(lilrb1、lir-1)、程序性细胞死亡蛋白1(pdcd1、pd-1)或细胞毒性t淋巴细胞蛋白4(ctla4、ctla-4)的铰链、跨膜区和/或胞内结构域的受体的结构域融合来创建ny-eso-1响应性抑制构建体。使用金门克隆(golden gate cloning)将基因区段组合并插入在慢病毒表达质粒中所含的人ef1
ɑ
启动子的下游。
[0648]
jurkat细胞转染
[0649]
通过100ul形式的neon电穿孔系统(thermo fisher scientific)根据制造商的方案使用以下设置来瞬时转染jurkat细胞：3个脉冲，1500v，10毫秒。每1e6个细胞用1-3ug激活剂car或tcr构建体和1-3ug scfv或ftcr阻断剂构建体或空载体进行共转染，并且回收在补充有20％热灭活fbs和0.1％pen/strep的rpmi培养基中。
[0650]
jurkat-nfat-萤光素酶激活研究
[0651]
由genscript合成肽、mage-a3(mp1；flwgpralv)、mage-a3(mp2；mpkvaelvhfl)、hpv e6(tihdiilecv)、hpv e7(ymldlqpet)和修饰的ny-eso-1 eso(eso；sllmwitqv)。从50um开始连续稀释激活肽。将阻断剂肽ny-eso-1稀释至50um(除非另有说明)，将其添加到激活肽系列稀释液中，随后加载到在15ul的补充有1％bsa和0.1％pen/strep的rpmi中的1e4个t2细胞上，并且在384孔低凸缘白色平底聚苯乙烯tc处理的微孔板中孵育。第二天，将1e4个jurkat细胞重悬于15ul的补充有10％热灭活fbs和0.1％pen/strep的rpmi中，添加到负载肽的t2细胞中并共培养6小时。使用一步萤光素酶测定系统(bps bioscience)评价jurkat发光。以技术重复实验进行测定。
[0652]
原代t细胞转导、扩增和富集
[0653]
将冷冻的pbmc在37℃水浴中解冻，并且在含有1％人血清的lymphoone(takara)中以1e6个细胞/ml培养，并且使用补充有il-15(10ng/ml)和il-21(10ng/ml)的1:100t细胞transact(miltenyi)激活。在24小时后，以moi 5向pbmc中添加慢病毒。将pbmc再培养2-3天以允许细胞在transact刺激下扩增。扩增后，根据制造商的说明书使用抗pe微珠(miltenyi)富集激活剂和阻断剂转导的原代t细胞。简而言之，将原代t细胞与1:100稀释的cd19-fc(r&d systems)一起在4℃下在macs缓冲液(0.5％bsa 2mm edta，在pbs中)中孵育30分钟。将细胞在macs缓冲液中洗涤3次并且在macs缓冲液中在4℃下在二级抗体(1:200)中孵育30分钟。然后将细胞在抗pe微珠中孵育并通过ls柱(miltenyi)。
[0654]
原代t细胞体外细胞毒性研究
[0655]
对于使用pmhc靶标的细胞毒性研究，将富集的原代t细胞与负载有一定滴度的如上文所述的靶标肽的表达海肾萤光素酶(biosettia)的2e3个mcf7细胞一起以3:1的效应物:靶标比率孵育48小时。使用海肾萤光素酶报告子测定系统(promega)定量活的表达萤光素酶的mcf7细胞。对于使用非pmhc靶标的细胞毒性研究，将富集的原代t细胞与2e3个wt raji细胞(“肿瘤”细胞)或hla-a*02转导的raji细胞(“正常”细胞)一起以3:1的效应物:靶标比率孵育长达6天。稳定地表达gfp和海肾萤光素酶(biosettia)的wt“肿瘤”raji细胞或hla-a*02“正常”raji细胞稳定地表达rfp，并且使用incucyte活细胞成像仪将萤火虫萤光素酶(biosettia)与未标记的原代t细胞一起成像。使用incucyte成像软件定量活raji细胞随时间的荧光强度。对于可逆性研究，将富集的原代t细胞与“正常”或“肿瘤”raji细胞类似地共培养3天并且成像。3天后，使用cd19阴性选择将t细胞与剩余的raji细胞分离，并且如所描述地用新鲜的“正常”或“肿瘤”raji细胞再接种。在单独的孔中，使用双萤光素酶报告子测定系统(promega)定量活的表达萤光素酶的raji细胞。
[0656]
小鼠异种移植物研究
[0657]
将冷冻的pbmc在37℃水浴中解冻，并且在激活之前在无血清的texmacs培养基(miltenyi)中静置过夜。使用t细胞transact(miltenyi)和texmacs培养基(补充有il-15(20ng/ml)和il-21(20ng/ml))以1.5e6个细胞/ml激活pbmc。24小时后，以moi 5向pbmc中添加慢病毒。将pbmc再培养8-9天以允许细胞在transact刺激下扩增。扩增后，在体内注射之前使用针对链霉亲和素-pe-hla-a*02-pmhc的抗pe微珠(miltenyi)对a2-lir-1(与lir-1铰链、tm和icd融合的pmhc hla-a*02 scfv)富集t细胞。
[0658]
5-6周龄雌性nod.cg-prkdcscid il2rgtm1wjl tg(hla-a/h2-d/b2m)1dvs/szj
(nsg-hla-a2/hhd)小鼠购买自the jackson labs。在研究开始之前，使动物适应饲养环境至少3天。在右胁腹中向动物皮下注射100ul体积的2e6个wt raji细胞或hla-a*02转导的raji细胞。当肿瘤达到70mm3(v＝l x w x w/2)的平均值时，将动物随机分成5个组(n＝7)，并且通过尾静脉施用2e6个(数据未显示)或1e7个t细胞。t细胞注射后，每周进行3次肿瘤测量，并且10天和17天后收集血液用于流式分析。rbc裂解后，将细胞用抗hcd3抗体、抗hcd4抗体、抗hcd8抗体、抗mscd45抗体(biolegend)染色。
[0659]
实施例7：
[0660]
使用如先前所述的nfat萤光素酶报告子系统来测定具有hla-a-a*02抗原结合结构域和lir-1 icd的阻断剂受体(c1765)阻断表达具有egfr抗原结合结构域的激活剂car(ct479)的jurkat细胞的激活的能力。将呈egfr 和hla-a*02-的野生型hela肿瘤细胞用作靶细胞。egfr /hla-a*02-hela细胞也用编码hla-a*02 的多核苷酸转导以产生egfr /hla-a*02 hela细胞用作表达激活剂和阻断剂抗原两者的靶细胞。
[0661]
如图13所示，与不表达阻断剂的jurkat细胞的car emax相比，表达egfr car的jurkat细胞中hla-a*02 lir-1阻断剂的表达使car e
max
位移了》5倍。
[0662]
此外，用在靶细胞上较低的hla-a2表达水平观察到较低的阻断。野生型hct116细胞是egfr 和hla-a*02的。使用抗egfr抗体和抗hla-a*02抗体(bb7.2)在hct116细胞和用编码hla-a*02多核苷酸的多核苷酸转导的hela细胞中测定egfr和hla-a*02的水平，随后进行fac分选。如图14a和14b所示，hct116细胞具有比转导的hela细胞更低水平的阻断剂hla-a*02抗原。当表达egfr car和hla-a*02 lir-1阻断剂的jurkat细胞与表达egfr和hla-a*02抗原的hct116靶细胞一起呈现时，hla-a*02 lir-1阻断剂的存在使egfr car的e
max
位移了1.8倍(图15b)。相反，表达较高水平的hla-a*02抗原的转导hela细胞能够介导》5倍的egfr car e
max
位移(图13)。作为对照，通过egfr敲除的hct116细胞进行的激活最小(图15a)。
[0663]
使用基于珠粒的系统测定使用egfr car和hla-a*02 lir-1阻断剂实现50％阻断所必需的阻断剂与激活剂比率，其显示于图16a和16b中。
[0664]
为了确定激活剂抗原的ec50，用不同浓度的激活剂抗原包被激活剂珠粒。添加不相关蛋白质至每个浓度中使得总蛋白质浓度相同，并且将恒定量的珠粒添加到表达egfr car的jurkat效应细胞中(图16a)。
[0665]
为了确定阻断剂抗原ic50，将珠粒用ec50浓度(在图16a中确定)的激活剂抗原包被，并且用不同浓度的阻断剂抗原包被。在每个浓度添加不相关蛋白使得总蛋白质浓度保持相同，并且将恒定量的珠粒添加到表达egfr car或者egfr car和hla-a*02 lir-1阻断剂的jurkat效应细胞中(图16b)。
[0666]
实施例8：使用实体瘤细胞系，基于lir-1的阻断剂可以抑制tcr信号传导
[0667]
使用负载有不同浓度的激活剂和阻断剂肽的a375靶细胞测定表达mage-a3激活剂tcr和基于ny-eso-1 scfv lir-1的抑制性受体(包含lir-1铰链、tm和icd)的jurkat效应细胞。使用nfat萤光素酶测定来测定jurkat细胞激活(参见实施例6)。
[0668]
如图17所示，用50μm ny-eso-1肽加载a375细胞使激活剂tcr e
max
位移大于10倍。a375细胞对比t2靶细胞中肽加载效率的差异估计为约100x。肽加载可以解释表观治疗窗口。
[0669]
实施例9：使用b细胞白血病细胞系，基于hla-a*02 lir-1的阻断剂可以抑制car信
号传导
[0670]
使用nalm6靶细胞测定在共表达或不共表达基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体(包含lir铰链、tim和icd)的情况下表达非pmhc的高密度cd19特异性激活剂(cd19 scfv car激活剂)的jurkat效应细胞。使用nfat萤光素酶测定来测定jurkat细胞激活(参见实施例6)，并且改变效应细胞与靶细胞(e:t)比率。
[0671]
如图18所示，jurkat细胞表达阻断剂能够使car的e
max
位移大于5倍。
[0672]
实施例10：基于hla-a*02 lir-1的阻断剂可以以剂量依赖性方式抑制car信号传导
[0673]
用负载有不同量的肽(注意，在这种情况下，相同的肽被激活剂和阻断剂scfv两者识别)的t2靶细胞测定表达ny-eso-1 scfv car和基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体的jurkat效应细胞。使用nfat萤光素酶测定来测定jurkat细胞激活(参见实施例6)。用不同比率的激活剂与阻断剂dna(即1:1、1:2和1:3激活剂与阻断剂)转染jurkat细胞，以改变jurkat细胞表达的受体的比率。
[0674]
从图19中可以看出，即使是用1:1比率的激活剂和阻断剂受体dna转染的jurkat细胞，基于mhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体(阻断剂)也能够抑制激活剂car对jurkat细胞的激活。此外，与jurkat细胞转染中使用的激活剂受体dna相比，抑制性受体阻断激活的程度随着抑制性受体dna量的增加而增加。
[0675]
实施例11：基于hla-a*02 lir-1的阻断剂可以抑制具有可调强度的通用(泛hla i类)激活剂。
[0676]
使用hla-a*02阳性t2细胞测定了表达具有基于泛hla抗体w6/32的三个不同scfv结合结构域的泛hla scfv car和基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体的jurkat效应细胞的激活。从图20中可以看出，每种激活剂scfv在hla-a*02阴性jurkat细胞中支持不同的功能信号。当jurkat细胞与hla-a*02-阳性t2靶细胞以1:2的e:t比率接触时，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体能够阻断来自所有三种泛hla scfv car的功能性信号。此外，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体能够抑制激活剂高达25倍。
[0677]
实施例12：基于hla-a*02 lir-1的抑制性受体可以阻断通过msln car激活剂进行的激活。
[0678]
使用实施例6中所描述的nfat萤光素酶测定来测定表达msln car激活剂和基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体的jurkat效应细胞的激活。
[0679]
用1:4比率的激活剂:阻断剂dna转染jurkat细胞，并且在基于无细胞珠粒的测定中测定激活(图21a)。珠粒负载有激活剂抗原或者激活剂和阻断剂抗原，并且改变珠粒与jurkat细胞的比率。在基于无细胞珠粒的测定中，当细胞与顺式携带pmhc hla-a*02阻断剂和msln激活剂的珠粒接触时，基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体能够阻断jurkat细胞的激活。珠粒上pmhc hla-a*02阻断剂的存在能够使msln car的e
max
位移大于或等于12x(图21a)。
[0680]
对于激活使用慢性髓细胞性白血病细胞系k562来测定用相同的激活剂和阻断剂以1:4dna比率转染的jurkat细胞的激活。k562表达激活剂抗原mlsn。测定了jurkat效应细胞对用hla-a*02转导以表达激活剂和阻断剂抗原两者的k562细胞(msln hla-a*02 )和表达激活剂但不表达阻断剂抗原的未转导k562(msln hla-a*02-)的响应。从图21b中可以看
出，k562细胞对hla-a*02 的表达能够使msln car e
max
位移大于5x。
[0681]
pmhc hla-a*02抑制性受体通过msnl scfv car阻断激活的能力也使用效应原代t细胞和siha或hela靶细胞如实施例6中对于raji所描述的进行测定。siha和hela细胞内源性地表达msln，并且被转导以表达hla-a*02抑制性受体靶标。通过观察ifnγ的诱导倍数来测定原代效应t细胞的激活。如图22所示，当原代t细胞与表达hla-a*02的siha或hela靶细胞一起呈现时，pmhc hla-a*02 lir-1抑制性受体能够阻断原代t细胞的激活(分别大于10x和5x抑制)。
[0682]
当t细胞与表达msln但不表达hla-a*02的siha细胞一起呈现时，pmhc hla-a*02抑制性受体也能够抑制表达msln scfv car和pmhc hla-a*02 lir-1抑制性受体两者的t细胞的杀伤(图23)。
[0683]
实施例13：基于hla-a*02 lir-1的抑制性受体可以阻断通过egfr car激活剂进行的激活。
[0684]
使用实施例6中所描述的nfat萤光素酶测定来测定表达egfr car激活剂和基于pmhc hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体(包含lir-1铰链、跨膜和icd)的jurkat效应细胞的激活。
[0685]
用激活剂和阻断剂受体dna转染转染jurkat细胞，并且在基于无细胞珠粒的测定中测定激活(图24)。珠粒负载有激活剂抗原、阻断剂抗原或者激活剂和抑制剂抗原，并且改变珠粒与jurkat细胞的比率。在基于无细胞珠粒的测定中，当细胞与顺式携带hla-a*02阻断剂和egfr激活剂的珠粒接触时，基于hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体能够阻断jurkat细胞的激活，但是当hla-a*02阻断剂和egfr激活剂为反式(在不同的珠粒上)时则不能阻断。珠粒上hla-a*02阻断剂的存在能够使egfr car的emax位移大于或等于9x(图24)。
[0686]
使用hela和siha细胞作为靶细胞来测定表达egfr car激活剂和基于hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体的jurkat细胞的激活。野生型hela和siha细胞系表达egfr但不表达hla-a*02(siha wt和hela wt)，但被转导以表达hla-a*02抑制性受体靶标(siha a02和hela a02)。从图25a-25b中可以看出，基于hla-a*02 scfv lir-1的抑制性受体能够使egfr e
max
位移大于4x(使用siha靶细胞)(图25a)和大于5x(使用hela靶细胞)(图25b)。
[0687]
实施例14：激活剂和阻断剂对可以在kras等位基因之间作出区分
[0688]
miha是衍生自在等位基因之间含有非同义差异的蛋白质的肽。使用kras作为miha的模型，使用对kras g12v和kras g12d突变具有特异性的抗原结合结构域，激活剂和阻断剂对能够区分并响应于不同的kras变体。
[0689]
使用实施例6中所述的jurkat-nfat-萤光素酶激活研究和t2靶细胞，测定了基于kras scfv或ftcr抑制性lir-1的受体抑制由激活剂kras car或tcr介导的激活的能力。
[0690]
图27显示kras g12v scfv阻断剂能够抑制kras g12d tcr(c-891)对jurkat细胞的激活并且使kras g12d e
max
位移14x。图28显示了交互对(kras g12d scfv阻断剂和kras g12v tcr激活剂(c-913))的类似结果，其中抑制剂能够使kras g12v e
max
位移8x。
[0691]
图29显示kras g12v ftcr阻断剂能够抑制kras g12d tcr。抑制剂能够使kras g12d e
max
位移大于50x。在这种情况下，具有lir-1跨膜结构域和胞内结构域的构建体被包括在抑制性tcr的α和β链两者上(lir-1在α和β上)，仅在tcrα链上(lir-1仅在α上)，仅在tcrβ链上(lir-1仅在β上)，并且包括不具有lir-1 icd的版本作为对照(无lir-1)。在交互实验
中，kras g12d ftcr阻断剂能够抑制kras g12v激活剂tcr，使kras g12v e
max
位移大于500x。
[0692]
最后，此效应依赖于特异性配体结合结构域，因为具有不相关scfv结构域的抑制性受体的对几乎没有对激活剂e
max
的影响(图31a-31b)。
[0693]
表14列出了kras scfv和ftcr序列。所有scfv均与lir-1铰链、tm和icd融合。所有ftcr均与lir-1 tm和icd融合。
[0694]
表14.kras scfv和ftcr序列。
[0695]
[0696]
[0697][0698]
表15.ftcr序列与lir-1 tm融合并且无icd作为对照。
[0699][0700]
实施例15：识别miha-y的tcr的表征
[0701]
将来自jb2.3和p2a小鼠tcr的tcrα和β胞外结构域克隆到激活剂tcr构建体中。使用天然的小鼠或人恒定区。将负载有mh-y h-2db肽kcsrnrqyl(seq id no:256)的el5细胞用作靶细胞以测定用miha-y tcr转染的jurkat细胞的激活(图32)。从图32中可以看出，c-003121支持稳健的jurkat细胞激活。
[0702]
表16.具有小鼠或人恒定区的小鼠miha-y tcr序列
[0703]
[0704][0705]
实施例16：次要组织相容性抗原ha-1抑制性受体
[0706]
携带hla-a*02和a*11 i类等位基因的t2细胞在不存在或存在50um a*02特异性ha-1阻断剂肽的情况下加载有一定滴度的a*02特异性ny-eso-1肽。如上文所述测定表达ny-eso-1 tcr或ny-eso-1 tcr和ha-1 ftcr的jurkat效应细胞的激活(参见实施例6)。图33a显示在不存在阻断剂肽的情况下，ny-eso-1 tcr的敏感性不受ha-1 ftcr存在的影响。在存在ha-1(h)阻断剂肽的情况下，ny-eso-1和ha-1(h)肽竞争相同的hla-a*02等位基因，导致约30x的ec50右位移(实线正方形至虚线正方形)。然而，在存在ha-1 ftcr阻断剂的情况下观察到约10x的活性的另外右位移(虚线正方形至虚线圆圈)。此外，emax向下位移1.5x(实线圆圈到虚线圆圈)。图33b显示在存在非特异性等位基因变体ha-1(r)阻断剂肽的情况下，基本上没有观察到阻断，表明阻断对单个氨基酸具有特异性。通常，因为ny-eso-1比ha-1(r)更有效地加载到hla-a*02中(参见图35)，在存在ha-1(r)阻断剂肽的情况下也仅观察到3-5x右位移(实线至虚线)。
[0707]
肽序列如下：
[0708]
ny-eso-1＝sllmwitqv(seq id no:265)，
[0709]
ha-1(h)＝vlhddllea(seq id no:191)，
[0710]
ha-1(r)＝vlrddllea(seq id no:266)。
[0711]
ha-1 ftcr还可以在存在ha-1(h)肽的情况下特异性地阻断kras tcr。携带hla-a*02和a*11 i类等位基因的t2细胞在不存在或存在50um a*02特异性ha-1阻断剂肽的情况下加载有一定滴度的a*11特异性kras肽。如上文所述测定表达ny-eso-1 tcr或ny-eso-1 tcr与ha-1 ftcr的jurkat效应细胞的激活(参见实施例6)。图34a显示在不存在阻断剂肽的情况下，kras tcr的敏感性不受ha-1 ftcr存在的影响。在存在ha-1(h)阻断剂肽的情况下，
ha-1 ftcr在活性方面阻断kras tcr约5x(实线圆圈至虚线圆圈)。此外，emax向下位移2.7x(实线圆圈到虚线圆圈)。图34b显示在存在非特异性等位基因变体ha-1(r)阻断剂肽的情况下，基本上没有观察到阻断，表明阻断对单个氨基酸具有特异性。通常，因为kras和ha-1(h)或ha-1(r)不加载到相同的等位基因中，在存在阻断剂肽的情况下没有观察到显著的右位移(实线至虚线)。
[0712]
使用bb7.2染色比较了t2细胞对ny-eso、ha-1(h)和ha-1(r)肽的负载，所述bb7.2染色特异性地识别负载肽的hla-a*02i类等位基因产物，并且使用流式细胞术定量。图35显示在t2细胞中hla-a*02特异性ny-eso-1和ha-1(h)肽的负载非常相似。等位基因变体ha-1(r)比ha-1(h)和ny-eso-1肽加载的效率略低。
[0713]
ha-1(h)ftcr序列如表10中所述，ny-eso-1和kras tcr如下表17所示。
[0714]
表17.ny-eso-1和kras tcr序列
[0715]
[0716]
实施例17：激动剂和抑制剂肽的比率
[0717]
在与负载激活剂和阻断剂肽的t2细胞一起共培养6小时之后，测量用单独的或与ny-eso-1 scfv lir1阻断剂组合的激活剂mage-a3 car转染的jurkat细胞的nfat-萤光素酶信号。图36a显示了与负载有滴定量的激活剂mage-a3肽和固定浓度的阻断剂ny-eso-1肽的t2细胞一起共培养的jurkat细胞的响应。图36b显示了jurkat对负载有滴定量的阻断剂ny-eso-1肽和高于emax浓度(约0.1μm)的固定浓度的激活剂mage-a3肽的t2细胞的响应。图36c显示了归一化至用于每条曲线的恒定激活剂mage肽浓度并绘制在x轴上的来自图36b的x值阻断剂ny-eso-1肽浓度。每条曲线指示了50％阻断(ic50)所需的阻断剂肽与激活剂肽的比率。所需的b:a肽比率小于1，表明对于这对激活剂car和阻断剂，靶细胞上需要相似(或较少)的阻断剂pmhc抗原来阻断激活剂pmhc抗原。在与激活pmhc car中产生响应的pmhc抗原密度相似的pmhc抗原密度下阻断是可能的。
[0718]
实施例18：特异性受体对的优化
[0719]
将用egfr scfv car激活剂(ct-479、ct-482、ct-486、ct-487或ct-488，如图37所示)或用egfr scfv car激活剂和hla-a*02 pa2.1 scfv lir1抑制剂(c1765)转染的t细胞与hela靶细胞一起共培养。野生型hela细胞系表达egfr但不表达hla-a*02，但被转导以表达hla-a*02抑制性受体靶标。将细胞以1:1的效应物与靶标(e:t)比率共培养。在图37的右下方，首先指示效应细胞受体表达，而hela细胞表达在括弧中。从图37中可以看出，当相同的hla-a*02 pa2.1 scfv lir1抑制剂与不同的egfr激活剂受体一起使用时，观察到不同程度的阻断。
[0720]
实施例19：抑制性受体可逆地降低激活剂受体在t细胞中的表面水平
[0721]
用egfr scfv car激活剂(ct-479、ct-482、ct-486、ct-487或ct-488)和hla-a*02 pa2.1 scfv lir1抑制剂(c1765)转导来自两个hla-a*02阴性供体的原代t细胞。通过对阻断剂和激活剂受体进行facs分选或通过对阻断剂和激活剂受体进行双重柱纯化来富集转导的细胞。将转导的t细胞与hela靶细胞一起共培养。野生型hela细胞系表达egfr但不表达hla-a*02，但被转导以表达hla-a*02抑制性受体靶标。将细胞以1:1的效应物与靶标(e:t)比率共培养。120小时后使用结合激活剂和阻断剂受体的标记的肽和荧光激活的细胞分选测定egfr car激活剂的表面表达。与表达激活剂和阻断剂配体两者的hela细胞一起共培养后激活剂表面水平的变化对应于t细胞杀死靶细胞的能力(比较图37和图38)。
[0722]
将表达ct-482 egfr scfv car激活剂和hla-a*02 pa2.1 scfv lir1抑制剂(c1765)组合的t细胞与表达egfr(靶标a)、表达hla-a*02(靶标b)、在同一细胞上表达egfr和hla-a*02的组合(靶标ab)的hela细胞、在不同细胞上表达靶标a和靶标ab的hela细胞的混合群体、或在不同细胞上表达靶标b和靶标ab的hela细胞的混合群体一起共培养(图39a-39b)。将t细胞与hela靶细胞一起以1:1的效应细胞与靶细胞比率培养。当t细胞与hela细胞的靶标a加靶标ab群体一起共培养时，激活剂的水平降低，然后恢复(图39a)。此外，激活剂和阻断剂抗原必须一起存在于同一细胞上，以触发效应t细胞上的激活剂表面表达的丢失。与激活剂相反，阻断剂表达在很大程度上没有变化(图39b)。
[0723]
图40显示了确定t细胞对激活剂受体表达的丢失是否为可逆的实验的示意图。将表达egfr scfv car激活剂受体(ct-487)和hla-a*02 pa2.1 scfv lir1(c1765)抑制剂受体的t细胞与表达激活剂和阻断剂受体靶标两者(ab)的hela靶细胞一起共培养。共培养3天
后，使用抗egfr柱除去hela细胞，并且将t细胞针对激活剂和抑制剂受体染色，或者与仅表达egfr激活剂靶标的hela细胞一起再共培养3天。再共培养3天后，使用抗egfr柱再次除去hela细胞，并且将t细胞针对激活剂和抑制剂受体染色，或者与仅表达egfr激活剂靶标或表达激活剂和阻断剂靶标两者(ab)的hela细胞一起再共培养3天，之后染色。使用标记的egfr和a2探针测定t细胞中激活剂和抑制剂受体(染色的)的存在，并且使用荧光激活的细胞分选定量受体表达水平。实验结果显示在图41a-41b中。如图41a-41b所示，t细胞与表达激活剂和抑制剂靶标两者的hela细胞的共培养减少了egfr激活剂染色(图41a-41b，左图)。当在第2轮将t细胞与表达激活剂(仅靶标a)的hela细胞一起共培养时，egfr激活剂的表达增加。因此，激活剂表面丢失是可逆的并且通过t细胞细胞毒性进行跟踪。
再多了解一些
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