测量微生物的抗微生物剂敏感性

测量微生物的抗微生物剂敏感性
发明领域
1.本发明涉及适合用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的装置、包含所述装置的系统、该装置和系统用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途，以及使用所述系统测量微生物的抗微生物剂敏感性的方法。
2.发明背景
3.联合国(un)和世界卫生组织(who)都将amr列为全球关注的问题以及其最大的公共卫生问题之一(food and agriculture organization of the united nations；antimicrobial resistance policy review and development framework(2018)；和world health organization global action plan on antimicrobial resistance(2015))。the national institute for health and care excellence(nice)将amr报告为需要紧急协调的国际行动的问题(nice影响抗微生物剂耐药性(2018))。近年来，解决amr的方法，例如发现和开发新的抗微生物药物来预防和治疗细菌感染已经停滞不前，并且目前的药物管道正在努力交付(todd,a.,worsley,a.,anderson,r.j.,groundwater,p.w.,2009.the pharmaceutical journal.283,359-360)。然而，医疗保健和农业部门过度使用和滥用抗生素的影响已经导致了amr的发展和传播(davies,j.,davies,d.,2010.microbio and mol.bio.rev.74,417-433)。因此，需要单一健康方法(one-health approach)(mcewen,s.a.,collignon,p.j.,2018.microbiol spectr.6)来解决amr，包括开发快速且可靠的诊断测试以确定感染的性质(细菌或非细菌)，确保有效使用抗微生物药物并降低耐药性的发展速度(department of health & social care.the uk’s vision for amr by 2040和五年国家行动计划，2019)。
4.目前用于鉴定病原体的金标准通常基于琼脂平板上的细菌培养，其使用经典的微生物技术(gilligan,p.h.,2013.the prokaryotes,human microbiology,第3版springer reference,heidelberg,new york,dordrecht,london)。此类方法通常不够快速来满足现代需求，其处理时间通常为1-2天。因此，这些方法不适合在护理点进行快速筛查。最近的技术，如聚合酶链式反应(pcr)可以快速鉴定细菌种类。然而，该技术需要复杂的样品处理并且实施起来通常很昂贵(clarridge,j.e.,2004.diseases.clin.microbiol.rev.17,840-862)。因此，需要这样的新技术来帮助减轻抗微生物抗性的传播，所述技术可以快速评估抗生素对一系列临床样本的有效性，样本处理的复杂性很小，并且可以鉴定需要开哪种抗生素。
5.电化学传感器提供无标记检测、低成本生产、与包括微流体在内的其他技术的集成((nie,z.,nijhuis,c.a.,gong,j.,chen,x.,kumachev,a.,martinez,a.w.,narovlyansky,m.,whitesides,g.m.,2010.lab chip.10,477-483)并且可以与简单的电子器件集成以提供实时数据和信号读出(wang,w.,huang,h.y.,chen,s.c.,ho,k.c.,lin,c.y.,chou,t.c.,hu,c.h.,wang,w.f.,wu,c.f.,luo,c.h.,2011.sensors.11,8593-8610)。适用于低成本集成并能够实时捕获数据的一种电化学技术是电化学阻抗谱(eis)。使用eis，可以在一系列频率范围内研究电极-电解质界面的阻抗，以建立有关界面、其电子转移
特性和周围扩散行为的信息。阻抗的变化可以反映细菌生长作为时间函数的变化(ward,a.c.,hannah,a.j.,kendrick,s.l.,tucker,n.p.,macgregor,g.,connolly,p.,2018.biosensors and bioelectronics.110,65-70；brosel-oliu,s.,mergel,o.,uria,n.,abramova,n.,van rijn,p.,bratov,a.,2019.lab.chip.19,1436-1447)。此前，已经使用eis鉴定了几种微生物，例如金黄色葡萄球菌(s.aureus)(ward等人，同上)、大肠杆菌(escherichia coli)(settu,k.,liu,j.t.,chen,c.j.,tsai,j.z.,chang,s.j.,2013.conf.proc.ieee eng.med.biol.soc.2013,1712-1715)和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)(ward,a.c.,connolly,p.,tucker,n.p.,2014.plos one.9,91732)。
6.另一种目的电化学测量技术是差分脉冲伏安法(dpv)。dpv是伏安技术的实例，其中一系列规则的电压脉冲叠加在潜在的线性扫描或阶梯波形上。它是快速的方法，消除了非法拉第充电电流，并且可用于敏感地研究到电极表面或来自电极表面的电子转移(batchelor-mcauley,c.,katelhon,e.,barnes,e.o.,compton,r.g.,laborda,e.,molina,a.,2015.chemistryopen.4,224-260)。
7.已发现电化学系统广泛用作生物传感器(jiang,d.,ge,p.,wang,l.,jiang,h.,yang,m.,yuan,l.,ge,q.,fang,w.,ju,x.,2019.biosensors and bioelectronics.130,299-306；russell,c.,ward,a.c.,vezza,v.,hoskisson,p.,alcorn,d.,steenson,d.p.,corrigan,d.k.,2019.biosensors and bioelectronics.126,806-814)。
8.本发明提供了用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的备选装置。
9.发明概述
10.已经发现，当微生物与装置接触时，本发明的装置和包括本发明的装置的系统在测量微生物生长方面出人意料地有效。在抗微生物剂存在下的微生物生长表明微生物的抗微生物剂耐药性水平和较低的抗微生物剂敏感性。因此，使本发明的装置与至少一种抗微生物剂和微生物接触，并测量微生物生长给出了微生物的抗微生物剂敏感性的有效指示。本发明的装置和系统在以低成本确定微生物的抗微生物剂敏感性方面是有效的，并且对一系列临床相关病原体具有高敏感性。
11.本领域技术人员知道，对本发明的方面的任何提及包括该方面的每个实施方案。例如，对本发明第一方面的任何提及包括第一方面和第一方面的所有实施方案。
12.从第一方面来看，本发明提供了测量微生物的抗微生物剂敏感性的方法，包括：
13.(i)使装置或系统与至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂以及怀疑包含或已知包含微生物的样品接触，其中所述装置包括：
14.(a)包含两个或多个电极的电极系统；和
15.(b)与两个或多个电极接触的第一物质，其中所述第一物质是凝胶、泡沫或固体的形式，其适用于电导并且其能够支持微生物生长；
16.并且该系统包括：
17.(a)一个或多个装置；和
18.(b)恒电位仪，
19.其中所述电极系统的电极与所述恒电位仪电连接；
20.(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
21.(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的电响应；
22.其中至少第一和第二时间点之间的电响应差异指示微生物生长。
23.在一个实施方案中，所述方法包括在存在至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂的情况下测量微生物生长，并在不存在抗微生物剂或候选抗微生物剂的情况下进一步测量微生物生长。微生物生长测量中的任何差异都表明微生物的抗微生物剂敏感性。
24.从第二方面来看，提供了适用于测量微生物的抗微生物活性的装置，如第一方面所定义的，其包含：
25.(i)包含两个或多个电极的电极系统；
26.(ii)与两个或多个电极接触的第一物质，其中所述第一物质为凝胶、泡沫或固体的形式，其适用于电导并且能够支持微生物生长；和
27.与所述第一物质接触的至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂。
28.可以设计所述第一物质以确保微生物是否对所述一种或多种抗微生物剂敏感。
29.从第三方面来看，本发明提供了第二方面的装置用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途。
30.从第四方面来看，本发明提供了适用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的系统，如第一方面所定义的，其包含：
31.(i)第一方面的一个或多个装置；和
32.(ii)恒电位仪
33.其中电极系统的电极与恒电位仪电连接，并且一个或多个装置中的至少一个包含与第一物质接触的至少一种抗微生物剂或抗微生物剂候选物。
34.在第四方面的实施方案中，所述一个或多个装置可用于测试微生物对一种或多种抗微生物剂的敏感性。因此，一个或多个装置可以包含不同的抗微生物剂。
35.从第五方面来看，本发明提供了第四方面的系统用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途。
36.从第六方面来看，本发明提供了试剂盒，其包含：
37.(i)任何前述方面和/或实施方案的至少一个装置或系统；和
38.(ii)至少一种抗微生物剂。
39.附图列表
40.图1：(a)(i)以au dropsens电极为特征的实验装置，所述电极用含有琼脂糖、lb和ff-c的凝胶沉积物以及一些用抗生素进行修饰；示意图描绘了将细菌移液到电极上，并使用恒电位仪进行电化学测量；(a)(ii)用琼脂糖凝胶沉积物修饰的电极表面；(b)典型的电化学阻抗谱(eis)测量；插图显示了用于拟合eis数据的randles’等效电路模型；(c)对含有f-f kcl的不同浓度琼脂糖凝胶的cv(i)和eis(ii)测量；(d)cv(i)和eis(ii)测量比较凝胶沉积技术。
41.图2：(a)稀释至典型工作浓度的一系列抗生素的cv测量；(b)含有阿莫西林、含有和不含有ff-c的1wt％琼脂糖凝胶的cv测量；(c)含有和不含有ff-c的1wt％lb琼脂糖凝胶的cv测量；(d)20μl和50μl含ff-c的1wt％琼脂糖凝胶的cv测量。
42.图3：在注入和未注入阿莫西林(金黄色葡萄球菌为8μg/ml，mrsa为50μg/ml)的凝胶上的敏感的金黄色葡萄球菌(a)和mrsa(b)菌株和基线(无细菌)的细菌生长曲线；(i)
100khz处的z和(ii)100khz处的z-基线曲线。
43.图4：在划线培养平皿上包含1wt％琼脂糖和lb的凝胶上生长的金黄色葡萄球菌。凝胶成分：(a)(i)琼脂糖 lb，(a)(ii)琼脂糖 lb 阿莫西林，(b)(i)琼脂糖 lb ff-c和(b)(ii)琼脂糖 lb ff-c 阿莫西林。
44.图5：(a)在划线培养平皿上包含1wt％琼脂糖 lb ff-c且(i)不含阿莫西林和(ii)含阿莫西林的凝胶上生长的金黄色葡萄球菌。(b)在划线培养平皿上包含1wt％琼脂糖 lb ff-c且(i)不含阿莫西林和(ii)含阿莫西林的凝胶上生长的mrsa。
45.图6：在注入和未注入苯唑西林(oxa)(8μg/ml)的凝胶上的敏感的金黄色葡萄球菌(a)和mrsa(b)菌株和基线(无细菌)的细菌生长曲线；(i)100khz处的z和(ii)100khz处的z-基线曲线。
46.图7：在注入和未注入阿莫西林(amox)(8μg/ml和50μg/ml)的凝胶上的mrsa和基线(无细菌)的细菌生长曲线。(i)i
pk
和(ii)i
pk
–
基线曲线。
47.图8：(左栏)环境湿度水平对100khz时凝胶电化学阻抗的影响。a)进行的所有实验的概述显示，在除75％测试之外的所有情况下，水凝胶在经过一定时间后开始变干，表现为阻抗急剧增加。b)75％湿度测量表明水凝胶阻抗和环境湿度水平之间存在线性相关性(r2＝0.95)(在允许湿度稳定10分钟后)c)为维持凝胶完整性而创建的测试支撑结构。显示3x spe的测试支撑图像(左)和显示凝胶沉积和细菌培养的测试支撑水凝胶外壳的示意图(右)(d)测量前(上)，在有测试支撑(中)的情况下8小时基线测量后用凝胶沉积，和在没有测试支撑的情况下在75％湿度测量后用“坍塌”形式(下)修饰的au dropsens电极的照片e)在有和没有测试支撑的情况下，比较100khz处的z的仅使用凝胶的电化学基线数据(n＝3spe)。
48.图9：a)含和不含链霉素的凝胶在生长曲线的100khz％变化时的z。b)含和不含链霉素的凝胶在100khz％变化时的相角生长曲线。
49.发明详述
50.本发明的装置和包括所述装置的系统在测量微生物生长和以低成本确定微生物对一系列临床相关微生物菌株的抗微生物剂敏感性方面出人意料地有效。此外，所述装置和系统能够检测不同类别、物种或亚种的微生物。例如，该装置和系统可能能够检测细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性。现在详细描述该装置和系统。
51.在随后的讨论中，除非上下文有相反的指示，否则参考了具有以下提供的含义的多个术语。本文用于定义化合物，特别是根据本发明的化合物的命名法通常基于iupac组织关于化学化合物的规则，特别是“iupac compendium of chemical terminology(gold book)”。
52.术语“包含”或其变体将被理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素，整数或步骤组。
53.术语“由
…
组成”或其变体将被理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤组，并且排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤组。
[0054]“微生物的抗微生物剂敏感性”定义了微生物将受到抗微生物剂影响的可能性。“微生物”是指通常是单细胞生物但可能是多细胞的微生物。通常，微生物引起疾病。“抗微生物剂”是指抑制微生物生长或破坏微生物的化合物。抗微生物剂可以是β-内酰胺类抗生素(例如青霉素和头孢菌素)、大环内酯类(也称为红霉素)、林可酰胺类(例如林可霉素)、氨
基糖苷类(例如庆大霉素)、四环素类(例如四环素)、多肽类(例如万古霉素)、磺胺类(例如磺胺嘧啶)、氟喹诺酮类(如恩诺沙星)和其他药物，包括氯霉素、呋喃妥因和异烟肼。
[0055]
当微生物细胞分裂的速度大于细胞死亡的速度时，微生物就会进行生长，即微生物种群增加。对抗微生物剂敏感的微生物的生长在微生物暴露于抗微生物剂时会减少，这与在不存在抗微生物剂的情况下微生物的生长有关。当抗微生物剂是微生物抑制剂(microstatic)时，它阻止微生物生长，从而防止微生物种群的大小增加。或者，对抗微生物剂敏感的微生物可能会被抗微生物剂破坏，从而使微生物种群缩小。缩小微生物种群的抗微生物剂被称为杀微生物剂。
[0056]
微生物可以是细菌或真菌。因此，该装置可适用于测量细菌的抗生素敏感性或真菌的抗真菌敏感性。“细菌”是指包含细胞壁但缺乏细胞器和有组织的细胞核的微观单细胞生物。“抗生素”是指抑制细菌生长或破坏细菌的化合物。当在本文中使用时，“真菌”是指在其细胞壁中含有几丁质的微观单细胞或多细胞异养真核生物。真菌包括酵母(例如，隐球菌(cryptococcus)、念珠菌(candida))和霉菌(例如，癣、曲霉(aspergillus))并且优选是酵母，即单细胞真菌(例如耳念珠菌(candida auris))。
[0057]
在一个实施方案中，微生物是细菌，因此本发明的装置或系统可适用于测量细菌的抗微生物剂敏感性，并且该装置或系统的第一物质适用于支持细菌生长。当细菌暴露于抗生素时，对抗生素敏感的细菌的生长将减少，这与没有抗生素时细菌的生长有关。当抗生素是抑菌剂时，它会阻止细菌生长，从而防止细菌菌落的大小增加。或者，对抗生素敏感的细菌可能会被抗生素破坏，从而缩小细菌菌落。缩小微生物种群的抗生素被称为杀细菌剂。本发明的装置或系统可适用于将相对于特定微生物的抑细菌抗生素与杀细菌抗生素区分开来。
[0058]
不同微生物物种和微生物菌株的生长可能受到抗微生物剂不同程度的抑制：对相同抗微生物剂的抗微生物剂敏感性可能在不同物种和/或菌株之间变化。或者，物种或菌株可能不受抗微生物剂的影响，从而表明微生物对该抗微生物剂不敏感。
[0059]
术语“微生物菌株”在本文中定义为指物种的遗传变体，即物种的亚类。例如，金黄色葡萄球菌菌株可能是金黄色葡萄球菌物种的特定遗传变体，其由于遗传改变而产生。
[0060]
当微生物繁殖速率大于微生物死亡速率时，微生物就会生长，即微生物种群增加。真菌可以通过二元细胞分裂、细胞出芽、无性孢子形成或菌丝破碎来繁殖。细菌通过细胞分裂来繁殖。在细胞分裂过程中，细胞通过二元裂变分裂成两个子细胞。这两个子细胞可能与原始细胞在遗传上相同或不同，这取决于遗传突变的发生。在没有抗微生物剂的情况下，在存在微生物生存所必需的营养物质的情况下，微生物的生长可能呈指数级增长。
[0061]
如上所述，根据本发明的装置的第一物质适用于电导并支持微生物生长。在一个实施方案中，第一物质粘附(即粘附)到电极上。“粘附”是指第一物质在合理的运动(例如电极的位移或旋转)上保持与电极接触。这意味着该装置可以在使用前预先成型和/或运输，而第一物质无需失去与电极的接触。如上所述，第一物质是凝胶、泡沫或固体。“凝胶”在本文中用于指分散在固体介质中的液体颗粒。凝胶与液体的不同之处在于它们在稳定状态下不流动，即除非受到干扰，否则它们不会流动。“泡沫”在本文中用于指捕获在液体或固体中的气穴。有时，泡沫是被困在固体中的气体。在某些实施方案中，第一物质不是液体。优选地，第一物质是凝胶。在一个实施方案中，第一物质包含水凝胶。
[0062]
水凝胶越来越多地在生物传感器应用中得到使用，从具有抗生素控制释放的伤口敷料(tavakoli,j.,tang,y.,2017.mater.sci.eng.c.mater.biol.appl.77,318-325),用于植入生物电子元件的细胞刺激器(han,l.,lu,x.,wang,m.,gan,d.,deng,w.,wang,k.,fang,l.,liu,k.,chan,c.w.,tang,y.,weng,l.t.,yuan,h.,2017.small.13)到超级电容器电极系统(chen,s.,duan,j.,tang,y.,zhang qiao,s.,2013.chemistry.19,7118-7124)等。水凝胶是高分子聚合物凝胶，由交联的聚合物链网络组成。水凝胶在生物传感器应用中具有许多吸引人的优势，包括它们对生物过程的惰性、缺乏降解、对代谢物的渗透性、生物相容性、耐高温的能力以及它们不被人体吸收(michalek,j.,hobzova,r.,pradny,m.,duskova,m.,2010.biomedical applications of hydrogels handbook.,303-316)。有时，第一物质的水凝胶包含多糖。如果存在，多糖的量有时为约0.5至约5wt％，例如约0.5至约3wt％，或约1wt％。有时，多糖包含二糖的重复单元。二糖可以包含d-半乳糖和/或3,6-脱水-l-吡喃半乳糖。有时，二糖包含d-半乳糖和3,6-脱水-l-吡喃半乳糖，即二糖是琼脂二糖。水凝胶可以包含琼脂糖，由于其紫外线透明性和低毒性，它适合用作水凝胶(science direct，2019)。
[0063]
琼脂糖通常从红海藻或红藻中提取(jeppsson,j.o.,laurell,c.b.,franzen,b.,1979.clin.chem.25,629-638)，并且经常用于分子生物学，特别是电泳中，以分离大分子，例如dna。它是琼脂的两种主要成分之一，并且可以通过去除琼脂胶从琼脂中纯化。琼脂糖是制备凝胶的合适材料，因为它形成了包含孔的网络，孔的大小取决于所用的琼脂糖浓度。这种凝胶的多孔性及其易于生产使其成为监测细菌随时间生长的合适方法，因为琼脂糖凝胶可以填充有抑制或促进细菌生长所需的相关抗生素/营养素。
[0064]
琼脂糖在溶液中以相对低浓度的凝胶形式表现最佳，例如，1wt％的凝胶通常用于在电泳期间提供大dna片段的良好分离和分辨率(sabath,l.d.,garner,c.,wilcox,c.,finland,m.,1976.antimicrobial agents and chemotherapy.9,962-969)。
[0065]
第一物质可以包含含有支持微生物生长所需的营养物质，例如，碳源的生长培养基。当微生物是真菌时，通常使用真菌培养基，其包含例如右旋糖和大豆产品。当微生物是细菌时，可以使用溶原肉汤(lb)培养基，也称为miller lb。这是通常用于细菌生长的营养丰富的培养基，其包含氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物和去离子水。胰蛋白胨提供肽和酪蛋白胨，而酵母提取物提供维生素和微量元素。lb在本领域中是众所周知的，并且可从例如sigma aldrich商购获得。其他合适的细菌/微生物生长培养基对于本领域的读者来说是已知的并且可以用于本发明中(参见例如j.overmann等人，annu.rev.microbiol.,71,711-730)。
[0066]
本发明的装置/系统的第一物质适用于电导。在一个实施方案中，第一物质包括电解质。电解质是当溶解在极性溶剂(例如水)中时产生导电溶液的物质。电解质是盐，其在溶解时，分离成其成分阳离子和阴离子。在存在电极系统的情况下，并在施加电势时，电解质的阳离子被吸引到充当阳极(即具有过剩电子)的电极上，而电解质的阴离子被吸引到充当阴极(即具有缺乏电子)的电极上。由此产生的离子运动产生电流。
[0067]
第一物质的合适电解质包含金属阳离子(例如碱金属或碱土金属阳离子)和抗衡离子。有时，抗衡离子选自卤化物、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、氧化物、乳酸盐、葡乳醛酸盐(glubionate)、天冬氨酸盐和吡啶甲酸盐中的
任何一种或组合。通常，抗衡离子选自卤化物、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐和硝酸盐中的任何一种或组合。通常，抗衡离子是卤化物，优选氯化物。
[0068]
通常，第一物质的电解质的金属阳离子选自钾、钠、镁、钙、锌和铬的任何一种或组合。通常，金属阳离子选自钾、钠、镁和钙中的任何一种或组合，优选钾。最常见的是，第一物质的电解质是氯化钾。
[0069]
熟练的读者知道生长培养基通常含有电解质，例如氯化钠或氯化钾，因此在一个实施方案中，第一物质的生长培养基包含一种或多种合适的电解质并且可能不需要另外的电解质。
[0070]
在一个实施方案中，本发明的装置/系统的第一物质包括氧化还原介体。氧化还原介体是在氧化物质和还原物质之间充当电子穿梭的化学化合物。过渡金属盐或亚甲蓝是合适的氧化还原介体。通常，过渡金属盐的过渡金属选自铁、铱、钌、铬、钒、铈、钴、锇和锰中的任何一种或组合。通常，过渡金属不是金属的组合。通常，过渡金属选自铁、铱或钌中的任何一种。当过渡金属铁为铁时，其常为ⅲ或ⅱ价氧化态；当过渡金属铁为铱时，其常为iii或iv价氧化态，当过渡金属铁为钌时，其常为ii或iii价氧化态。通常，氧化还原介体选自六氰化铁、氯化铱、氯化六胺钌、亚甲蓝和二茂铁中的任何一种。通常，氧化还原介体是[fe
iii
(cn)6]
3-/[fe
ii
(cn)6]
4-。
[0071]
第一物质中氧化还原介体的浓度范围可为约0.02至约10mm，例如约0.5至约10mm，有时为约0.7至约5mm，例如约1至约2mm。
[0072]
根据特定实施方案，装置/系统的第一物质基本上由凝胶、生长培养基、电解质和氧化还原介体组成。当生长培养基包含电解质时，可以不存在额外的电解质，即第一物质可以基本上由凝胶、生长培养基和氧化还原介体组成。使用术语“基本上由...组成”是指，例如，允许在第一物质中存在额外组分，条件是这些额外组分的量不会使第一物质不能支持微生物生长或导电。因此，应当理解，允许第一物质支持微生物生长或导电的任何组分的存在都包括在内。
[0073]
在进一步的实施方案中，装置/系统的第一物质由凝胶、生长培养基、电解质和氧化还原介体组成。这样的实施方案包括在其形成之后保留在第一物质中的残留溶剂。
[0074]
该装置的第一物质与电极系统接触。任何接触方法都是合适的，但第一物质通常通过浸涂、滴铸或印刷沉积到电极系统上。例如，可以通过浸涂或滴铸将第一物质沉积到电极系统上。当使用水凝胶工作时，沉积方法是需要考虑的重要因素，因为它会影响每次运行的凝胶沉积的可重复性和均匀性。
[0075]
浸涂包括五个阶段：
[0076]
(i)浸没，其中电极系统以恒定速度浸入第一物质的溶液中；
[0077]
(ii)启动，其中电极系统已浸入第一物质的溶液中特定时间，并开始以恒定速度从溶液中移出；
[0078]
(iii)沉积，其中当电极系统从溶液中移出时，第一物质溶液的薄层自身沉积在电极系统上；
[0079]
(iv)排水，其中多余的液体从电极系统的表面排出；和
[0080]
(v)蒸发，其中溶剂(通常水)从第一物质的溶液中蒸发，形成第一物质的薄层。
[0081]
电极系统从第一物质的溶液中移出的速度决定了涂层的厚度(速度越快产生越厚
的涂层)。浸涂是在电极表面产生薄凝胶层(当使用较慢的移出速度时)的有用方法；然而，它需要大体积的材料，使其相对昂贵。
[0082]
相反，滴铸是较简单的方法，其使用确切体积的所需材料，从而降低了所涉及的成本和浪费。滴铸包括将第一物质的溶液滴到电极系统上并蒸发溶剂(通常是水)。简单的滴铸方法是使用特定体积吸取凝胶。优选地，第一物质通过滴铸与电极系统接触。
[0083]
在某些实施方案中，装置/系统处于受控环境中，通过其意味着它在合适的条件下被储存和/或使用。为了避免污染，例如被不想要的微生物污染，所述装置/系统可以在受控环境中储存和/或使用。例如，在一个实施方案中，该装置/系统被密封以防止来自周围大气的污染。密封件可以是重复使用的并且可以是该装置/系统的一部分。或者，密封件可以是一次性的。有利地，当第一溶液是凝胶或泡沫时，密封装置/系统防止凝胶或泡沫变干并延长装置/系统的保质期。
[0084]
在一些实施方案中，第一物质被密封以隔绝大气。这种密封可以随着时间增加第一物质完整性的保持。例如，将第一物质密封以隔绝大气可以增加第一物质随时间的形状和稠度的保持。不受理论的束缚，将第一物质封装在较小的体积内允许系统快速达到饱和(冷凝和蒸发速率变得相等)，从而使第一物质暴露于一致的水分水平，有效地使第一物质的净蒸发为零。在一些实施方案中，第一物质用盖子密封以隔绝大气，例如透明盖子，例如丙烯酸盖。在特定实施方案中，第一物质被封装在板中，例如透明板，并且用盖子(例如透明盖)密封以隔绝大气。在一些实施方案中，板和盖是丙烯酸的。为避免疑义，当第一物质与至少一种抗微生物剂和/或至少一种微生物(包括怀疑包含微生物的样品)接触时，所述第一物质和至少一种抗微生物剂和/或至少一种微生物可以密封以隔绝大气。
[0085]
在一个实施方案中，本发明的装置/系统还包含与第一物质接触的至少一种抗微生物剂。本发明的装置/系统适用于评估微生物对任何抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。当微生物为细菌时，所述装置/系统适用于测量细菌对任何抗生素的抗生素敏感性。有时，抗生素是选自阿莫西林、苯唑西林、甲氧西林、氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、链霉素、羧苄青霉素、呋喃妥因、甲氧苄啶、环丙沙星、替莫西林、氧氟沙星、头孢氨苄、复合阿莫西林-克拉维酸或庆大霉素的任何一种或组合。例如，抗生素可以是选自阿莫西林、苯唑西林、甲氧西林、氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、链霉素和羧苄青霉素中的任何一种或组合。有时，抗生素包含β-内酰胺环和/或酰氨基。抗生素可以是选自阿莫西林和苯唑西林中的任何一种或组合。有时，抗生素是一种类型的抗生素。然而，抗生素的组合有时比单独的抗生素更有效地治疗细菌感染。该装置/系统可用于测量细菌对抗生素组合的抗生素敏感性，并且不受可构成这种组合的不同抗生素的数量限制。
[0086]
为避免疑义，本文使用“测量”是指定性或定量检测。例如，本发明的装置/系统适用于定性检测微生物的抗微生物剂敏感性。所述装置/系统可用于评估微生物是否对抗微生物剂敏感。本发明的装置/系统还适用于定量检测微生物的抗微生物剂敏感性。例如，所述装置/系统可用于评估微生物对抗微生物剂的敏感性程度，例如微生物生长速率的降低或微生物细胞死亡的速率。
[0087]
本发明的装置/系统包含电极系统，所述电极系统包含两个或多个电极和适合电导并支持微生物生长的第一物质，其中所述第一物质与电极系统的电极接触。
[0088]
电极系统可以是适合于跨第一物质施加电势差的任何系统。为了提供电位差，电
极系统包含最少两个电极。工作电极将所需的电势施加到第一物质并将电荷传输到(从而充当阳极并还原分析物)第一物质或从(从而充当阴极并氧化分析物)第一物质传输。需要具有已知电势的第二个电极，将所述第二个电极用作参考，并完成电路并平衡电荷，即如果工作电极充当阳极并还原分析物，则第二个电极通过氧化第一物质的组分平衡电荷，从而充当阴极。第二个电极既充当参考电极又充当对电极。
[0089]
通常，电极系统包含2到4个电极，通常是3或4个。通常，电极系统包含3个电极。当电极系统包含3个电极时，它包含工作电极、参考电极(具有已知电势并用作参考)和对电极(以完成电路并平衡电荷)。在这样的电极系统中，工作电极处的电位差变化独立于对电极处的电位差变化进行测量。这种设置优于2电极系统，因为对电响应的分析更简单。
[0090]
当电极系统包含4个电极时，它包括工作电极、参考电极、对电极和工作感应电极。在这种设置中，电位差是在工作感应电极(相对于参考电极)处测量的，并且与工作电极处发生的电化学反应无关，即施加的电流对第一物质本身的影响被测量。这样的设置对于测量第一物质的阻抗是有用的(下面讨论)。
[0091]
电极系统的电极可以由适合传导电子的任何材料制成。优选地所述材料是耐腐蚀的，并且能够传导合适的电流负载。有时，所需的电流负载在
±
1na至
±
1ma；
±
10na至
±
0.1ma；或
±
100na至
±
0.01ma(误差为
±
1％)的范围内。合适的材料包括选自由金、银、铂、钯、钛、石墨、碳、黄铜、钨、钌、铱、钛、镍、铝、锡的任何一种或一组，或其氧化物的一种或一组。通常，系统的电极由金、银、铂、钯、钛、石墨和碳中的任何一种或一组制成。通常，电极由金、银、铂和钯的任何一种或一组制成，优选金和银。通常，电极由一种类型的材料制成，即它们不是由一组材料制成。
[0092]
电极系统可以通过添加剂印刷工艺生产，例如3d印刷或丝网印刷。这些是用于生产具有成本效益的电极系统和传感器的合适方法(tan,c.,nasir,m.z.m.,ambrosi,a.,pumera,m.,2017.anal.chem.89,8995-9001)。电极系统可以是微制造的并且可以通过沉积所需材料、用所需微特征图案化材料(例如通过uv光刻)以及如果需要去除或蚀刻材料来生产。优选地，电极系统是丝网印刷的。与更传统的电极相比，丝网印刷电极(spe)具有许多优点，例如易于制造和清洁程序、可靠性、低成本、可重复性和快速获得结果。spe适合大规模生产，与传统的大电极或微电极相比，可以以相对较低的成本生产大量电极(hayat,a.,marty,j.l.,2014.sensors.14,10432-10453)。由于这些优势，spe使得自身非常适合原型设计和新型传感技术的开发，如本文所报道。
[0093]
从第三方面来看，本发明提供了所述装置用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途。通常，微生物是细菌，并且本发明的第三方面涉及用于测量细菌的抗生素敏感性的装置的用途。该装置适用于评估任何细菌的抗生素敏感性，即细菌的任何种类和/或菌株。这优于方法，例如遗传方法，其中必须设计特定的dna探针来检测特定的生物体。通常，所用细菌的种类和/或菌株的身份是未知的。细菌的种类或菌株可能属于terrabacteria分类群。有时，细菌的种类或菌株是革兰氏阳性的，即细菌具有相对厚的肽聚糖层。所述种类或菌株可能属于厚壁菌(firmicutes)门和芽孢杆菌纲(bacilli class)。有时，该种类或菌株属于芽孢杆菌目，有时属于葡萄球菌科(staphylococcaceae)，有时属于葡萄球菌属。有时，细菌的所述菌株属于金黄色葡萄球菌(s.aureus)种。
[0094]
相反，本发明的装置可用于筛选对特定抗微生物剂敏感的那些的微生物。例如，具
有已知抗药性分布的已知微生物种类和/或菌株可以与装置的第一物质接触。然后可以在第一物质和已知微生物与抗微生物剂接触时测量已知微生物对抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。
[0095]
金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球状细菌，其发现于上呼吸道和皮肤上(taylor,t.a.,unakal,c.g.,2019.statpearls,treasure island publishing)。金黄色葡萄球菌可引起皮肤感染、呼吸道疾病和食物中毒(tong,s.y.c.,david,j.s.,eichenberger,e.,holland,t.l.,fowler jr,v.g.,2015.clin.microbiol.rev.28,603-661)。金黄色葡萄球菌是研究耐抗生素菌株出现的有用细菌，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)是临床上的常见问题(harkins,c.p.,pichon,b.,doumith,m.,parkhill,j.,westh,h.,tomasz,a.,de lencastre,h.,bentley,s.d.,kearns,a.m.,holden,m.t.g.,2017.genome.biol.18,130)。有用的生物传感器应该能够区分金黄色葡萄球菌的易感菌株和抗性菌株，目的是尽可能快地为患者提供正确的治疗。
[0096]
从第四方面来看，本发明提供了包含本发明的装置的系统，所述装置通过电极系统与恒电位仪电连接。电子连接可以是在恒电位仪和电极系统之间携带电子信号的任何合适的连接。通常，这种电子连接是电线。电极系统的每个电极都与恒电位仪电连接，以允许对每个电极施加和检测电信号并从每个电极施加和检测电信号。
[0097]
所述系统的恒电位仪至少适用于eis测量。优选地，系统的恒电位仪适用于至少eis和dpv测量。有时，系统的恒电位仪适用于至少eis、dpv、循环伏安法和开路电位法测量。像这样，恒电位仪能够分析作为测试频率函数的电阻抗，即恒电位仪包含阻抗分析仪。或者，阻抗分析仪可以与恒电位仪分开使用以进行eis测量。在一些实施方案中，系统的恒电位仪适用于方波伏安法(swv)和计时电流法测量。因此，在一些实施方案中，系统的恒电位仪适用于至少eis、dpv、循环伏安法、开路电位法、swv和计时电流法测量。
[0098]
eis能够实时捕获数据。使用跨频率范围的交变电势差来研究电极-第一物质界面的阻抗，以建立有关界面、其电子转移特性和周围扩散行为的信息。本文使用的术语“阻抗”是第一物质对电路电流的频率依赖性电阻的量度，并根据下式计算，其中e
ω
等于频率依赖性电势并且i
ω
等于频率依赖性电流。
[0099][0100]
阻抗的变化反映了微生物生长作为时间函数的变化：随着代谢率和微生物种群的增加，第一物质对电流的频率依赖性电阻(即阻抗)增加。不受理论束缚，随着微生物生长和代谢第一物质内的成分，第一物质中带电物质的平衡发生变化。因此，随时间测量阻抗给出了微生物生长速率的指示。
[0101]
dpv可用于灵敏地研究进出电极表面的电子转移。在工作电极和参考电极之间测量电势，而测量在工作电极和对电极之间的电流。电势随时间线性升高或降低至设定电势(电势线性扫描)，或随时间递增或递减(阶梯波形)。阶梯波形是优选的。一系列规则的电压脉冲叠加在电势线性扫描或阶梯波形上。在电压脉冲之前(初始电流)和之后(最终电流)测量电流，并将最终电流和初始电流之间的差异绘制为所施加电势的函数。这样，非法拉第充电电流的影响被最小化，即仅测量法拉第电流(由第一物质的组分还原或氧化产生的电流)，从而可以更精确地分析电子转移。
[0102]
在dpv图中测量的峰值电流(i
pk
)对应于第一溶液的组分氧化时产生的电流。它取决于第一溶液的电阻。因此，峰值电流的变化反映了微生物生长作为时间函数的变化：随着微生物种群的增加，峰值电流减小。因此，随着时间的推移测量峰值电流可以指出微生物生长的速率的指示。
[0103]
第五方面涉及本发明的系统用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途。本领域技术人员将认识到，与本发明第三方面的微生物相关的实施方案和特征也适用于本发明的第五方面。例如，本发明第五方面的微生物可以是细菌，例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，例如金黄色葡萄球菌(s.aureus)。
[0104]
本发明的装置/系统可用于测试多种抗微生物剂，并且以这种方式可以为每种待测试的抗微生物剂提供单独的电极系统。以这种方式，本发明可以提供本发明的装置库(每个装置包含单独的抗微生物剂或抗微生物剂的组合，以及缺少抗微生物剂的装置)和电连接到装置的电极系统的电极的恒电位仪。
[0105]
本领域技术人员将认识到，与本发明第四方面的电子连接相关的实施方案和特征也应用于本发明的其他方面和实施方案。例如，第五方面的电子连接可以是任何适合在恒电位仪和电极系统之间携带电子信号的电子连接。所述库的装置可用于评估微生物对不同抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。
[0106]
方便地，库的至少一个装置可以用于测量背景电响应、第一对照电响应和第二对照电响应(参见下文以进一步讨论背景和控制电响应)。
[0107]
本发明的第一方面提供了测量微生物生长的方法，其包括：
[0108]
(i)使本发明的装置或系统与至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂以及怀疑包含或已知包含微生物的样品接触；
[0109]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0110]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的电响应；
[0111]
其中至少第一和第二时间点之间的电响应差异指示微生物生长。
[0112]
在一些实施方案中，本发明的装置或系统与至少一种抗微生物剂和怀疑包含微生物的样品接触。
[0113]
本领域技术人员将认识到，与本发明的第二至第五方面的第一物质、抗微生物剂、微生物和电极系统相关的实施方案和特征也应用于本发明的其他方面。
[0114]
抗微生物剂和微生物可以通过任何合适的方式与第一物质接触。有时，所述至少一种抗微生物剂在与微生物接触之前与第一物质接触。有时，包含至少一种抗微生物剂的溶液与第一物质接触。该溶液可以是水溶液。可以将包含至少一种抗微生物剂的溶液例如吸移、滴落、流动等到第一物质上。
[0115]
在第一物质与至少一种抗微生物剂接触之后，包含微生物的溶液同样可以与第一物质接触。所述溶液可以是水性的并且可以包含微生物生长培养基。当微生物是细菌时，包含细菌和lb培养基的水溶液可以直接移液到第一物质上。
[0116]
施加到电极系统的电信号类型取决于要进行的测量(例如eis或dpv)。如上所述，eis可用于测量第一溶液的阻抗，并使用跨一系列频率的交变电势进行研究。因此，有时施加到电极系统上的电信号是交变电势。有时交变电势的频率在大约150hz到大约0.05hz的范围内。有时，大约120hz到大约0.07hz或大约100hz到0.1hz。交变电势的波形幅度有时为
约20至约5mv rms，其他时间为15至约7mv rms，或约10mv rms。
[0117]
dpv可用于测量进出工作电极表面的电子转移。如上所述，电势随时间线性增加至设定电势(电势线性扫描)，或随时间递增(阶梯波形)。一系列规则的电压脉冲叠加在电势线性扫描或阶梯波形上。因此，有时施加到电极系统的电信号是叠加在电位线性扫描或阶梯波形上的一系列规则的电压脉冲，施加的电势范围约为-1.0v至1.0v。其他时候，施加的电势在约-0.5v至0.7v或约-0.3v至0.5v的范围内。
[0118]
在一个实施方案中，电刺激包含施加在工作电极和参考电极之间的电势，并且电响应由工作电极和对电极之间的电流组成。从电极系统检测到的电响应类型取决于测量是eis还是dpv。如果测量是eis，则检测到的电响应是交流电(ac)。因此，当测量eis时，施加的电信号是交变电势，而电响应是ac。如果测量是dpv，则电响应是直流电(dc)。在电压脉冲之前(初始电流)和之后(最终电流)测量电流。因此，当测量dpv时，施加的电信号是叠加在电势线性扫描或阶梯波形上的一系列规则电压脉冲，而电响应是在电压脉冲之前和之后测量的直流电。
[0119]
如本文所定义，时间点等于向电极施加电刺激并且从电极感应电响应的时间。第一时间点可以是从微生物和抗微生物剂与第一物质接触开始的任何时间。例如，第一时间点可以是在微生物和抗微生物剂与第一物质接触之后0至150分钟。所述至少第二时间点在第一时间点之后收集，例如第二时间点可以在第一时间点之后几天或几小时收集。在一个实施方案中，第二时间点在第一时间点后1至150分钟，例如1至60分钟、1至40分钟或1至30分钟收集。
[0120]
本领域技术人员知道可以对电极施加电刺激并且可以在多于两个时间点从电极感应电响应。本领域技术人员还知道收集更多时间点导致微生物生长的更大确定性。可以在第一时间点和至少第二时间点之间的任何时间间隔收集多于两个时间点。所述至少第二时间点在本文中定义为最终时间点。
[0121]
在本发明的系统包含两个或多个装置的情况下，所述两个或多个装置可用于测量怀疑包含微生物的样品对两种或多种不同抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。或者，两个或多个装置可用于测量怀疑包含微生物的样品对两种或多种不同剂量的相同抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。剂量可以在1ng/ml到100mg/ml，例如0.5μg/ml到0.5mg/ml、1μg/ml到100μg/ml、4μg/ml到70μg/ml、6μg/ml至60μg/ml或8μg/ml至50μg/ml的范围内。
[0122]
在本发明的系统包含四个或多个装置的情况下，两个或多个装置可以用于测量怀疑包含微生物的样品对两种或多种不同的抗微生物剂的抗微生物剂敏感性，并且两个或多个装置可以用于测量怀疑包含微生物的样品对两种或多种不同剂量的相同抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。
[0123]
相反，在本发明的系统包含两个或多个装置的情况下，所述两个或多个装置可用于筛选对特定抗微生物剂敏感的那些微生物。例如，可以使至少两种已知的微生物种类和/或菌株与两个或多个装置的第一物质接触。然后可以在第一物质和已知微生物与抗微生物剂接触时测量不同已知微生物对抗微生物剂或候选抗微生物剂的抗微生物剂敏感性。
[0124]
从易感微生物和抗性微生物记录的电响应之间的差异可能在同一时间点表现出来。在同一时间点收集的频率分布中，微生物的响应之间可能存在一致的差异模式。例如，当电刺激包含交变电势时，一种特定频率的电刺激可以产生来自彼此不同的易感或抗性微
生物的电响应。
[0125]
在一个实施方案中，本发明的方法另外包括测量背景电响应。这包括：
[0126]
(i)使本发明的装置或系统与至少一种抗微生物剂接触；
[0127]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0128]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的背景电响应；
[0129]
其中至少第一和第二时间点之间的背景电响应的差异是背景信号。
[0130]
背景电响应是在没有微生物的情况下系统的电响应。“不存在”是指其中没有微生物已与第一物质有意接触的情况。因此，应在系统的第一物质与微生物接触之前测量背景电响应。或者，在本发明的系统包含本发明的两个或多个装置的情况下，一个这样的装置可以用于测量微生物生长，而另一个可以用于测量响应于添加虚拟样品或已知不含微生物的临床样品的背景信号。
[0131]
可以从电响应中减去背景电响应。如果用于测量背景电响应的时间段与用于测量电响应的那些时间段相同，则可以从每个测量的时间段的电响应中减去背景电响应。从电响应中减去背景响应允许由微生物生长引起的电响应的任何变化从系统的背景电响应中脱颖而出。
[0132]
在另一个实施方案中，本发明的方法另外包括测量第一对照电响应。这包括：
[0133]
(i)使本发明的装置或系统与怀疑包含微生物的样品接触；
[0134]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0135]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的第一对照电响应；
[0136]
其中至少第一和第二时间点之间的第一对照电响应的差异是第一对照信号。
[0137]
第一对照电响应是在存在微生物和不存在抗微生物剂的情况下系统的电响应，即没有抗微生物剂已经有意与第一物质接触的情况。第一个对照电响应的目的是质量控制，以检查微生物生长在系统设置上是否可能(即第一物质被正确设置用于微生物生长)并确保微生物生长导致可检测的电响应(即电极系统和恒电位仪设置正确)。阳性的第一对照电响应给出同一批次的装置处于工作状态的指示。
[0138]
在本发明的系统包含本发明的两个或多个装置的情况下，一个这样的装置可以用于测量微生物生长而另一个可以用于测量第一对照信号。除了质量控制之外，第一对照信号可用于评估哪些数据给出了微生物生长的更大确定性。如果怀疑包含微生物的样品中存在微生物，则它们的浓度可能是未知的。通常，受感染的伤口包含大约500,000个微生物/ml。理论上，较高浓度的微生物导致由微生物生长引起的电信号的更大变化(更多的微生物代谢第一物质的成分，导致带电物质的平衡发生更大的变化)，其进而导致来自所收集数据的生长的更大确定性。在微生物浓度低的地方，微生物生长导致的电信号变化可能很弱，导致收集的数据中的不确定性。
[0139]
第一对照信号可用于给出确定时间点的指示，在所述确定时间点上电信号变化足以确定微生物生长，例如电信号变化大于背景信号标准差3倍的时间点。从用于在大于确定时间点的时间点测量微生物生长的装置收集的数据提供了对微生物的抗微生物剂敏感性的准确测量。
[0140]
本领域技术人员知道本发明的装置/系统可用于测量怀疑包含微生物的样品的抗微生物剂敏感性，其中怀疑包含微生物的样品中的微生物处于任何浓度。较低的微生物浓
度可能导致在较长时间段内收集数据，即，至少第二时间点可能在第一时间点之后大于150分钟，而较高的微生物浓度可能导致更快地测量抗微生物剂敏感性。
[0141]
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用至少一个装置来测量微生物生长，使用至少一个装置来测量第一对照电响应和比较所述至少两个装置的电响应。
[0142]
在本发明的系统包含本发明的三个或多个装置的情况下，一个这样的装置可用于测量微生物生长，第二个装置可用于测量第一对照信号，而第三个装置可用于测量背景信号。
[0143]
因此，在另一个实施方案中，本发明的方法包括使用至少一个装置来测量微生物生长，使用至少一个装置来测量第一对照电响应，使用至少一个装置来测量背景信号，并比较所述至少三个装置的电响应。
[0144]
有时，测量第一个对照电响应并将其从电响应中减去。这允许由抗微生物剂敏感性引起的电响应的任何变化以从系统的第一个对照电响应中脱颖而出。本领域技术人员知道，除了减法技术之外或代替减法技术的其他分析技术可用于分析电响应。其他分析技术包括主成分分析和机器学习算法。
[0145]
在另一个实施方案中，第一方面的方法还包括测量第二对照电响应，其包括：
[0146]
(i)使本发明的装置或系统与至少一种抗微生物剂和已知对所述至少一种抗微生物剂敏感的微生物接触；
[0147]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0148]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的第二对照电响应；
[0149]
其中，所述至少第一和第二时间点之间的第二对照电响应的差异是第二对照信号。
[0150]
第二对照电响应是在存在至少一种抗微生物剂和已知对所述至少一种抗微生物剂敏感的微生物的情况下系统的电响应，即其中预期微生物生长被抑制的情况。第二对照电响应用于质量控制目的，并检查微生物生长的抑制在系统设置上是否可检测到。阳性的第二对照电响应给出了同一批次的装置处于工作状态的指示。
[0151]
在本发明的系统包含本发明四个或多个装置的情况下，一个这样的装置可以用于测量微生物生长，第二个装置可以用于测量第一对照信号，第三个装置可以用于测量背景信号，并且第四个装置可以用来测量第二对照信号。
[0152]
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用至少一个装置来测量微生物生长、第一对照信号、背景信号和/或第二对照信号。
[0153]
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用至少一个装置来测量微生物生长，使用至少一个装置来测量第一对照信号，使用至少一个装置来测量背景信号，使用至少一个装置来测量第二对照信号并比较所述至少四个装置的电响应。
[0154]
尽管本说明书的大部分内容针对用于检测微生物生长以确定微生物的抗微生物剂敏感性的装置或系统，但本领域技术人员知道本发明的相同装置或系统可用于检测微生物以确定物质的抗微生物特性。例如，可以测试具有未知抗微生物特性的提取物或候选抗微生物剂其抑制一种或多种微生物生长的能力。在实施方案中，所述一种或多种微生物可以是一种或多种革兰氏阳性细菌和/或一种或多种革兰氏阴性细菌。
[0155]
因此，在一个具体方面，本发明提供了测量微生物生长的方法，包括：
[0156]
(i)使本发明的装置或系统与至少一种微生物和怀疑包含抗微生物剂的样品接触；
[0157]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0158]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的电响应；
[0159]
其中所述至少第一和第二时间点之间的电响应差异指示微生物生长。
[0160]
本领域技术人员知道，如在第一方面，该方法可以另外包括测量背景电响应、第一对照电响应和/或第二对照电响应。在测量背景响应的情况下，将至少一种抗微生物剂替换为怀疑包含抗微生物剂的样品；并且在测量第一对照电响应的情况下，将怀疑包含微生物的样品替换为至少一种微生物。
[0161]
从第六方面来看，本发明提供了试剂盒，包括：
[0162]
(i)本发明的至少一个装置或系统；和
[0163]
(ii)至少一种抗微生物剂。
[0164]
试剂盒可包含多于一个本发明的装置或系统和多于一种类型的抗微生物剂。
[0165]
根据本发明的第六方面，装置或系统的第一物质不与至少一种抗微生物剂接触并且可以被试剂盒的使用者接触。本领域技术人员知道，本发明的一个或多个装置或系统可以提供给用户，其中一种或多种抗微生物剂预加载到第一物质上，即一种或多种抗微生物剂可以与一个或多个装置或系统的第一物质接触。例如，该试剂盒可以包含装置阵列，每个装置都预装有对某种微生物特异的一种或多种抗微生物剂。可以将装置阵列组织成感染类型，使得包含已知对某种感染类型的微生物有效的一种或多种抗微生物剂的装置分组在一起。例如，可以将包含已知对尿路感染有效的一种或多种抗微生物剂的装置分组在一起，同时可以将包含已知对皮肤感染有效的抗微生物剂的那些装置分组在一起，与其他装置分开。
[0166]
与本发明第一至第五方面的装置、抗微生物剂、恒电位仪、电触点和微生物有关的实施方案和特征也适用于本发明的第六方面。
[0167]
所述装置的第一物质可以通过接触电解质和适合微生物生长的凝胶来形成。第一物质还可包含氧化还原介体。因此，第一物质可以通过接触电解质、适合支持微生物生长的凝胶和氧化还原介体来形成。这些组分可以任何顺序接触。
[0168]
适用于支持微生物生长的氧化还原介体、电解质和凝胶可以在室温下接触以形成初始物质。有时，在添加至少一种抗微生物剂之前，将初始物质加热至约50至约150℃的温度。在添加至少一种抗微生物剂之前，可将初始物质加热至约70至约140℃，有时约110至约130℃的温度。
[0169]
加热之后，可以在添加至少一种抗微生物剂之前冷却初始物质。这避免了所述至少一种抗微生物剂的失活。有时，将初始物质冷却至约20至约50℃的温度，例如20至40℃。第一物质可以在与电极系统接触和形成装置之前重新熔化。为了防止初始物质的粘稠度发生任何变化，可以在使用前将所述装置储存在受控环境中，例如密封容器中。所述至少一种抗微生物剂可以与装置的第一物质接触并在第一物质与微生物接触之前储存。为了防止第一物质的粘稠度发生任何变化和/或抗微生物剂降解，该装置一旦与至少一种抗微生物剂接触，就可以储存在受控环境中，例如密封容器中。
[0170]
在添加微生物之前，可以将第一物质在37℃稳定5至30分钟，有时5至20分钟，例如
10分钟。该装置可以，在湿度室和培养箱内37℃的受控环境中使用过程中密封。
[0171]
此处对文件、行为、材料、装置、文章等的任何讨论均不被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或者是与本技术的每个权利要求的优先权日期之前存在的与本公开相关的领域中的公知常识。
[0172]
本领域技术人员将理解，可以对如本文所述的本发明进行多种变型和/或修改，而不背离所描述的本发明的范围。因此，本实施方案被认为是出于描述目的而不是限制性的，并且不限于实施方案中描述的范围。本领域技术人员应当理解，本实施方案可以单独阅读，也可以组合阅读，并且可以与本文所述的任何一个特征或特征的组合相结合。
[0173]
本文引用的每篇专利和非专利文献参考文献的主题均通过引用整体并入本文。
[0174]
在以下条款中进一步描述本发明的方面和实施方案：
[0175]
1.测量微生物的抗微生物剂敏感性的方法，包括：
[0176]
(i)使装置或系统与至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂以及怀疑包含或已知包含微生物的样品接触，其中所述装置包含：
[0177]
(a)包含两个或多个电极的电极系统；和
[0178]
(b)与两个或多个电极接触的第一物质，其中所述第一物质为凝胶、泡沫或固体的形式，其适用于电导并且能够支持微生物生长；
[0179]
并且该系统包含：
[0180]
(a)一个或多个装置；和
[0181]
(b)恒电位仪，
[0182]
其中电极系统的电极与恒电位仪电连接；
[0183]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0184]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的电响应；
[0185]
其中所述至少第一和第二时间点之间的电响应差异指示微生物生长。
[0186]
2.条款1的方法，其中所述第一物质粘附到所述电极上。
[0187]
3.条款1或条款2的方法，其中所述第一物质包含凝胶。
[0188]
4.条款3的方法，其中所述凝胶是水凝胶。
[0189]
5.条款4的方法，其中所述水凝胶可从藻类，如红藻获得。
[0190]
6.条款4或5的方法，其中所述水凝胶包含多糖。
[0191]
7.条款6的方法，其中所述水凝胶包含约0.5至约5wt％、0.5至约3wt％或约1wt％的多糖。
[0192]
8.条款6或7的方法，其中所述多糖是琼脂糖。
[0193]
9.前述条款中任一项的方法，其中所述第一物质包含生长培养基。
[0194]
10.前述条款中任一项所述的方法，其中所述第一物质包含电解质。
[0195]
11.条款10的方法，其中所述电解质包含金属阳离子和抗衡离子。
[0196]
12.条款11的方法，其中所述抗衡离子选自卤化物、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、氧化物、乳酸盐、谷草酸盐、天冬氨酸盐和吡啶甲酸盐中的任何一种或组合。
[0197]
13.条款11的方法，其中所述抗衡离子选自卤化物、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐和硝酸盐中的任何一种或组合。
[0198]
14.条款11至13中任一项的方法，其中所述抗衡离子是卤化物。
[0199]
15.条款12至14中任一项的方法，其中所述卤化物是氯化物。
[0200]
16.条款11至15中任一项的方法，其中所述金属阳离子选自钾、钠、镁、钙、锌和铬中的任何一种或组合。
[0201]
17.条款11至15中任一项的方法，其中所述金属阳离子选自钾、钠、镁和钙中的任何一种或组合。
[0202]
18.条款11至15中任一项的方法，其中所述金属阳离子是钾。
[0203]
19.任何前述条款的方法，其中所述第一物质包含氧化还原介体。
[0204]
20.条款19的方法，其中所述氧化还原介体是金属盐。
[0205]
21.条款20的方法，其中所述金属是铁、铱、钌、铬、钒、铈、钴、锇和锰中的任何一种或一组。
[0206]
22.条款21的方法，其中所述金属盐是铁盐。
[0207]
23.条款22的方法，其中所述铁盐具有iii或ii的氧化态。
[0208]
24.条款19的方法，其中所述氧化还原介体是[fe
iii
(cn)6]
3-/[fe
ii
(cn)6]
4-。
[0209]
25.条款24的方法，其中[fe
iii
(cn)6]
3-和[fe
ii
(cn)6]
4-各自以约0.02至约10mm，约0.5至约10mm，约0.7至约5mm，约1至约2mm或约1mm的浓度存在。
[0210]
26.条款19至25中任一项的方法，其中所述第一物质基本上由凝胶、生长培养基、电解质和氧化还原介体组成。
[0211]
27.条款19至25中任一项的方法，其中所述第一物质由凝胶、生长培养基、电解质和氧化还原介体组成。
[0212]
28.前述条款中任一项的方法，其中所述第一物质通过沉积与所述电极系统的电极接触。
[0213]
29.条款28的方法，其中所述沉积是通过浸涂、滴铸或印刷。
[0214]
30.条款27的方法，其中所述沉积是通过滴铸。
[0215]
31.前述条款中任一项的方法，其中所述装置处于受控环境中。
[0216]
32.条款31的方法，其中所述装置是密封的。
[0217]
33.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一物质被密封以隔绝大气。
[0218]
34.前述条款中任一项的方法，其中所述电极系统包含由金属(例如铂、金、银)或导电材料(例如碳)制成的工作电极、参考电极和对电极。
[0219]
35.条款39的方法，其中所述工作电极和对电极是金并且所述参考电极是银。
[0220]
36.前述条款中任一项的方法，其中，所述电极系统是丝网印刷的。
[0221]
37.前述条款中任一项的方法，其中所述恒电位仪适用于电化学阻抗谱测量和/或差分脉冲伏安法。
[0222]
38.前述条款中任一项的方法，其中所述装置还包含与所述第一物质接触的至少一种抗微生物剂。
[0223]
39.条款38的方法，其中所述至少一种抗微生物剂是抗生素。
[0224]
40.条款39的方法，其中所述抗生素是选自阿莫西林、苯唑西林、甲氧西林、氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、链霉素、羧苄青霉素、呋喃妥因、甲氧苄啶、环丙沙星、替莫西林、氧氟沙星、头孢氨苄、复合阿莫西林-克拉维酸或庆大霉素的任何一种或组合。
[0225]
41.条款39或40的方法，其中所述抗生素包含β-内酰胺环和/或酰氨基。
[0226]
42.条款39的方法，其中所述抗生素是选自阿莫西林和苯唑西林的任何一种或组合。
[0227]
43.条款39至42中任一项的方法，其中所述抗生素是一种类型的抗生素。
[0228]
44.前述条款中任一项的方法，其中所述电刺激是电势并且所述电响应是电流。
[0229]
45.条款44的方法，其中所述电势在大约-1.0v到1.0v；-0.5v至0.7v；或-0.3v至0.5v的范围之间。
[0230]
46.条款45的方法，其中电势从范围的较低值逐渐增加到范围的较高值，或从范围的较高值逐渐减小到范围的较低值。
[0231]
47.条款44至46中任一项的方法，其中所述电势包括一系列规则电压脉冲。
[0232]
48.条款44的方法，其中所述电刺激包含具有约150hz至0.05hz；120hz至0.07hz；或100hz至0.1hz的频率范围；约20至5mv rms；15至7mv rms或10mv rms的波形幅度的交变电势并且电响应由交流电组成。
[0233]
49.前述条款中任一项的方法，其中所述方法另外包括测量背景电响应，其包括：
[0234]
(i)使所述装置或系统与至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂接触；
[0235]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0236]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的背景电响应；
[0237]
其中所述至少第一和第二时间点之间的电响应的差异是背景响应。
[0238]
50.条款49的方法，其中所述方法另外包括从所述电响应中减去所述背景电响应。
[0239]
51.前述条款中任一项的方法，其中所述方法还包括测量第一对照电响应，其包括：
[0240]
(i)使所述装置或系统与怀疑包含或已知包含微生物的样品接触；
[0241]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0242]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的第一对照电响应；
[0243]
其中所述至少第一和第二时间点之间的电响应的差异是第一对照响应。
[0244]
52.条款51的方法，其中所述方法另外包括从所述电响应中减去所述对照电响应。
[0245]
53.前述条款中任一项的方法，其中所述方法另外包括测量第二对照电响应，其包括：
[0246]
(i)使所述装置或系统与所述至少一种抗微生物剂和对至少一种抗微生物剂敏感的微生物接触；
[0247]
(ii)至少在第一和第二时间点向电极施加电刺激；和
[0248]
(iii)在至少第一和第二时间点感应来自电极的第二对照电响应；
[0249]
其中所述至少第一和第二时间点之间的电响应的差异是第二对照响应。
[0250]
54.适用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的装置，其中所述装置如条款1至36中任一项所定义并且包含与第一物质接触的至少一种抗微生物剂或候选抗微生物剂。
[0251]
55.条款54的装置，其中所述至少一种抗微生物剂如条款39至43中任一项所定义。
[0252]
56.条款54或条款55的装置用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途。
[0253]
57.适用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的系统，其中所述系统如条款1至37中任一项所定义，并且一个或多个装置中的至少一个包含与第一物质接触的至少一种抗微生
物剂或候选抗微生物剂。
[0254]
58.条款57的系统，其中所述至少一种抗微生物剂如条款39至43中任一项所定义。
[0255]
59.条款57或58的系统用于测量微生物的抗微生物剂敏感性的用途。
[0256]
60.试剂盒，其包含：
[0257]
(i)条款1至37条中任一项所定义的至少一个装置或系统；和
[0258]
(ii)至少一种抗微生物剂。
[0259]
61.条款60的试剂盒，其中所述试剂盒还包含电触点。
[0260]
62.条款60或61的试剂盒，其中所述试剂盒还包含对所述至少一种抗微生物剂敏感的微生物。
实施例
[0261]
本文举例说明的测量抗生素敏感性的方法涉及通过使用基于琼脂糖的水凝胶滴涂来修饰市售的金spe(dropsens au 223bt)以产生灵敏的、可大规模制造的传感器系统，该系统能够确定抗生素对金黄色葡萄球菌和mrsa的有效性。
[0262]
由于mrsa是外科、医院和社区获得性感染的主要原因(coll,f.,harrison,等人,2017.sci.transl.med.9,1-19)，区分抗生素敏感的金黄色葡萄球菌和mrsa已在本文中进行了研究。为了评估抗生素敏感性，已使用用含有生长培养基和不同浓度抗生素的琼脂糖凝胶沉积物修饰的电极测量了对抗生素敏感的金黄色葡萄球菌和mrsa的电化学衍生生长曲线。针对抗生素敏感的金黄色葡萄球菌和mrsa生长的敏感性评估了最佳电化学参数，并报告为在两种常用抗生素：阿莫西林和苯唑西林存在和不存在的情况下测试的两种菌株的细菌生长的函数。
[0263]
1.材料和方法
[0264]
具有芯片上银参考和金对电极的市售金(au)丝网印刷电极(spe)自dropsens(oviedo,spain)(ref 223bt)获得。
[0265]
用于电极表征的凝胶含有琼脂糖、miller lb broth、200mm kcl 1mm fe[cn]
63- 1mm fe[cn]
64-(ferri-ferro cyanide(ff-c)溶液)，其中一些含有抗生素(去离子(di)水中8μg/ml的阿莫西林或苯唑西林)。所有这些化学品均购自sigma aldrich,dorset,uk。凝胶成分最初在室温下混合，然后在121℃高压灭菌以进行灭菌并允许琼脂糖混合。冷却后，凝胶硬化，并在沉积在电极上之前重新熔化。冷却后将抗生素添加到凝胶中以避免在高温下失活。
[0266]
用于培养的细菌平板含有lb培养基 琼脂(sigma aldrich)。细菌菌株金黄色葡萄球菌(atcc 29213)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa：atcc 43300)从每个新鲜制备的冷冻甘油原液(储存在-80℃)中划线到lb琼脂平板上。单菌落用于接种溶原培养液的过夜培养物(37℃下5ml)。将来自过夜培养物的体积为5μl和细菌浓度为～107cfu/ml(cfu-菌落形成单位)的细菌直接移液到电极表面的凝胶上，在传感器上给出～50,000cfu的最终计数。将lb琼脂糖制备为lb，但用琼脂糖代替琼脂。
[0267]
在测量之前，使用电化学方法清洁所有电极，包括将电极浸入di水 200mm kcl 1mm fe[cn]
63- 1mm fe[cn]
64-(ferri-ferro cyanide(ff-c)溶液)并在-0.3v至 0.8v的电势范围内以100mv/s的速度10次扫描进行循环伏安法(cv)。清洁后，用di水冲洗电极，并在
使用前使用气溶胶枪干燥。
[0268]
1.2表征
[0269]
所有电极测量均使用三电极电池进行。在一个芯片上用对电极、参考电极和工作电极设计dropsens spe，其消除了合并外部对电极和参考电极的需要。所有测量均使用恒电位仪(palmsens ps4，palmsens，houten，netherlands)进行。
[0270]
通过参考ag电极在-0.3v至0.5v之间扫描电势3次来进行cv测量。使用第三次测量进行分析。还使用差分脉冲伏安法(dpv)在与cv相同的电势范围内对电极进行表征。从dpv测量中提取峰值电流(i
pk
)。还使用eis对电极进行表征。在开路下，以10mv rms的波长幅度在100khz和0.1hz之间的频率范围内测量eis响应。将生成的nyquist和bode阻抗图拟合到randles’等效电路以提取多种阻抗参数。图1(b)显示了实例eis响应，插图中显示了用于数据拟合的randles’等效电路。
[0271]
在细菌沉积在电极表面之前，在修饰的电极上进行cv、dpv和eis测量。一旦沉积，凝胶在37℃下部分保持稳定10分钟。然后，将来自过夜培养物(～107cfu/ml)的5μl金黄色葡萄球菌或mrsa培养物移液到凝胶顶部。使用测量脚本每5分钟进行一次dpv和eis测量，并将提取的参数绘制为时间的函数，最多可达2.5小时的细菌生长后沉积。所有细菌生长实验均在培养箱(genlab ltd，widnes，uk)内含有的湿度室中37℃下进行。图1(a(i))显示了所采用的测量设置，包括使用连接到恒电位仪的凝胶沉积物修饰的au电极和用于电化学测量的相关软件。
[0272]
抗生素的最低抑菌浓度(mic)通过96孔微量培养板中的两倍培养液微量稀释来确定。用5x104cfu/孔的细菌接种阳离子调节的mueller hinton培养液的等分试样(100μl)(barry,a.l.等人,1992.j.clin.microbiol.30,585-589)；oxoid cm0405)，其含有连续稀释的抗生素，并在37℃下温育17小时。通过使用带有softmax pro 7.1软件(molecular devices)的spectramax 190读板器(molecular devices)在600nm(od
600
)波长处测量孔的光密度来确定每个孔中的生长。从阴性对照(仅培养基)和阳性对照(不含抗生素的细菌)计算每个孔的生长抑制的百分比。mic80定义为抗生素的最高稀释，其导致》80％的生长抑制(n＝4,z》2.5)。
[0273]
结果和讨论
[0274]
2.1电极和电化学测量
[0275]
本研究选择了市售电极，以便从其低成本和易于与开发的测量装置集成中受益。选择的电极是直径为1.6m的丝网印刷电极(spe)(dropsens,oviedo,spain)。spe(33mmx10mmx0.5mm(长x宽x高))由三个主要部分组成：直径为1.6mm的au工作电极、au对电极和银(ag)参考电极。电极上的电触点由ag制成。以前，这些au spe已用于生产一次性核酸生物传感器(kuralay,f.等人,j.,2015.talanta.85,1330-1337)并已用于检测挥发性脂肪酸(ndiaye,a.l.等人,2016.biosensors.(basel).6,46)，以及其他应用。
[0276]
图1(b)显示了从100khz到0.1hz进行的典型eis测量，插图显示了用于拟合eis数据的经典randles’等效电路模型。通过将数据拟合到该电路中，可以提取许多分析参数，包括溶液电阻(r
soln
)、电荷转移电阻(r
ct
)和双层电容(c
dl
，工作电极与第一电极之间界面处的电容)。此外，通过提取eis波德图，可以提取有关不同频率下的阻抗(z)和相位角的信息。发现范围广泛的参数随着时间的推移作为微生物生长的函数而变化，并且随后的结果呈现了
使用最敏感和最方便的参数提取的数据。此外，dpv峰值电流(i
pk
)也可以作为细菌生长的函数进行研究。
[0277]
2.2凝胶制备和电极制备
[0278]
在测量电极上的细菌生长之前，研究了凝胶形成溶液的成分和体积，以建立用于功能化和电化学测量的最佳传感器修改方案。琼脂糖因其紫外线透明性和低毒性而被选为合适的材料。即使凝胶浓度的微小变化也会影响其特性，例如凝胶化，并且3d构建体的其他特性也会受到显著影响，因此，测试了三种相似浓度的琼脂糖(1wt％、1.5wt％和3wt％)来评估凝胶稳定性和沉积的容易度，旨在为应用选择最佳琼脂糖浓度。图1(a(ii))显示了电极上的实例凝胶沉积。图1(c)显示了测试的三种琼脂糖凝胶的电化学响应(i)cv和(ii)eis。每个凝胶都含有ff-c，以确保可以测量法拉第信号，即ff-c氧化还原介体可以有效地渗透凝胶以到达工作电极表面。将氧化还原剂添加到凝胶中以扩大在微生物生长过程中可以研究的电化学参数的数量。cv响应(图1(c)(i))显示，随着凝胶中琼脂糖浓度的增加，响应电流减小，氧化峰和还原峰之间的分离更大，表明对于1wt％凝胶具有提高的电化学响应。这通过eis测量得到证实(图1(c)(ii)，其中r
ct
随着琼脂糖浓度的增加而显著增加。
[0279]
randles-sevcik方程可用于描述扫描速率对循环伏安测量峰值电流的影响：
[0280][0281]
其中i
p
是以安培为单位的最大电流，n是在氧化还原事件中转移的电子的数量，a是以cm2为单位的电极面积，f是以c mol-1
为单位的法拉第常数，d是以cm
2 s-1
为单位的扩散系数,c是以mol cm-3
为单位的浓度，v是以v.s-1
为单位的扫描速率，r是以j k-1
mol-1
为单位的气体常数，t是以k为单位的温度。
[0282]
可以从cv曲线中提取多种参数，包括i
p
和峰电势分离(δe
p
)。表1显示了每种琼脂糖凝胶浓度的这些参数，并且很明显，随着凝胶中琼脂糖浓度的增加，峰分离显著增加，表明在较高琼脂糖浓度下可逆性降低。
[0283]
从eis数据中，可以使用以下方程发现离子物质(ff-c)的扩散系数或电极面积：
[0284][0285]
其中l是扩散长度，r
ct
是从测量的eis数据的拟合中提取的以欧姆为单位的电荷转移电阻。通过对d重新排列该方程，可以确定每个琼脂糖浓度下的扩散系数，并用于评估琼脂糖对ff-c在大规模运输条件下到达电极表面的影响。在这种情况下，选择
‘
d’作为目的参数，并且由于凝胶的交联性质，电极面积保持不变，这意味着
‘
d’可能会对扩散行为产生更大的影响，而不是对产生的电极面积产生更大的影响。然而，人们承认同样
‘
d’本来可以被固定，并且相反本来可以研究所述面积作为琼脂糖浓度的函数。
[0286]
表1显示了在每个琼脂糖浓度下提取的d值，范围从1wt％琼脂糖的4.15x10-9
到3％琼脂糖的7.64x10-10
cm
2 s-1
。1.5wt％的琼脂糖显示出2.23x10-6
cm
2 s-1
的显著更高的值，但是，它也显示出来自eis测量的更大r
soln
，其有助于解释d计算值中观察到的差异。从表1中可以看出，与测试的其他两种琼脂糖浓度相比，1.5wt％琼脂糖的χ2值或
‘
拟合优度’统计检验大约高一个数量级。这表明虽然1.5wt％的凝胶测量可能与其他测量不完全一致，但它仍可用作显示凝胶发展的方法。由于在较低的琼脂糖浓度下观察到电化学响应的提高，并且
易于在电极表面形成可重现的球形凝胶，因此为所有后续实验选择了1wt％的凝胶。
[0287]
使用浸涂和滴铸(10和20μl)沉积的三种凝胶的cv和eis响应分别如图1(d)(i)和(ii)所示。测试了两个滴铸体积；仅将10μl移液到we上，然后将20μl移到所有三个电极(we/re/ce)上。从cv响应和eis来看，20μl凝胶沉积物似乎产生了最一致的电化学响应。就cv曲线而言，20μl凝胶沉积物产生大约10倍的峰值电流，并且与10μl-凝胶沉积物的140.94mv相比，峰值分离在85.55mv时更接近理论极限(～59mv)。它还提供了可接受的低r
ct
，使凝胶沉积物和电极表面之间的电子转移令人满意。因此，对于后续测量，将至少20μl凝胶移液到spe上，以确保覆盖芯片上的所有三个电极。较大的凝胶体积还使得能够延长测量时间，因为较小的体积具有在微生物生长过程中更容易蒸发的倾向。
[0288]
表1总结了从凝胶开发阶段提取的电化学测量数据。主要参数取自eis数据，拟合randles’等效电路。数据证实了图1中显示的结果，即滴铸到spe上的20μl，1wt％的琼脂糖凝胶提供了最佳的电化学响应，适用于随后的细菌生长测量。
[0289]
表1.图1中显示的数据总结。表显示从凝胶开发实验中提取的cv、eis和dpv测量数据。测量参数包括r
soln
、r
ct
、c
dl
、z(100khz)、相位、dpv i
pk
、cv i
pk
、cv δe
p
和d。
[0290][0291]
为了能够评估电极上的细菌生长用于研究抗生素敏感性的目的，将不同的抗生素掺入琼脂糖凝胶中，并监测存在和不存在抗生素时的细菌生长，以研究敏感性金黄色葡萄球菌或mrsa对目的抗生素的响应。抗生素阿莫西林和苯唑西林主要用于研究凝胶修饰的电极上的金黄色葡萄球菌或mrsa生长。它们还用于对敏感性和耐药性金黄色葡萄球菌菌株进行基准最低抑制浓度(mic)测定，以确定用于敏感性测试的最佳抗生素浓度。除了抗生素外，凝胶还包括lb琼脂中包括的相同营养物质，以促进细菌生长。为确保细菌在含有不同抗生素和lb培养液的凝胶上可以生长，在细菌沉积之前进行cv测量以研究不同凝胶成分的影响。
[0292]
图2(a)显示了多种抗生素(不含凝胶)对spe的cv响应的影响。测试了广泛的抗生素，包括阿莫西林、苯唑西林、甲氧西林、氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、链霉素和羧苄青霉素。在所有情况下，抗生素的cv扫描都没有产生可观察到的氧化/还原峰，当它们一起掺入
凝胶中时可能会干扰ff-c电化学响应。然后在存在和不存在ff-c的情况下在琼脂糖凝胶中测试阿莫西林(图2(b))。正如预期的那样，含有阿莫西林的凝胶的cv响应没有产生电化学峰，而同时含有阿莫西林和ff-c的凝胶显示出预期的可逆出现的cv响应，进一步证实了阿莫西林对凝胶修饰的spe的电化学没有影响。图2(c)显示了使用含有和不含有ff-c的lb琼脂糖凝胶进行的类似实验。同样，很明显需要ff-c来产生电化学信号，表明lb本身对凝胶修饰电极的响应没有影响。
[0293]
表2提供了从抗生素筛选实验和在含有阿莫西林和lb的凝胶上进行的电化学实验中提取的电化学测量数据的总结。大多数参数取自拟合的eis数据以及来自dpv测量的i
pk
。
[0294]
表2.图2a-c中显示的数据总结。表显示了从一系列常用抗生素的抗生素筛选实验中提取的eis和dpv测量数据以评估潜在的电化学响应和来自凝胶组分实验的数据。测量参数包括r
soln,
、r
ct
、c
dl
、z(100khz)、相位和dpv i
pk
。
[0295][0296]
对培养箱内电极的初步测试揭示，在测量有意义的生长数据之前，20μl体积的凝
胶具有在～60分钟内完全蒸发的倾向。因此，将凝胶体积增加到50μl，其在完全蒸发前至少120
–
150分钟内提供了有用的数据。如表3所示，体积的增加对凝胶本身或spe的电化学没有影响。
[0297]
表3.图2d中显示的数据总结。表显示了从凝胶体积实验中提取的eis和dpv测量数据。测量参数包括r
soln,
、r
ct
、c
dl
、z(100khz)、相位和dpv i
pk
。。
[0298][0299]
2.3细菌生长概况
[0300]
记录基线测量(即不存在任何细菌)以将来自凝胶修饰传感器的电化学信号表征为时间的函数(长达150分钟)。凝胶沉积后每5分钟进行一次eis/dpv测量，并生成3条曲线；基线，不存在抗生素的细菌生长，以及存在抗生素(amox或oxa)时的细菌生长。在评估它们的mic以确保mrsa实际上可以在电极上生长后，以8μg/ml的浓度制备抗生素amox和oxa，但至关重要的是，金黄色葡萄球菌的生长会受到抑制。寻找抗生素敏感的金黄色葡萄球菌和mrsa在无抗生素和含抗生素凝胶上的生长之间的差异，以评估敏感性。从eis和dpv测量中提取的所有多种参数中，发现100khz的阻抗(z)提供了对细菌的最敏感的响应。
[0301]
2.4阿莫西林修饰的传感器行为
[0302]
图3(a)(i)显示了金黄色葡萄球菌在凝胶修饰传感器上150分钟直至蒸发的生长曲线。很明显，移液到注入阿莫西林的传感器上的金黄色葡萄球菌产生与基线响应几乎相同的响应，即5ul等分试样中不存在细菌的情况模拟接种金黄色葡萄球菌，表明生长受到抑制。该数据与在注入阿莫西林的琼脂糖板上并使用传统微生物学技术温育和评估的金黄色葡萄球菌生长获得的数据相关(图4和5，如下所述)，表明电化学技术与基准微生物学工作相关。
[0303]
图4呈现了使用敏感的金黄色葡萄球菌进行的凝胶划线实验的结果，其描述了含有不同的凝胶成分的凝胶。所有凝胶都含有1wt％琼脂糖 lb，有些凝胶含有ff-c和阿莫西林(8μg/ml)。在平板上划线金黄色葡萄球菌的目的是评估ff-c和阿莫西林对金黄色葡萄球菌生长的影响。从图像中可以清楚地看出，金黄色葡萄球菌能够在ff-c存在的情况下生长(图4(b)(i))，但是，如果存在阿莫西林，则无论是否存在ff-c，金黄色葡萄球菌生长被完全抑制。
[0304]
图5呈现了使用敏感的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)进行的凝胶划线实验的结果，其描述含有不同的凝胶成分的凝胶。所有凝胶均含有1wt％琼脂糖 lb培养液 ff-c，有些凝胶含有约mic值(8μg/ml)的阿莫西林。该划线实验的目的是评估阿莫西林对金黄色葡萄球菌/mrsa生长的影响。从图像中可以清楚地看出，金黄色葡萄球菌在阿莫西林存在的情况下无法生长(图5(a)(ii))，但在没有阿莫西林的情况下生长良好(图5(a)(i))。然而，在mrsa的情况下，它在存在或不存在阿莫西林的情况下都显示出生长，尽管与敏感菌株相比效率较低。这可能是由于mrsa冷冻原种菌株的性质和在平板上划线的方
法。然而，与敏感的金黄色葡萄球菌不同，在存在阿莫西林的情况下可以清楚地看到一些生长。
[0305]
在没有阿莫西林的情况下加载到本发明的凝胶上的金黄色葡萄球菌给出了与在阿莫西林存在下获得的曲线不同的z曲线，表明细菌生长是时间的函数。然后从两条曲线中减去基线数据，以便清楚地将z的变化可视化为时间的函数，并确定细菌的生长期。图3(a)(ii)显示了注入阿莫西林的传感器和未注入阿莫西林的传感器中金黄色葡萄球菌生长的基线减法的结果。有趣的是，装载阿莫西林的凝胶上的金黄色葡萄球菌的z在30到100分钟之间保持不变，而不含抗生素的凝胶上的金黄色葡萄球菌的z增加了约200％，证实了传感器表面上细菌浓度的变化。
[0306]
接下来，以与敏感性金黄色葡萄球菌菌株相同的方式研究耐性金黄色葡萄球菌菌株(mrsa)。图3(b)(i)显示了mrsa在用浓度接近mic值(8μg/ml)的阿莫西林修饰的传感器和不存在阿莫西林的凝胶上的生长曲线。这一次，mrsa行为(在装载阿莫西林的凝胶上)没有像发现金黄色葡萄球菌那样模仿基线，而是展示出更相似(增加)的z梯度，类似于在非抗生素凝胶上测量mrsa生长时。当从数据中减去基线曲线时，这一点得到了证实(图3(b)(ii))。在这种情况下，每个凝胶的减mrsa基线的数据显示随着时间的推移稳定增加，表明在阿莫西林存在下会出现生长受阻。在30-100分钟内，不含阿莫西林的凝胶的z变化为～24ω，而8μg/ml阿莫西林凝胶的z变化为～11ω。这是意料之中的，因为抗生素耐药性并不总是“二元情况”(sabath,l.d.等人,m.,1976.antimicrobial agents and chemotherapy.9,962-969)，而且抗生素通过延缓生长仍然对耐药性菌株具有影响。在临床上，这表现为在预期治疗剂量的抗生素存在下存活的能力。然而，清楚的是，对于相同的阿莫西林浓度，可以看到金黄色葡萄球菌和mrsa菌株之间的差异，允许这两种菌株在100分钟内(如果不是更少的话)区分出来。
[0307]
为了验证阿莫西林对mrsa菌株的影响，产生了在浓度显著高于mic(50μg/ml)的amox注入凝胶上的mrsa的生长曲线。在这个浓度下，阿莫西林应该完全抑制mrsa的生长，并且生长曲线证实这确实是这种情况，因为它展示出与基线测量非常相似的曲线(图3(b)(i))。一旦从基线中减去这种较高的抗生素浓度测量值(图3(b)(ii))，显然阿莫西林的浓度对mrsa的生长具有显著影响。与显示生长受阻的8μg/ml阿莫西林不同，在相同的30-100分钟时间内mrsa的z值在50μg/ml阿莫西林上几乎没有变化。减去的生长曲线完全平坦，表明在该抗生素浓度下mrsa生长受到抑制。
[0308]
此外，使用微分脉冲伏安法的电化学技术产生在每种抗生素浓度(8μg/ml和50μg/ml)的阿莫西林凝胶和不使用抗生素的凝胶修饰的传感器上的mrsa生长曲线，用于与z生长曲线比较(图7)。在这种情况下，dpv峰值电流(i
pk
)被绘制为时间的函数，并且清楚的是i
pk
展示出与z相似的生长曲线。用不含阿莫西林的凝胶修饰的传感器展示出与装载8μg/ml阿莫西林的凝胶修饰的传感器相似的曲线(更陡的梯度)，而对于50μg/ml阿莫西林的情况，一旦从基线中减去该测量值，它几乎完全平坦，再次表明在这个抗生素浓度下mrsa生长受到抑制。
[0309]
尽管易于进行dpv测量，但它似乎对凝胶成分影响随时间的变化(例如，凝胶的干燥)更敏感，因此z可能是用于细菌生长曲线分析的更敏感和重要的参数。然而，我们注意到通过密封系统和控制环境可以很容易地防止凝胶干燥。
[0310]
2.5苯唑西林修饰的传感器行为
[0311]
阿莫西林结果与另外的抗生素苯唑西林进行了比较，所述苯唑西林现在比甲氧西林更常用于检测耐药性。苯唑西林用于进行电极生长测量(图6)。与使用装载阿莫西林的凝胶进行的生长实验类似，使用含有和不含有苯唑西林的凝胶来研究金黄色葡萄球菌和mrsa生长。图6(a)(i)呈现了金黄色葡萄球菌在装载苯唑西林的凝胶和不含抗生素的凝胶上的生长曲线，以及用于比较的基线(仅凝胶)曲线。以与使用阿莫西林获得的结果类似的方式，在装载苯唑西林的凝胶上生长的金黄色葡萄球菌产生了与基线测量非常相似的z曲线，其中没有细菌沉积在5μl等分试样中，这表明8μg/ml的苯唑西林能够抑制金黄色葡萄球菌的生长。另一方面，不含苯唑西林的凝胶上的金黄色葡萄球菌展示出明显不同的z曲线，代表金黄色葡萄球菌的生长。图6(a)(ii)展示了减去基线信号的生长数据。在这种情况下，在苯唑西林和不在苯唑西林上生长的金黄色葡萄球菌之间有明显的区别。在不含抗生素的凝胶的情况下，z增加～20ω，而对于含有苯唑西林的凝胶，z通比较在长达～70分钟内保持相当平稳，然后z开始下降，可能是由于凝胶蒸发过程的影响，因为在无抗生素凝胶情况下长达70分钟内，早在最初的细菌沉积后30分钟，z中就有明显的生长。
[0312]
也在注入和不注入苯唑西林的凝胶上测试了mrsa。图6(b)(i)显示了与基线数据一起生成的增长曲线。与金黄色葡萄球菌不同，mrsa生长曲线对于含有和不含苯唑西林的凝胶看起来非常相似，如之前使用阿莫西林所示。在含有不同苯唑西林水平的凝胶上生长的mrsa样品再次存在细微差异，并且这些差异体现在电化学细菌生长曲线的梯度中。这是意料之中的，正如前面所解释的，耐药性是复杂的现象，并且在mrsa的情况下，生物体仍然对高浓度的β-内酰胺类抗生素敏感。临床上，耐药性体现为在超过典型mic值下生长的能力，因为这些是耐药性在其下进化的条件。传感器证实了这一点；在没有任何抗生素的情况下，电化学生长曲线最为显著，但在使用接近mic的抗生素浓度修饰的传感器时显示出生长受阻。这些发现显示，凝胶/抗生素修饰的电极传感器能够评估细菌生长并鉴定阻碍生长的药物/剂量关系。
[0313]
3.结论
[0314]
低成本、市售的金丝网印刷电极已被用于在修饰后并使用eis和dpv的电化学技术监测细菌生长。使用常见的多糖琼脂糖开发了覆盖所有三个电极的水凝胶沉积物，以受益于其多孔性、生物相容性和滴铸能力。开发了含有不同抗生素和细菌生长培养基的琼脂糖凝胶，以促进或抑制生长。在用含有不同抗生素浓度的凝胶修饰的电极上测量敏感性和耐药性金黄色葡萄球菌菌株的生长曲线，以进行抗生素敏感性测试。该系统测量了细菌生长，其中没有抗生素存在以及在抗生素存在下敏感性金黄色葡萄球菌没有生长。此外，在低抗生素浓度(在mic值附近)的情况下，测量了耐药性mrsa菌株的细菌生长。
[0315]
该系统的明显优势是传感器的低成本和所采用的方法的简单性。传统的微生物学技术，如琼脂平板、生长分析、mic测定和敏感性测试仍在常规使用，因为它们在临床环境中运行良好。采用基于pcr的方法速度较慢，原因有多种，其包括：难以说服卫生机构进行创新，pcr试剂可能昂贵，并且抗性的遗传指标也可能存在且可识别，但并不总是转化为细菌具有抗性(其他遗传因素在决定抗性方面发挥作用)。
[0316]
在开发amr传感器时，生物传感器社区(community)通常专注于遗传分析。然而，在本文中，已证明表型测试的务实方法是有益的。可以在凝胶修饰电极上记录电化学测量，无
需将传感器浸入液体中，无需使用dna识别元件对传感器表面进行化学功能化(这可能是dna生物传感器的测量变异的巨大来源)并且可以测量广泛的电化学参数并将其用于解释细菌生长曲线。
[0317]
轻松修饰凝胶(抗生素浓度、营养成分、氧化还原剂等)的能力与在单个芯片上排列多个电极的能力相结合，有利于在临床抗生素敏感性测试中使用。
[0318]
基于低成本、丝网印刷电极的用于大肠杆菌的快速抗微生物剂敏感性测试的开发
[0319]
1.材料和方法
[0320]
在使用之前，市售的spe(如上所述)在100mm h2so-中通过-0.3和1.5v之间的循环伏安法(cv)进行电化学清洗约10次扫描(或直到cv稳定)。清洗后，用di水冲洗电极并用氩气干燥。
[0321]
通常以100ml批次生产凝胶沉积物并且其在di水中含有1％琼脂糖、2.5g miller lb broth、200mm kcl 1mm fe[cn]
63- 1mm fe[cn]
64-(ferri-ferro cyanide(ff-c)溶液)。一些凝胶还含有链霉素(～mic-4μg/ml)。所有化学品均购自sigma aldrich(dorset,uk)。凝胶在室温下制备并在121℃高压灭菌15分钟以进行灭菌并允许成分混合。凝胶在冷却后变硬，因此储存在48℃的水浴中以在沉积在电极上之前维持凝胶形式。在沉积前立即添加抗生素以避免在升高的温度下失活。
[0322]
将大肠杆菌(atcc 25922)从新鲜制备的冷冻甘油原液中划线到含有lb培养基和琼脂(sigma aldrich)的平板上。在lb/agar平板上生长后，使用单菌落接种lysogeny broth(50ml，37℃)的过夜培养物。将来自过夜培养物的细菌以～3.5x109cfu/ml的浓度直接移液到凝胶修饰的电极(5μl)上，在传感器上产生～1.75x107cfu的起始大肠杆菌计数。以类似的方式进行基线测量，除了5μl过夜培养物代替作为替代品的没有细菌的5μl lb培养基。含有凝胶成分的划线平板含有lb，但用琼脂糖代替琼脂以匹配凝胶成分。
[0323]
测量细菌电化学生长曲线～5小时，并且每个实验涉及三个spe：基线测量(仅凝胶，即无细菌)、凝胶 抗生素与细菌和凝胶(无抗生素)与细菌。测量是在37℃下在培养箱(genlab ltd,widnes,uk)内包含的测试支撑结构中进行的。使用测量脚本每10分钟进行一次eis测量，并将提取的参数(例如100khz时的z)绘制为时间的函数，直到细菌培养物沉积后～5小时生长的最大值。每个实验一式三份进行。
[0324]
1.1测试支撑结构设计
[0325]
开发测试支撑结构主要是为了在延长的时间周期内维持凝胶的完整性，允许延长的ast测量窗口，其可以捕捉微生物的生长，其倍增时间(天/周)比那些在分钟范围内的时间长。最终的测试支撑设计由三个主要部分组成：带有高达6个spe的插槽(允许同时复用6个spe)的不锈钢底板、水凝胶密封板(透明丙烯酸)和顶盖结构(透明丙烯酸)以密封样品并防止凝胶蒸发。丙烯酸部件是使用激光切割机(lpkf protolaser)制造的。底板和水凝胶密封板使用沉头m5金属螺钉和橡胶o形环(d＝0.8cm,2mm厚)的组合固定在一起，而盖子通过牢固粘在盖子上的磁铁固定在结构上。在进行电化学生长测量之前，通过将500μl水放入腔室中并放置几天来测试该结构，以确保实现充分密封，防止蒸发。
[0326]
1.2表征
[0327]
使用三电极电池在spe上进行电化学测量。使用带有相关数据分析软件(pstrace)的恒电位仪(palm-sens ps4,palmsens,houten,netherlands)进行测量。spe通过边缘连接
器连接到恒电位仪。
[0328]
au工作电极spe表面的扫描电子显微镜(sem)(tm-1000,hitachi,tokyo,japan)图像是通过在x1.0 k放大率下扫描150x150μm区域进行的。
[0329]
通过100khz至0.1hz之间频率范围内的电化学阻抗谱(eis)表征细菌生长曲线。检查了多种参数，并选择了100khz的z和100khz的相位角作为细菌生长的最具代表性的指标。如l.shedden和p.connolly，world intellectual property organisation,2010,26中所述，通过将每个数据集除以时间t＝0时的其相应值对电化学参数进行归一化。然后进行独立的双尾t检验以比较在每个时间点(n＝3)上存在或不存在抗生素的情况下记录的参数。
[0330]
2.结果和讨论
[0331]
2.1传感器概述
[0332]
传感器的关键优势是凝胶修饰电极的表型特性，这意味着它能够检测不同类型的细菌感染，因此在这种情况下，选择常见的感染大肠杆菌作为目的细菌。在其中不存在抗生素的凝胶上沉积大肠杆菌后，随着时间的推移，细菌能够在电极上不受阻碍地生长。然而，当用浓度大于最小抑制浓度(mic)的抗生素接种凝胶时，抗生素引起细菌生长受阻，其反映在实时进行的电化学测量中。
[0333]
可以放大测量装置以使用多路选择器格式同时实时监测若干(≤8)电极，所述测量装置由连接到由相关测量软件控制的恒电位仪的凝胶修饰的spe组成。
[0334]
本研究使用了市售电极，因为它成本低(《￡2)，并且可以容易地与现有测量装置集成。工作电极直径为1.6mm。au we表面的sem图像显示，au表面高度不规则，并且特征是深空隙和不均匀的粒径。
[0335]
我们已发现，我们的装置可以直接从特定频率下的“原始”阻抗值(不需要电路模型)中辨别细菌生长趋势，最终降低仪器复杂性，其有助于在护理点(poc)进行准备部署。
[0336]
2.2标准化实验
[0337]
在先前的实验工作中，负责水凝胶蒸发的因素是用于促进细菌生长的高温温育条件(37℃)。为了使水分流失量最小化，探索了两种可能的策略：
[0338]
1.通过凝胶环境吸水增加空气水蒸气含量，并因此平衡蒸发速率(水凝胶是高度吸湿的结构，在潮湿环境中容易“膨胀”)。
[0339]
2.将凝胶样品封装在较小的体积内，以诱导系统快速达到饱和(冷凝和蒸发速率相等)，并因而使凝胶暴露在一致的湿度水平下并有效地实现零净蒸发。
[0340]
实施第一个策略涉及在培养箱内放置加湿器，所述加湿器将基于所需的湿度设置自动调整湿度水平。同时进行基线(无细菌)电化学测量以研究湿度对所得电化学数据的影响。这些实验只是探索性的，因此没有被复制。在图8a中重现了湿度实验后得到的阻抗轨迹。初步实验揭示，在正常运行期间，培养箱内的湿度水平维持恒定在20％相对湿度(rh)。延长暴露于这种湿度水平可能会产生问题，不仅因为凝胶蒸发会使阻抗轨迹不稳定，导致幅度急剧增加，而且还因为通常优先在潮湿条件下发生的细菌和真菌生长。
[0341]
将rh水平增加超过20％rh不仅通过增加空气湿度比来减慢蒸发速率，而且还促进水附着在水凝胶的聚合物骨架上。然而，发现在历史上显示是定量细菌生长和代谢活动的有用手段的电化学参数如阻抗模量对湿度变化敏感(图8b)。在55％rh(
±
12％sd)时，阻抗在整个测试窗口中都遵循湿度轨迹，其中间只有很小的时间延迟(未重现)。此时间延迟可
能与在通过加湿元件调节湿度后在培养箱内rh水平稳定所需的时间有关。当使用75％rh水平(一种度量，其中湿度在培养箱内更加稳定(
±
4％sd))工作时，注意到在凝胶电化学阻抗和环境湿度之间的线性相关性(图8b)。
[0342]
如果在高度潮湿的环境中在培养箱内保持独立，发现凝胶膨胀，如降低100khz时阻抗模量值(75％测量)所示，直到如图8d所示(下图)它最终塌陷，引入显著形态变化的附加变量。
[0343]
当封闭在未密封的支撑框架内以维持其结构完整性时，水凝胶在高湿度条件下(80
±
7％rh)蒸发，可能是由于当有效空气暴露面积减少时蒸发速率超过吸水速率(而不是圆顶，由于墙壁连接，支撑产生了“井”型结构)。这些结果提示，为了维持细菌测量的一致基线，水凝胶在温育期间暴露于的湿度条件在整个测试期间保持大致恒定是有益的，并且理想情况下在90-100％rh范围内。最佳的敏感性湿度对照的更便宜且有效的备选是将水凝胶完全封闭在密封的测试支撑内，以基本上创造零净蒸发的气氛。
[0344]
图8c(左)展示了开发的测试支撑结构，该结构能够监测细菌生长曲线更长的时间(几个小时)，而因为凝胶蒸发，之前没有测试支撑结构可能需要约2小时。不锈钢底座和丙烯酸外壳和盖子价格低廉，可以用70％乙醇进行无菌清洁。此外，丙烯酸制造方便，具有电化学惰性。开发的凝胶外壳在图8c(右)中突出显示，并显示了凝胶在孔中形成的方式。这种特殊的形状是由水凝胶与丙烯酸通过壁附着的亲水相互作用产生的。与之前的圆顶形凝胶形成相比，它确保了完整的细菌沉积物得到控制和测试。图8d(上图)显示了在记录基线数据之前凝胶就位的示例电极，图8d(中)显示了在8小时基线测量后移除测试支撑后的示例电极用于比较。很明显，凝胶保持其完整性并在整个8小时测量窗口中保持独特的“井”形状。
[0345]
使用测试支撑，当凝胶仍然蒸发时，假设完全密封的外壳，冷凝平衡了蒸发，导致零净蒸发。这反过来使得能够建立非常平坦的基线曲线，如图8e所示。支撑就位后，凝胶修饰的传感器在100khz时展示出～50ω的阻抗(模量)(z)，其在观察下维持整个8小时。相反，没有橙色显示的测试支撑的相同测量开始时约为50ω，但随后在2小时内完全蒸发前稳步攀升至接近70ω。因此，测试支撑给水凝胶和细菌样品在电极测量区域的沉积带来了更好的一致性，提高了所提出的ast技术的可重复性。
[0346]
由于测试支撑在显著更长的时间内维持稳定基线的能力；使用该支撑利用大肠杆菌进行随后的生长曲线。测试支撑提供了以更长的倍增时间监测生物体的能力，使得能够为所提出的任何类型的细菌/真菌样品开发真正通用的ast传感器。
[0347]
2.3细菌生长曲线
[0348]
在建立测试支撑后，使用大肠杆菌进行结构验证，并涉及将大肠杆菌的少量(5μl)过夜培养物沉积到修饰的凝胶上，并随着时间的推移监测电化学生长曲线。每10分钟进行一eis，提取多种参数，包括不同频率的z，并随时间的推移绘制图表。
[0349]
通过绘制围绕大肠杆菌轨迹的99％置信区并注意注入抗生素的细菌轨迹(n＝3)偏离该区域所需的实验时间跨度来确定该装置提供的检测限(图9)。通过对这些时间值进行平均，发现检测系统可以根据100khz(a)处的阻抗读数在仅～2.5小时后就可以成功识别细菌生长，或者如果使用100khz(b)处的相位角，则检测系统可以在～2.1小时后成功识别细菌生长。
[0350]
这个获得结果的时间(time-to-result)明显快于目前至少1-2天的ast金标准，并且可能是在poc进行快速、低成本ast测试的非常重要的工具。采用了简化形式的数据分析(即标准化和计算3sd区域)来降低整个系统的复杂性并使其更适合在poc中使用。临床医生可以使用这种poc装置来快速选择最佳抗生素来治疗特定感染，其时间尺度比目前的方法更快。像这样的测试将极大地改善患者的健康状况，并有助于避免不必要的(通常是广谱)抗生素处方，同时改善我们最珍贵的抗微生物剂库存的管理。
[0351]
该技术的表型性质意味着它用途广泛，并且可用于广泛的病原微生物(革兰氏阳性或阴性细菌)，包括“较慢”生长的微生物，如结核分枝杆菌(m.tuberculosis)，以为ast提供快速的获得结果的时间。此外，鉴于uti细菌阈值≥105cfu/ml，并且通常高达108cfu/ml，并且大肠杆菌是最常见的尿路病原体，这种方法具有高灵敏度，使得能够检测临床相关浓度的大肠杆菌(参见t.k.price等人,j.clin.microbiol.,2016,54(5),1216-1222和j.k.brons等人,j.microbiol.methods,2020,169,105799)。该技术目前在阳性uti诊断的可接受范围内运行良好。该技术还可用于测试临床相关真菌，如白色念珠菌(candida albicans)和隐球菌。
[0352]
在poc利用简单的测量格式的获得结果的时间可以独立于资源可用性为治疗决策提供信息，并加强整体抗生素管理。此外，它将允许监测治疗效果，用于更加个性化的治疗方法，以改善患者预后、维持抗微生物剂效果、降低抗微生物剂耐药性相关成本并减轻amr的传播。这些进展代表了朝着广泛、低成本和常规抗生素敏感性测试迈出的明显一步，这在未来将至关重要，其中由于例如，政府立法，抗生素处方在没有确证测试的情况下可能是不可能的。