一种超细内径毛细管整体柱及其制备和应用

1.本发明涉及一种用于单细胞分析的超细内径毛细管整体柱，具体地说是一种新型超细内径毛细管整体柱及其制备以及在单细胞酶解肽段分离鉴定中的应用。


背景技术：

2.蛋白质组学分析对于揭示生命现象、发现生物标志物等具有重要的意义。随着组学研究的深入，研究者发现传统的基于群体细胞的蛋白质组学研究忽略了细胞间的异质性。而对于单个细胞，其蛋白质含量极低，对分离鉴定的灵敏度提出了巨大挑战。与常规毛细管分离柱相比，超细内径毛细管分离柱(内径≤30μm)色谱峰展宽小，与质谱联用时离子化效率高，从而可以显著提高痕量样品的质谱检测灵敏度。根据固定相的不同，分离柱主要包括填充柱和整体柱。目前用于痕量样品分离分析的色谱柱主要是超细内径毛细管填充柱。zhang等[1]制备了内径为22μm的毛细管填充柱，从单个细胞中鉴定到328个蛋白质；kelly等[2]制备了内径为20μm的毛细管填充柱，从1个细胞中单针鉴定到874个蛋白质。但是超细内径填充柱存在填充困难、反压大的问题。此外，非特异性吸附问题严重干扰了痕量样品定性定量的准确性。本发明针对以上问题，发展了一种新型的低吸附超细内径毛细管整体柱及其制备方法，并用于单细胞蛋白质组样品的高效分离和高灵敏度检测。
[0003]
[1]xi shao,xuantang wang,sheng guan,haizhu lin,guoquan yan,mingxia gao,chunhui deng,and xiangmin zhang,anal.chem.2018,90,23,14003
–
14010.
[0004]
[2]yongzheng cong,yiran liang,khaterehmotamedchaboki,romain huguet,thy truong,rui zhao,yufeng shen,daniel lopez-ferrer,ying zhu,and ryan t.kelly,anal.chem.2020,92,2665-2671.


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是发展一种用于单细胞分析的超细内径毛细管整体柱及其制备方法。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：以烯基三甲(乙)氧基硅烷类和仲胺基桥联三甲(乙)氧基硅烷类作为硅烷化前体，以醇和水作为溶剂，以表面活性剂作为致孔剂，采用溶胶凝胶方法在超细内径毛细管中原位制备仲氨基桥联杂化整体材料基质，然后通过硫醇和基质表面烯基的点击化学反应修饰功能基团从而制得超细内径毛细管整体柱；进而将原位预处理的单细胞样品上样到此超细内径毛细管整体柱上，与高分辨质谱联用，进行分离鉴定。
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具体步骤如下：
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(1)预聚溶液的配制：称量烯基三甲(乙)氧基硅烷类、仲胺基桥联三甲(乙)氧基硅烷类、表面活性剂、醇和水，混匀。
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其中烯基三甲(乙)氧基硅烷类和仲胺基桥联三甲(乙)氧基硅烷类的体积比例为1/1-3/1，两者总体积占预聚溶液的20％-40％。表面活性剂(十六烷基三甲基溴化铵或十六
烷基三甲基氯化铵)质量占预聚溶液质量的1％-30％。醇(甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇)与水的体积比为9/1-12/1。
[0010]
(2)原位溶胶凝胶反应：将预聚溶液迅速灌入预处理的内径为10-30μm的毛细管中，密封，30-50℃反应6-24h。反应后依次用甲醇、乙醇冲洗。
[0011]
(3)功能基团的修饰：称量烷基硫醇、偶氮类引发剂和溶剂(甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇)混匀，通入制备的整体材料基质中，密封，50-80℃反应6-24h，然后用溶剂冲洗。
[0012]
(4)单细胞样品分析：将单细胞分选到裂解液中，进行原位细胞破碎、蛋白质还原、蛋白质烷基化和蛋白质酶解，然后将样品上样到制备的超细内径毛细管整体柱上，与高分辨质谱联用，进行分离鉴定。
[0013]
本发明具有如下优点：
[0014]
1.采用溶胶凝胶反应和点击化学反应在超细内径毛细管中原位制备色谱固定相，操作简单；
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2.此超细内径毛细管整体柱具有连续通孔结构，通透性好，反压小；
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3.骨架结构上的仲胺基可抑制残留硅羟基的非特异性吸附，从而显著提高单细胞酶解肽段分离的峰容量和鉴定灵敏度。
附图说明
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图1超细内径毛细管整体柱的合成路线。
[0018]
图2超细内径毛细管整体柱的截面的扫描电镜图。
具体实施方式
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下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
[0020]
实施例1
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如图1所示制备超细内径毛细管整体柱。首先对内径为20μm的石英毛细管进行预处理：用1m hcl溶液冲洗12h，用水冲洗呈中性；通入4％氢氟酸(质量分数为40％的氢氟酸用水稀释10倍)3h；用1m naoh溶液冲洗毛细管12h，用水冲洗呈中性；用甲醇冲洗，氮气吹干备用。称取12mg十六烷基三甲基氯化铵溶于220μl甲醇中，加入60μl烯丙基三甲氧基硅烷和20μl双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺(体积比3：1)，最后加入20μl水，混匀，快速灌入预处理的内径为20μm的石英毛细管中，密封，30℃反应12h。所得的整体柱依次用甲醇、乙醇冲洗。然后称取0.0143g十八烷基硫醇和0.0030g偶氮二异丁腈溶于750μl乙醇中，混匀，灌入含有基质的毛细管中，65℃反应4h，然后依次用乙醇和乙腈冲洗。所得的毛细管整体柱的截面电镜图如图2a所示。可以看出整体材料与毛细管壁紧密相连，具有连续通孔结构，其通孔大小约为2μm。
[0022]
将1个hela细胞分选到15μl裂解液(100mm碳酸氢铵，1％蛋白酶抑制剂)中，进行原位超声破碎，然后加入1μl 80mm三(2-羧乙基)膦盐酸盐室温反应30min，并加入1μl 340mm碘乙酰胺避光室温反应40min，再加入1μl 0.001μg/μl胰蛋白酶37℃反应12h。将单细胞酶解肽段上样到制备的内径为20μm的毛细管整体柱上，通过毛细管电喷针与高分辨质谱联用，进行分离鉴定。
[0023]
实施例2
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如实施例1所述对内径为10μm的石英毛细管进行预处理。称取6mg十六烷基三甲基氯化铵溶于220μl甲醇中，加入60μl烯丙基三甲氧基硅烷和20μl双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺(体积比3：1)，最后加入20μl水，混匀，快速灌入预处理的内径为10μm的石英毛细管中，密封，30℃反应12h。所得的整体柱依次用甲醇、乙醇冲洗。然后称取0.0143g十八烷基硫醇和0.0030g偶氮二异丁腈溶于750μl乙醇中，混匀，灌入制备了基质的毛细管中，65℃反应4h，然后用乙醇和乙腈冲洗。所得的毛细管整体柱的截面电镜图如图2b所示。从图中可以看出，整体材料具有连续通孔的结构，从而反压低，传质快。
[0025]
将1个hela细胞分选到1μl裂解液(100mm碳酸氢铵，5mm三(2-羧乙基)膦盐酸盐，1％十二烷基-β-d-麦芽糖苷，1％蛋白酶抑制剂)中进行原位破碎，然后加入1μl 0.001μg/μl胰蛋白酶37℃反应12h。将单细胞酶解肽段上样到制备的内径为10μm的毛细管整体柱上，与高分辨质谱联用，进行分离鉴定。