HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用与流程

her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞、其制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于抗肿瘤细胞技术领域，尤其涉及一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞、其制备方法及其应用。


背景技术：

2.her2，又名erbb2、neu、cd340，其过度表达可导致细胞过度增殖和表型恶性转化。研究发现有30％的乳腺癌患者her2基因过度表达，这类高表达的患者恶性程度高，易复发转移，鉴于her2在正常细胞和肿瘤细胞中的表达水平有显著差异使其成为肿瘤免疫治疗的理想靶点。
3.近年来，基于nk细胞的car-nk疗法发展迅速，相较于car-t其具有先天独特的优势，比如，nk细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受主要组织相容性复合体(mhc)限制性；已报道的基于异体nk细胞的肿瘤免疫治疗均未见严重非可控移植物排斥宿主反应，表明异体nk细胞治疗的可行性；另外nk细胞相较于t细胞来说，更容易突破实体瘤的肿瘤微环境，对于实体瘤的治疗效果更显著。但是，car-nk细胞在进行治疗肿瘤时也存在一定缺陷，主要在于其在缺乏细胞因子信号的情况下，nk细胞无法扩增并增强其效应功能，缺乏抗肿瘤的持久性。
4.基于car-nk细胞存在的上述问题，研究发现白介素-12(简称il-12)能激活nk细胞，促进其分泌γ-干扰素(ifn-γ)对肿瘤细胞进行杀伤，因此工程化her2靶向的car-nk细胞组成性分泌il-12是治疗实体瘤，增强nk持续杀伤效应的很好的策略。例如，专利申请wo2020051363a1公开了一种基于nk细胞的治疗组合物和方法，具体公开了采用il-12靶向嵌合蛋白在体内或体外刺激nk细胞，促进nk细胞功能的方法，但是该方法的局限性在于il-12体外刺激后除去il-12再进行输注治疗，nk细胞的效果并不显著；而体内输注刺激时il-12靶向嵌合蛋白可以依靠靶向作用到达肿瘤部位，但足够数量的nk细胞不一定能到达肿瘤的位置，进而导致治疗效果不显著。
5.因此，目前采用il-12靶向嵌合蛋白刺激nk细胞的方式，其对增强肿瘤治疗效果并不显著，如何研发出一种能够直接靶向肿瘤进行杀伤作用的同时，杀伤效果显著且无需加入外源il-12，从而避免全身注射所引起的副反应的增强型抗肿瘤nk细胞是解决上述问题的关键。


技术实现要素：

6.本发明针对现有的增强型nk细胞治疗杀伤活性不足，还需要加入外源il-12，对人体产生副反应的技术问题，提出一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞、其制备方法及其应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞，能够同时表达her2和il-12，通过her2靶向肿瘤细胞，并自分泌il-12增强抗肿瘤能力；
9.所述her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞通过将il-12慢病毒和her2-car慢病毒共同感染nk-92细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。
10.在一实施方式中，所述il-12慢病毒中包含人工合成的il-12基因，所述人工合成的il-12基因是将人的天然il-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的il-12基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示；
11.所述her2-car慢病毒包含人工合成的her2-car基因，所述人工合成的her2-car基因是将从ncbi数据库获得的人cd8α信号肽基因、靶向her2单链抗体基因、人cd8α铰链区基因、人cd8α跨膜区基因、4-1bb的胞内区基因以及人cd3ζ胞内信号肽基因序列连接后经密码子优化得到，所述人工合成的her2-car基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
12.在一实施方式中，her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的her2-car阳性率在5-85％之间，所述her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞稳定传代期间上清液中il-12含量在1-10ng/ml之间，ifn-γ含量在1-10ng/ml之间。
13.本发明还提供了一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法，包括以下步骤：
14.慢病毒表达载体构建：将人工合成的il-12基因和人工合成的her2-car基因分别连接到慢病毒载体质粒i和慢病毒载体质粒ii上，构建得到il-12慢病毒表达载体和her2-car慢病毒表达载体；
15.慢病毒表达载体包装：将所述il-12慢病毒表达载体和her2-car慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染293t细胞，培养一段时间后，再经收集、浓缩处理，得到il-12慢病毒和her2-car慢病毒；
16.her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞构建与鉴定：培养传代nk-92细胞，将所述il-12慢病毒和her2-car慢病毒分别按照一定的moi值共同感染nk-92细胞，培养收集细胞，再经her2-car阳性率检测、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后，最终得到所述her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞。
17.在一实施方式中，所述慢病毒载体质粒i和质粒ii选自pgmlv质粒、lenti质粒、pcdh质粒、plvx质粒或prrlsin质粒。
18.在一实施方式中，所述慢病毒表达载体包装步骤中，所述il-12慢病毒的滴度为(1-10)
×
108tu/ml，her2-car慢病毒的滴度为(1-10)
×
108tu/ml。
19.在一实施方式中，培养传代nk-92细胞、il-12慢病毒和her2-car慢病毒共同感染nk-92细胞后的细胞培养所用培养基为完全培养基，培养条件均为于37℃，5％co2培养箱中，按照1.5
×
105cell/ml密度培养2-3天传代一次；
20.其中，所述完全培养基包括以下组分：
21.alpha mem培养基、10％～15％马血清、10％～15％胎牛血清、0.1mmβ-巯基乙醇、0.02mm叶酸以及50-200u/ml il-2。
22.在一实施方式中，所述完全培养基包括以下组分：
23.alpha mem培养基、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.1mmβ-巯基乙醇、0.02mm叶酸以及100u/ml il-2。
24.在一实施方式中，将所述il-12慢病毒和her2-car慢病毒按照一定的moi值共同感染nk-92细胞，其中，il-12慢病毒的moi值为10-40，her2-car慢病毒的moi值为20-200。
25.本发明还提供了一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
26.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
27.1、本发明提出的her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞，通过慢病毒介导的方法将il-12基因和her2-car基因导入nk-92细胞中获得her2-car-il-12-nk-92细胞，再结合细胞阳性率、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后得到，该nk细胞能够在表达hre2靶向的car同时自分泌il-12，使得nk细胞可以直接靶向肿瘤进行杀伤，同时nk细胞识别自分泌il-12促进其增殖和分泌杀伤因子增强对肿瘤的杀伤作用，从根本上解决了现有的增强型nk细胞治疗杀伤活性不足，还需要加入外源il-12，对人体产生副反应的技术问题；
28.2、本发明提出的her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法操作简单，利用该方法制备得到的nk细胞杀伤效果好、阳性率高，具体地，其her2-car阳性率在5-85％之间，其在稳定传代期间上清液中il-12含量在1-10ng/ml之间，ifn-γ含量在1-10ng/ml之间；
29.3、本发明提出的her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞在抗肿瘤药物制备领域，尤其是抗实体瘤药物制备领域具备广阔的应用前景。
附图说明
30.图1为本发明实施例所提供的人工合成的il-12基因结构示意图；
31.图2为本发明实施例所提供的人工合成的her2-car基因结构示意图；
32.图3为本发明实施例所提供的il-12慢病毒表达载体图谱；
33.图4为本发明实施例所提供的her2-car慢病毒表达载体图谱；
34.图5为本发明实施例所提供的nk92细胞和her2-car-il-12-nk-92细胞的流式细胞检测结果示意图；
35.图6为本发明实施例所提供的her2-car-il-12-nk-92细胞连续传代培养期间上清液中细胞因子il-12和inf-γ的含量图；
36.图7为本发明实施例所提供的增强型抗肿瘤nk-92细胞对sk-br3细胞的杀伤效果对比图；
37.图8为本发明实施例所提供的杀伤试验上清中ifn-γ含量测定结果示意图；
38.图9为本发明实施例所提供的her2-car慢病毒moi的筛选与确定实验中的流式细胞检测结果示意图。
具体实施方式
39.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.本发明实施例提供了一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞，能够同时表达her2和il-12，通过her2靶向肿瘤细胞，并自分泌il-12增强抗肿瘤能力；
41.所述her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞通过将il-12慢病毒和her2-car慢病毒共同感染nk-92细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。
42.在一具体实施方式中，所述il-12慢病毒中包含人工合成的il-12基因，所述人工合成的il-12基因是将人的天然il-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的il-12基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示；
43.所述her2-car慢病毒包含人工合成的her2-car基因，所述人工合成的her2-car基因是将从ncbi数据库获得的人cd8α信号肽基因、靶向her2单链抗体基因、人cd8α铰链区基因、人cd8α跨膜区基因、4-1bb的胞内区基因以及人cd3ζ胞内信号肽基因序列连接后经密码子优化得到，所述人工合成的her2-car基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
44.在一具体实施方式中，her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的her2-car阳性率在5-85％以上，所述her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞稳定传代期间上清液中il-12含量在1-10ng/ml之间，ifn-γ含量在1-10ng/ml之间。
45.本发明还提供了一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法，包括以下步骤：
46.s1、慢病毒表达载体构建：将人工合成的il-12基因和人工合成的her2-car基因分别连接到慢病毒载体质粒i和慢病毒载体质粒ii上，构建得到il-12慢病毒表达载体和her2-car慢病毒表达载体；
47.s2、慢病毒表达载体包装：将所述il-12慢病毒表达载体和her2-car慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染293t细胞，培养一段时间后，再经收集、浓缩处理，得到il-12慢病毒和her2-car慢病毒；
48.s3、her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞构建与鉴定：培养传代nk-92细胞，将所述il-12慢病毒和her2-car慢病毒分别按照一定的moi值共同感染nk-92细胞，培养收集细胞，再经her2-car阳性率检测、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后，最终得到所述her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞。
49.在一具体实施方式中，所述慢病毒载体质粒i和质粒ii选自pgmlv质粒、lenti质粒、pcdh质粒、plvx质粒或prrlsin质粒。
50.在一具体实施方式中，所述慢病毒表达载体包装步骤中，所述il-12慢病毒的滴度为(1-10)
×
108tu/ml，her2-car慢病毒的滴度为(1-10)
×
108tu/ml。
51.在一具体实施方式中，培养传代nk-92细胞、il-12慢病毒和her2-car慢病毒共同感染nk-92细胞后的细胞培养所用培养基为完全培养基，培养条件均为于37℃，5％co2培养箱中，按照1.5
×
105cell/ml密度培养2-3天传代一次；
52.其中，所述完全培养基包括以下组分：
53.alpha mem培养基、10％～15％马血清、10％～15％胎牛血清、0.1mmβ-巯基乙醇、0.02mm叶酸以及50-200u/ml il-2。
54.在一具体实施方式中，所述完全培养基包括以下组分：
55.alpha mem培养基、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.1mmβ-巯基乙醇、0.02mm叶酸以及100u/ml il-2。
56.在一具体实施方式中，将所述il-12慢病毒和her2-car慢病毒按照一定的moi值共同感染nk-92细胞，其中，il-12慢病毒的moi值为10-40，her2-car慢病毒的moi值为20-200。
57.本发明还提供了一种her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其应用于抗实体瘤药物制备中。
58.为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法，下面将结合具体实施例进行描述。
59.实施例1
60.本实施例提供了her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法中的慢病毒表达载体的构建步骤，具体为：
61.(1)il-12基因的合成：根据ncbi网站数据库检索结果，将天然的il-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接获得的il-12基因，即il-12p40 leader-il-12p40-2a-il-12p35，其基因结构示意图如图1所示，il-12基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示，该连接过程是委托基因合成公司按照基因工程常规方法合成获得；
62.(2)her2-car基因的合成：从ncbi网站数据库检索到的人cd8α信号肽基因、靶向her2单链抗体基因、人cd8α铰链区基因、人cd8α跨膜区基因、4-1bb的胞内区基因、人cd3ζ胞内信号肽基因的序列信息，将这些基因连接后进行密码子优化，全合成基因序列得到her2-car基因，即cd8αleader-her2-scfv-cd8αhinge-cd8α-tm-4-1bb-cd3ζ，其基因结构示意图如图2所示，该her2-car基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seq id no.4所示，该连接过程是委托基因合成公司按照基因工程常规方法合成获得；
63.(3)慢病毒表达载体的构建：将人工合成il-12基因连接到pgmlv质粒(genomeditech公司)上，构建得到il-12慢病毒表达载体，即pgmlv-il-12；将人工合成her2-car基因后连接到lenti质粒(genomeditech公司)上，构建得到her2-car慢病毒表达载体，即lenti-her2-car。该连接过程是委托基因合成公司按照基因工程常规方法合成获得，质粒图谱如图3-4所示。
64.实施例2
65.本实施例提供了her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法中的慢病毒的包装和滴度的测定步骤，具体为：
66.(1)293t细胞培养：慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为dmem(含10％fbs)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞；
67.(2)质粒转染：转染前一天，将细胞以合适的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到70％-80％时准备转染。转染前1-2h将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12ml/10cm皿，取无菌的1.5ml ep管或15ml离心管，慢病毒表达质粒为pgmlv-il-12和lenti-her2-car，分别单独包装，转染体系见表1：
68.表1转染体系
[0069][0070]
混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于co2培养箱中培养，转染10-12h后，均匀滴加100
×
enhancing buffer促进转染，100μl/皿；
[0071]
转染18-20h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml新鲜的细胞培养基继续培养。
[0072]
(3)病毒收集浓缩：换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，4500g离心5min，上清液用0.22μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4℃，4500g，离心10min，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，最后一次4℃，4500g，离心20min，此时可见滤器上层中的液体即为病毒浓缩液，将病毒分装后保存于-80℃。
[0073]
(4)滴度的测定：
[0074]
将293t细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含10％fbs的细胞培养基。细胞胰酶消化计数后，按照每孔2
×
105细胞接种12孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至20-40％的融合密度；感染前1-2h将需要感染的细胞换成新鲜的培养基，0.91ml每孔，聚凝胺(polybrene)浓度为1μg/ml。第二天，对12孔板当天转染时，将保存于-80℃冰箱中慢病毒液冰浴融化，用含有10％fbs的细胞培养基进行10倍梯度稀释：选取所需的细胞孔，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，取90μl加入每孔细胞中，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养，采用已知滴度的病毒作为对照病毒。第三天，去除含慢病毒的培养液，加入1ml的完全培养基；4天后，抽提rna做rt-qpcr。加入不同病毒量的细胞样品，通过比较对照组标准曲线和试验组的ct值差异判断滴度值。
[0075]
测定结果表明：本实施例慢病毒包装均可获得滴度约为1
×
108tu/ml的il-12慢病毒和her2-car慢病毒。
[0076]
实施例3
[0077]
本实施例提供了her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的制备方法中的增强型抗肿瘤nk-92细胞的构建步骤，具体为：
[0078]
(1)培养基
[0079]
nk-92细胞采用完全培养基，其包括以下组分：
[0080]
alpha mem培养基、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、0.1mmβ-巯基乙醇、0.02mm叶酸以及100u/ml il-2；
[0081]
(2)构建步骤
[0082]
慢病毒的感染：nk-92细胞采用完全培养基，按照1.5
×
105cell/ml密度2-3天传代一次，37℃，5％co2培养箱中培养，离心收集nk-92细胞，配制5
×
105cell/ml的细胞悬液，24
solution终止反应；
[0098]
(4)终止后10min之内，使用md spectramax m2酶标仪选择波长450nm进行读数并处理数据。
[0099]
检测结果参见图6：从图6所示结果可知，nk-92细和her2-car-nk-92培养上清中il-12和ifn-γ的含量低于试剂盒的检测下限(几乎不表达)，her2-car-il-12-nk-92细胞传代期间上清液中的il-12含量平均值为1.79ng/ml，ifn-γ含量平均值为8.72ng/ml，该检测结果进一步证明了her2-car-il-12-nk-92细胞构建成功且具有增强型抗肿瘤的潜能。
[0100]
实施例6
[0101]
本实施例提供了her2靶向的增强型抗肿瘤nk细胞的体外细胞杀伤试验，具体为：
[0102]
(1)靶细胞选择：
[0103]
sk-br3细胞，即人乳腺腺癌细胞，该细胞贴壁生长，且高表达her2基因。calcein acetoxymethy1酯(calcein-am，钙黄绿素)是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，离心清洗细胞后荧光显微镜拍照观察杀伤效果。
[0104]
(2)体外细胞杀伤试验：
[0105]
(2-1)靶细胞sk-br3的标记：采用索莱宝公司(货号ca1630)《calcein-am_pi活细胞_死细胞双染试剂盒》中的calcein-am，参照说明书，配制清洗缓冲液和染色工作液。sk-br-3细胞胰酶消化后用清洗缓冲液充分清洗细胞2次以充分去除残留的酯酶活性，然后制备密度约为1
×
106cell/ml细胞悬液。取100μl染色工作液加入200μl细胞悬液内，混匀，37℃水浴孵育30min，标记后用清洗缓冲液清洗细胞2遍以去除多余的染色液。
[0106]
(2-2)效-靶细胞作用：平底96孔培养板中，加入1
×
105cell/ml sk-br3靶细胞100μl，按e/t比例10/1加入效应细胞100μl/孔，并设置sk-br3靶细胞对照孔。效应细胞分为三个组，分别为nk-92组、her2-car-nk-92组、her2-car-il-12-nk-92组。
[0107]
(2-3)96孔板置于37℃，5％co2培养箱孵育过夜后，1500rpm，5min后收集上清，用于ifn-γ的含量检测，细胞用pbs清洗2遍后轻轻震荡混匀后荧光显微镜下拍照观察。
[0108]
实验结果：杀伤活性结果如图7所示，her2-car-il-12-nk-92细胞对sk-br3细胞的杀伤活性最显著，明显高于her2-car-nk-92和nk-92细胞。杀伤试验上清中ifn-γ含量如图8所示，her2-car-il-12-nk-92细胞组(9333.7pg/ml)远高于her2-car-nk-92组(28.2pg/ml)和nk-92细胞(7.8pg/ml)，间接证明了her2-car-il-12-nk-92细胞对肿瘤的杀伤潜能。
[0109]
实施例7
[0110]
本发明对il-12慢病毒和her2-car慢病毒moi值进行了筛选试验，具体如下：
[0111]
(1)il-12慢病毒moi的筛选与确定
[0112]
为了确定il-12慢病毒的moi的范围共进行了两次瞬时感染实验，具体地：
[0113]
实验一：离心收集nk-92细胞，用完全培养基稀释接种于96孔板中；根据接种的细胞数量和不同的moi值(0、10、20、40、80)加入不同体积的il-12慢病毒，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene，置于37℃，5％co2培养箱中培养；48h后更换新鲜的完全培养基0.5ml并观察细胞生长状态，再培养72h后收集培养上清。
[0114]
实验二：离心收集nk-92细胞，用完全培养基稀释接种于24孔板中；根据接种的细胞数量和不同的moi值(0、2、5、10)加入不同体积的il-12慢病毒，并加入终浓度为8μg/ml的
polybrene，置于37℃，5％co2培养箱中培养；48h后更换新鲜的完全培养基2ml并观察细胞生长状态，再培养72h后收集培养上清，其中，培养上清中ifn-γ和il-12的含量检测方法同实施例5。
[0115]
实验结果：il-12慢病毒瞬时感染nk-92细胞培养上清中il-12和ifn-γ的浓度数据如表2所示：
[0116]
表2il-12慢病毒感染nk-92细胞培养上清中il-12和ifn-γ的浓度
[0117][0118]
由表2中数据可知，随着moi的增加，il-12的表达量呈梯度增加，但ifn-γ的量无明显梯度变化，推测原因是il-12的量刺激nk-92细胞产生ifn-γ是过饱和的状态。另外通过光学显微镜观察发现，过高的moi值(＞40)加入慢病毒对细胞的生长状态也会有影响(如nk-92散细胞较多，结团松散)，也会间接影响ifn-γ的表达。因此根据细胞生长状态和il-12的表达量共同确定moi的范围为10-40。
[0119]
(二)her2-car慢病毒moi的筛选与确定
[0120]
采用不同her2-car慢病毒的moi进行了两次实验，即分别根据接种的细胞数量和不同的moi值(0、20、100、200)加入不同体积的car-nk慢病毒，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene，置于37℃，5％co2培养箱中培养；48h-72h后观察细胞状态并收集细胞进行流式细胞仪检测，检测方法同实施例4。
[0121]
实验结果：如图9所示，随着moi的增加，car-nk阳性细胞率也随之增加，显微镜下观察细胞状态无明显差异。moi＝20即可获得阳性的her-car细胞，但高的car阳性细胞率更有利于后期分选和治疗，因此，确定her2-car慢病毒moi的范围为20-200。