一种以复制缺陷腺相关病毒为载体的新型冠状病毒疫苗

1.本发明涉及一种重组新型冠状病毒疫苗，目的在于预防新型冠状病毒疫情。本发明属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：：2.2019新型冠状病毒，即sars-cov-2(也被称为2019-ncov)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。sars-cov-2属于冠状病毒科β属，与2003年的sars-cov和2012年的中东呼吸综合征cov(mers-cov)属于同一科属，是第七个可以感染人的冠状病毒(cov)。研究表明2019-ncov通过病毒表面刺突蛋白(spike，s蛋白)的受体结合域(receptorbindingdomain，rbd)结合宿主细胞表面受体血管紧张素2(angiotensinconvertingenzyme2，ace2)与跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembraneserineproteinase2，tmprss2)，经受体介导途径入胞，进行病毒复制扩增。根据世界卫生组织的全球疫苗概览，covid-19候选疫苗通常分为三个大类七种策略：第一，在体外产生靶抗原的蛋白质疫苗，包括灭活病毒疫苗、病毒样颗粒和蛋白质亚单位疫苗；第二，将编码病毒抗原的基因传递给宿主细胞进行体内生产的核酸疫苗，如病毒载体疫苗、dna疫苗和mrna疫苗；第三，结合基于蛋白质和基于核酸的方法在体外和体内生产单一抗原或多种抗原，通常以减毒活疫苗为代表。尽管现有的疫苗技术路线在控制covid-19大流行的过程中发挥着重要，但上述疫苗具有需要严苛的保存和运输条件，频繁的加强针，急性不良反应以及长效性保护缺乏等缺点，均需要进一步优化。因此，制备一种具备长久保护效力、不良反应轻、保存运输便利的疫苗仍然是广大科研工作者以及全人类所孜孜以求的。本发明的目的就是提供一种安全长效的单剂重组新型冠状病毒疫苗。技术实现要素：3.研究表明sars-cov-2病毒表面s蛋白的rbd是病毒入侵宿主的关键，其作用相当于打开宿主细胞保护屏障的“钥匙”。因此，s蛋白也是当前众多疫苗开发的重要靶点。疫苗通过训练机体产生具备中和s蛋白活力的特异性抗体，阻断病毒s蛋白与受体的结合，降低组织器官的病毒载荷，从而实现保护作用。然而，研究发现相较于s蛋白全长，基于rbd的疫苗能诱发更有效的中和抗体(neutralizingantibodies，nabs)，达到中和聚焦的效果，且抗体结合表位多样化。尽管基于s蛋白全长的疫苗诱导抗体库更具多样性，但是大部分有效抗体靶向rbd，靶向其他结构域的抗体中和活性弱甚至没有活性。同时，基于rbd和s全长疫苗具有不同的bcr特征，基于rbd的疫苗能降低由中和活性弱甚至没有的抗体介导的抗体依赖增强症的风险，且rbd在突变株间相对保守，因此，这就意味着基于rbd疫苗或应对突变株可能更有效。可见，rbd是2019新型冠状病毒疫苗设计的理想靶点。然而，单一的rbd蛋白无法引起有效的机体免疫应答，现有基于rbd疫苗通常需要额外引入佐剂以提高其免疫原性。4.基于上述rbd的限制，本发明首先提供了一种用于编码新型冠状病毒的rbd三聚体融合分子佐剂的优化的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列如seqidno:1所示。同时，为了提高抗原表达效率，在顺式质粒载体上，本发明选用哺乳动物强表达启动子cag作为抗原表达框的启动子。5.其次，腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)是一种无包膜的单链dna病毒，由直径约26nm的二十面体蛋白衣壳和约4.7kb的单链dna基因组构成。衣壳包含vp1(分子量约87kda)、vp2(分子量约73kda)和vp3(分子量约61kda)三种亚基，共有60个拷贝，以1:1:10的比例组成。aav是目前基因治疗领域公认最安全、应用最为广泛、最受关注的病毒载体。仅截止到2019年，全球aav相关的独立临床试验注册数目已达到149项，而近两年这一数字仍在持续激增。由于aav具有感染谱广、携载基因可长期表达、载体安全性高等特点，使得aav具备成为一种新型的病毒类安全长效疫苗递送载体。尽管基于aav的疫苗研究在过去一直被忽视，近年来随着aav相关研究的深入以及免疫学知识的拓展，研究者发现给药途径、aav血清型、携载基因编码产物在亚细胞水平的定位以及衣壳特异性免疫反应等因素均能够显著影响宿主对携载基因的特异性免疫应答类型、强度以及相关副反应。本发明的多核苷酸以复制缺陷型6型腺相关病毒为载体，以整合腺病毒e1基因的aav293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺相关病毒载体，并将其用于制备治疗预防2019新型冠状病毒疫苗中的应用。6.本发明还提供了含有上述多核苷酸的载体，优选为顺式质粒载体。7.在一个优选的实施方案中，所述顺式质粒载体为paavcag-mcs。8.本发明还提供一种多核苷酸的复制缺陷型重组腺相关病毒，其包含一种编码2019新型冠状病毒spike蛋白受体结合域的多核苷酸。本技术还提供一种包含一种编码2019新型冠状病毒spike蛋白受体结合域的多核苷酸的载体，其包含复制缺陷型重组腺相关病毒，所述复制缺陷型重组腺相关病毒为血清型6，所述人复制缺陷型重组腺相关病毒包含编码2019新型冠状病毒rbd蛋白的多核苷酸，其序列如seqidno:1所示，663号位丝氨酸(s)突变为缬氨酸(v)的6型复制缺陷型重组腺相关病毒衣壳，其序列如seqidno:2所示，突变后能够提高其对机体免疫细胞的转染效率，优选的免疫细胞为树突状细胞，更优选为bmdc。9.本技术还提供了一种包含上述多核苷酸的复制缺陷型重组腺相关病毒的制剂，所述复制缺陷型重组腺相关病毒被制备为注射剂、滴鼻剂或喷雾剂。在一个更为优选的实施方案中，所述制剂为肌肉注射剂。10.本发明还提供了上述复制缺陷型重组腺相关病毒在制备治疗预防新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。11.同时，本发明还提供了一种制备上述的可表达新型冠状病毒s蛋白rbd三聚体蛋白的复制缺陷型重组腺相关病毒s663v-rbd的方法，所述方法包括以下步骤:12.(1)构建含有编码2019新型冠状病毒s蛋白rbd三聚体的多核苷酸的顺式质粒载体；13.(2)构建含有663号位丝氨酸(s)突变为缬氨酸(v)的衣壳质粒载体；14.(3)将步骤(1)与步骤(2)所述质粒载体与辅助质粒一起转染入宿主细胞；15.(4)培养步骤(3)所述宿主细胞；16.(5)收获从步骤(3)所述细胞中释放的复制缺陷型重组腺相关病毒；17.(6)对步聚(5)中的培养产物进行纯化aav-optrbd(命名为s663v-rbd)重组腺相关病毒。18.优选的，步骤(1)所述顺式质粒载体为paavcag-mcs。19.优选的，步骤(2)所述衣壳质粒载体为重组腺相关病毒为血清型6，优选的为paav2/6，更选优的，为paav2/6s663v。20.优选的，步骤(3)所述骨架质粒为paddeltaf6。21.优选的，步骤(3)所述细胞为aav293细胞。22.优选的，步骤(6)所述纯化方法为亲和层析法，优选的为porostmcaptureselecttmaax亲和层析法。23.本发明提供的可表达新型冠状病毒rbd蛋白三聚体的重组腺相关病毒(s663v-rbd)作为新型冠状病毒疫苗，取得了预料不到的免疫效果，其在小鼠模型上均具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。同时，在多种假病毒的中和效果实验结果显示，本发明的上述疫苗单次免疫s663v-rbd28天后能够产生相较于上市灭活疫苗bbibp-corv更高水平的中和抗体滴度，且维持高水平中和抗体滴度超过10周无明显降低。同时，利用报告基因luciferase考察病毒携带基因表达持久性发现，该重组疫苗可稳定表达超过300天。综上，本发明的该疫苗能够对2019新型冠状病毒产生强大且持久的免疫保护效果。此外，s663v-rbd能够克服预存抗体中和抗体的影响，有利于提高受试者范围。同时，该疫苗在4℃能保存超过35天，其感染活力仍无明显降低，有益于运输储存，大大减少了运输成本。附图说明24.图1.顺式质粒paavcag-optrbd(a)与paav2/6s663v图谱(b)。25.图2.三聚体蛋白细胞内表达与分泌westernblot鉴定图谱。26.图3.重组腺相关病毒表征。银染图(a)与透射电镜图(b)。27.图4.小鼠肌肉注射免疫不同剂量wt-rbd第14天血清igg抗体水平比较图。28.图5.小鼠肌肉注射免疫s663v-rbd\wt-rbd\bbibp-corv第28天到70天血清igg、igg1、igg2a抗体水平比较图。29.图6.小鼠肌肉注射免疫s663v-rbd\wt-rbd\bbibp-corv第28天到70天血清igg2a/igg1抗体水平比较图。30.图7.小鼠肌肉注射免疫s663v-rbd\wt-rbd\bbibp-corv第28天到70天血清野生型(wt)假病毒中和抗体水平(a)，lambda假病毒中和抗体水平(b)以及delta假病毒中和抗体水平(c)比较图。31.图8.小鼠肌肉注射免疫s663v-rbd\wt-rbd\bbibp-corv第70天不同引流淋巴结内生发中心(gc)反应(a)与脾记忆t细胞(b)比较图。32.图9.小鼠肌肉注射免疫s663v-rbd\wt-rbd\bbibp-corv第70天诱导产生的细胞内因子阳性t细胞(a)与脾上清分泌型细胞因子浓度(b)比较图。33.图10.小鼠肌肉注射免疫s663v-rbd\wt-rbd\bbibp-corv第70天脾细胞mhci类肽刺激ifnγelispot斑点数。34.图11.肌肉给药免疫应答长效性预测。35.图12.小鼠主要器官(a)与注射部位(b)切片he染色分析。36.图13.免疫小鼠血常规检测。37.图14.小鼠肺部给药免疫应答考察。38.图15.小鼠滴鼻给药目的基因表达动力学考察。39.图16.重组病毒储存稳定性体内与体外考察。40.图17.重组病毒受预存抗体的影响。实验方案简略图(a)，衣壳免疫反应(b)，以及预存抗体存在条件下，抗原特异性抗体滴度(c)。具体实施方式41.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。42.实施例1.以6型复制缺陷腺相关病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗的制备43.1.rbd三聚体蛋白基因优化及合成。44.重组新型冠状病毒疫苗的目标抗原为新型冠状病毒毒株(genebank编号：nc_045512.2)的rbd，为s蛋白氨基酸序列330至583位。本发明通过对rbd基因进行设计优化，提高rbd的表达水平和rbd三聚体的稳定性，从而提高了疫苗的免疫原性。45.首先，我们在蛋白n端引入组织纤溶酶原激活物信号肽tpa，并在翻译起始密码子前面加入kozak序列，以进一步提高rbd蛋白的表达和分泌。其次，为了更好地模仿s蛋白rbd天然的三聚体结构，在蛋白c端嵌入t4噬菌体纤维蛋白来源的三聚化结构域，并以gsglinker进行连接。再次，基于亚单位疫苗的“抗原 佐剂”设计理念，进一步加强免疫效果，在三聚体结构域c端引入了lps类似物，toll样受体4(tlr4)激动短肽rs09，使之能够与三聚体抗原时刻发挥协同效应。最后，综合考虑trna使用效率、mrna二级结构等影响蛋白翻译效率的多种因素进行密码子优化。同时为了增强mrna的稳定性，我们适当地提高了rbd基因的gc含量，并将g、c核苷酸在整个gp基因中尽可能地均衡分布。其次，为了进一步提升rbd的表达水平，我们在组织纤溶酶原激活物信号肽tpa的翻译起始密码子前面加入kozak序列。rbd基因经过我们的优化设计之后，在整个序列上游插入酶切位点bamhi，下游插入酶切位点hindiii，对基因序列进行合成。rbd基因优化设计的序列(酶切位点为bamhi和hindiii)见seqidno:1。46.2.载体构建和rbd体外表达鉴定47.2.1载体构建48.以上合成的基因序列，分别用bamhi和hindiii进行双酶切，回收目的基因片段，将其连接至paavcag-mcs顺式质粒(addgene)，转化stable3感受态，涂布amprlb平板，挑单克隆进行菌落pcr鉴定，并对pcr鉴定为阳性的克隆进行测序验证。rbd基因优化后的质粒记为paavcag-optrbd。paavcag-optrbd质粒图谱如图1a所示。49.同时，利用pcr点突变技术，将paav2/6质粒编码衣壳的663位由丝氨酸(tca，serine)突变为缬氨酸(gta，valine)，转化stable3感受态，涂布amprlb平板，挑单克隆进行菌落pcr鉴定，并对pcr鉴定为阳性的克隆进行测序验证。衣壳优化后的质粒记为paav2/6-s663v。paav2/6-s663v质粒图谱如图1b所示。6型衣壳氨基酸序列见seqidno:2。50.2.2三聚体rbd的体外表达鉴定51.使用pei40000(polyscience)将paavcag-optrbd质粒转染至aav293细胞，48小时后收集细胞与培养上清液进行westernblot(wb)检测。实验方法如下：转染：aav293细胞按6×105细胞/孔接种于6孔板，于37℃、5％co2细胞培养箱中培养过夜。转染前2小时，将培养基换成新鲜的含10％fbs的dmem培养基，每孔2ml。转染时，每个转染孔取对应质粒3μg，加入到200μl无fbs的dmem培养基中，混匀，加入转染试剂pei40000(4μl(1mg/ml)，涡旋15秒混匀，室温静置15分钟。然后，将质粒转染混合液按上述质粒计量加入6孔板中，混匀。细胞于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育6小时，再将上述含质粒的培养基换成新鲜的含8％fbs的dmem培养基，48小时后收集培养上清与细胞，制备样品，进行wb检测。52.样品制备：转染48小时后，收集培养基，用预冷pbs润洗细胞2次。加入200μlripa缓冲液(含1％pmsf蛋白酶抑制剂)，冰浴15分钟裂解细胞，再4℃12000rpm离心15分钟，取上清液。取一份上清液分别加入50μl含有和不含有β-巯基乙醇的5×sds-page上样缓冲液，95℃加热5分钟，冻存备用；取另一份上清液加入不含有β-巯基乙醇的5×sds-page上样缓冲液；培养上清液与细胞裂解上清液作相同处理，用于wb检测。53.westernblot检测：使用10％sds-page胶进行电泳，每孔上样量为25μl。电泳条件：70v，25分钟；140v，1小时。将sds-page胶上的蛋白质通过电转仪转移到pvdf膜上，电转条件为300ma，1.5小时。电转完成后，将pvdf用5％脱脂奶粉封闭1小时，然后以1:2000的稀释度加入抗s蛋白鼠单克隆抗体(义翘神州，货号40591-mm42)，4℃摇床60rpm孵育过夜。将膜用wb洗涤液洗涤3次，每次于摇床上摇动10分钟。然后加入以1:20000稀释于5％脱脂奶粉的hrp标记的羊抗兔igg抗体(thermoscientific,31430)，室温孵育1小时。用wb洗涤液将膜洗涤3次，使用immobilontmwesternchemiluminescenthrpsubsrate(millipore,cat#wbkls0500)进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。54.结果如图2所示，其中1：转染paavcag-optrbd细胞，不加β-巯基乙醇；2:转染paavcag-optrbd培养上清，不加β-巯基乙醇；3：转染paavcag-optrbd细胞，加β-巯基乙醇；4：转染paavcag-optrbd上清，加β-巯基乙醇。可见，通过我们基因优化的序列，成功地实现了rbd三聚体蛋白的胞内表达与分泌。55.3.重组腺相关病毒包装、纯化和鉴定56.3.1重组腺相关病毒包装57.将以上构建好的顺式质粒paavcag-optrbd、辅助质粒paddeltaf6分别与paav2/6或paav2/6-s663v腺相关病毒衣壳质粒，共转染aav293细胞进行重组腺相关病毒的包装。过程如下：58.a)将aav293细胞接种于40个150mm培养皿中，培养基为dmem 10％fbs，置37℃5％co2细胞培养箱中培养过夜。59.b)待细胞生长至融合度为80％时，转染前2小时换用新鲜的含10％fbs的dmem培养基继续培养。取上述质粒按pei40000(polyscience，usa)所附说明书进行转染。具体步骤为：60.(1)取顺式质粒paavcag-optrbd260μg，野生型衣壳质粒paav2/6260μg，辅助质粒paddeltaf6520μg混和均匀；质粒用40ml无血清dmem培养基进行稀释。另备同样一份，其中将野生型衣壳质粒paav2/6替换为paav2/6-s663v，用量不变。61.(2)分别取1.25mlpei40000(1mg/ml)转染试剂加入到稀释于培养基的质粒中，涡旋30秒充分混匀。62.(3)将两份转染试剂和质粒混合物室温放置20分钟，然后各自分别均分至20皿细胞中。63.c)转染16小时后，换10％fbs的dmem培养基继续培养72小时。64.d)按每10皿出毒的细胞收集于离心管，4000rpm离心10分钟，弃上清，用10mlrb缓冲液(1mmmgcl2，50mmtris·cl,ph7.4)重悬病毒，先后置于-80℃冰箱和37℃水浴锅中反复冻融三次。加入benzonase(50u/ml)，37℃水浴酶解1小时。加入0.5％chaps(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐),于摇床37℃，100rpm孵育1小时。随后12000g4℃离心10分钟，收集含病毒的上清液，并用0.45μmpes膜过滤后备用。[0065]3.2重组腺相关病毒纯化[0066]以2ml/分钟流速用平衡缓冲液(pbs,ph7.4)冲洗纯化柱，直至洗脱液在uv280nm吸收峰不再改变。采用porostmcaptureselecttmaax亲和介质分离纯化腺病毒颗粒，将3.1中收集的病毒液以1ml/分钟低速上柱，用平衡缓冲液洗脱至uv280吸收峰至基线。随后，洗脱液(50mm柠檬酸，50mm柠檬酸钠，ph3.0)2ml/分钟进一步洗脱，在uv280nm出现明显的吸收峰，即为含纯化病毒的洗脱液，立即加入中和缓冲液(1mtris，ph10.0)以中和病毒纯化液。将表达rbd蛋白的野生型衣壳重组病毒记为wt-rbd，将表达rbd蛋白的衣壳s663v突变重组病毒记为s663v-rbd。[0067]此外，为方便实验更好地开展与结果展示，本文引入报告基因luciferase携载顺式质粒paav-cag-luc(addgene，货号83281)与gfp携载顺式质粒paav-cag-gfp(addgene，货号37825)进行报告基因携载重组病毒包装纯化，其包装纯化方法同上述一致，将野生型重组病毒分别记为wt-luc与wt-gfp，s663v突变衣壳重组病毒分别记为s663v-luc与s663v-gfp。[0068]3.3重组腺相关病毒滴度与纯度鉴定[0069]3.3.1滴度测定[0070]设计目的基因序列的qpcr特异性引物及探针，序列5’‑3’如seqidno:3至seqidno:11所示。[0071]rbd-f:ttcaacgccacaagattcgc[0072]rbd-r:ttggtgaagcacaggtcgtt[0073]rbd-taqmanprobe：fam-aagaatcagcaactgcgtggccg-bhq1；[0074]luc-f：cgcacatatcgaggtggaca[0075]luc-r：gcaagctattctcgctgcac[0076]luc-taqmanprobe:fam-ttcgagatgagcgttcggctggc-bhq1；[0077]gfp-f：cacatgaagcagcacgactt[0078]gfp-r：tcgtccttgaagaagatggt[0079]gfp-taqmanprobe:fam-agtccgccatgcccgaaggct-bhq1。[0080]病毒预处理：[0081]取10μl病毒液 5μldna酶反应缓冲液 1μldnasei 34μldepc水，于37℃孵育30min后，立即95℃终止5min，结束后立即置于冰上，并按下表制备成不同稀释倍数样品：[0082][0083]标准曲线样品处理：[0084]将携带目的基因的顺式质粒paavcag-optrbd或paavcag-luc，使用bamhi酶进行线性化，经酚氯仿-乙醇沉淀纯化回收后，按如下计算公式，配制成2×109molecules/μl储备液，作为制备标准曲线的样品：[0085][0086]cmol代表质粒分子数浓度单位molecules/μl；cm代表质粒质量浓度单位μg/μl；l代表质粒大小单位bp；na代表阿伏伽德罗常数数值6.02×1023。[0087]随后按下表配制标准曲线各浓度梯度：[0088][0089]反应体系：[0090]总体积20μl。模板5μl，taqmanfastadvancedmastermix10μl(thermo，4444557)，上下游引物、探针终浓度均为0.2μm，剩余体积无酶水补齐。[0091]反应条件(roche，lightcycler96)：[0092]50℃ung酶孵育2分钟，95℃预变性20秒；95℃变性3秒，60℃退火并延伸30秒(获取信号)，共39个循环；熔解程序(默认)。病毒滴度(genomecopies/ml)根据标曲与样品对应稀释倍数求得。wt-rbd，s663v-rbd，wt-luc，s663v-luc，wt-gfp，s663v-gfp滴度分别为3.17×1012gc/ml，3.25×1012gc/ml，1.37×1012gc/ml，1.74×1012gc/ml，1.74×1012gc/ml，2.67×1012gc/ml。[0093]3.3.2病毒纯度鉴定[0094]取10μl待测样品加入2.5μl5×上样缓冲液，于95℃变性10min后，进行sds-page电泳。结束后参考银染试剂盒说明书(碧云天，p0017s)进行银染确定病毒纯度，结果如图3-a所示，泳道内只有代表衣壳蛋白的三条带，分别是60kda左右的衣壳蛋白vp3，75kda左右的衣壳蛋白vp2，以及90kda左右的衣壳蛋白vp1，显示病毒样品的纯度。取15μl待测样品进行磷钨酸负染，透射电镜拍摄病毒形态，结果如图3-b所示，显示病毒纯度高，且空壳率低。[0095]实施例2.构建的不同重组腺病毒在小鼠模型上的免疫学评价[0096]1.疫苗最佳免疫剂量筛选[0097]16只spf级雌性balb/c小鼠(6-8周龄)，随机分成4组，每组4只。根据表1所示分组情况对小鼠进行wt-rbd(野生型衣壳)免疫。肌肉注射方式为后大腿腓肠肌注射50μl。[0098]表1.疫苗体液免疫反应检测小鼠分组情况[0099]分组剂量数量pbs-4低剂量wt-rbd2×1010gc4中剂量wt-rbd6×1010gc4高剂量wt-rbd1×1011gc4[0100]小鼠免疫14天后采血，分离血清，使用elisa法检测血清中针对新型冠状病毒rbd蛋白的igg、igg1、igg2a抗体滴度。wt-rbd肌肉注射诱导产生的血清igg抗体水平呈现明显的剂量依赖关系，剂量越高，血清igg抗体水平越高。检测结果如图4所示，高剂量组产生最佳的抗体免疫水平。同时，根据体重换算小鼠的高剂量(约5×1012gc/kg)，这一剂量水平低于在腺相关病毒相关的临床试验中常见剂量，所以采用这一剂量进行后续实验考查。[0101]2.体液免疫应答考察[0102]30只spf级雌性balb/c小鼠(6-8周龄)，随机分成5组，其中wt-gfp(即wtvector)组、s663v-gfp(即s663vvector)组作为阴性对照组，wt-rbd组、s663v-rbd组作为实验组，上市灭活病毒疫苗bbibp-corv作为阳性对照组，每组6只，具体免疫情况如表2所示，其中肌肉注射方式为后肢腓肠肌注射50μl。此外，为了与bbibp-corv临床前研究文献公开的内容保持一致(wang,h.,etal."developmentofaninactivatedvaccinecandidate,bbibp-corv,withpotentprotectionagainstsars-cov-2."cell182.3(2020).)，阳性组bbibp-corv采用了其文献中记载的腹腔注射方式给药，剂量为1/2成人剂量,即2μg。[0103]表2.疫苗体液免疫反应比较考察小鼠分组情况[0104][0105]免疫后，在设定时间点对小鼠进行采血，分离血清，使用elisa法检测血清中针对新型冠状病毒rbd蛋白的igg、igg1、igg2a抗体滴度，实验结果如图5所示。小鼠完成两剂腹腔注射bbibp-corv后，在初次免疫后的第28天抗体血清igg、igg1、igg2a抗体滴度平均值迅速激升至5以上，但随后各抗体滴度随着时间推移呈下降趋势，且igg2a下降趋势最为明显；与bbibp-corv相比，单次注射wt-rbd在初次免疫后的第28天能产生与bbibp-corv相当的抗体滴度水平，但不同的是wt-rbd引起的体液免疫应答水平始终保持在高水平状态，且在第42天略有增长。值得注意的是，单次注射s663v-rbd在各组间展现出了最强的免疫应答，第70天时，其诱导的igg水平大约是wt-rbd的3倍，bbibp-corv的8倍(图5)。此外，wt-rbd与s663v-rbd两组的igg2a/igg1比值均在0.33-3.0以内，表明重组腺相关病毒疫苗能够引起比较均衡的免疫应答，如图6所示。(ns,p≥0.05；*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001)[0106]3.wt-rbd疫苗、s663v-rbd疫苗与bbibp-corv假病毒中和能力考察[0107]取各组各时间点血清，分别与野生型、delta、lambdasars-cov2假病毒进行中和抗体滴度测定，结果显示,各组在各个时间点的中和活力与血清igg抗体水平呈正相关。野生型假病毒在初始免疫后第28天，bbibp-corv组与s663v-rbd组中和能力相当，wt-rbd组略低。随着时间的延长，bbibp-corv组中和抗体滴度水平逐渐下降。与之相反，wt-rbd组与s663v-rbd组中和抗体滴度均在42天左右才升至高峰，并维持这一水平至70天。其中，在第70天时，s663v-rbd中和抗体滴度大约是wt-rbd的3倍，bbibp-corv的6倍(图7-a)。delta、lambda假病毒中和试验中，各组的中和活力均有所下降，但趋势与野生型假病毒试验结果一致，bbibp-corv随时间推移逐步下降，wt-rbd与s663v-rbd中和抗体滴度稳中有升，且s663v-rbd展现出更优的中和活力(图7b&c)。(ns,p≥0.05；*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001)[0108]4.脾与淋巴结免疫反应检测[0109]4.1引流淋巴结生发中心考察[0110]摘取小鼠注射部位同侧的腘窝淋巴结与腹股沟淋巴结，分别制成单细胞悬液，加入细胞表面分子标志物进行染色，细胞表面标志物包括cd19、gl7、b220。生发中心实验结果如图8a所示，在腘窝淋巴结内，相较于wt-rbd与bbibp-corv，s663v-rbd可诱导其免疫小鼠产生最高丰度的生发中心b细胞，具有显著性差异。此外，wt-rbd则能产生相当于bbibp-corv的生发中心反应。[0111]4.2脾记忆t细胞免疫应答考察[0112]免疫后第70天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用10ug/ml的rbd蛋白与其mhci肽(见seqidno:12cygvsptkl)刺激72小时，收集细胞进行表面分子染色，细胞表面标志物包括cd4、cd8、cd44以及cd62l，使用流式细胞仪分析各组中心记忆t细胞(tcm)水平，其中tcm定义为cd44 cd62l 。脾细胞培养上清液中细胞因子分泌记忆t细胞分析结果如图8b所示，s663v-rbd则可以产生最强的中心记忆t细胞水平，而wt-rbd与bbibp-corv可诱导产生相当的中心记忆t细胞水平。(图8bns,p≥0.05；*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001)[0113]4.3脾细胞内因子染色与上清细胞因子分泌[0114]同4.2所述，使用10ug/ml的rbd蛋白与其mhci肽(cygvsptkl)刺激脾细胞6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，对细胞表面分子标志物染色，细胞经固定和穿孔后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括cd4与cd8，细胞内细胞因子包括ifnγ、tnfα、il4和il2。使用流式细胞仪(bdfacsfacscelesta)分析cd4 t细胞和cd8 t细胞经特异性肽刺激后ifnγ、tnfα、il4和il2的表达水平。结果如图9a所示，可见，s663v-rbd能够诱导其免疫小鼠产生明显的免疫反应。其中，cd8 t细胞，s663v-rbd表达的ifnγ和il2水平均显著高于wt-rbd与bbibp-corv(p《0.05)。与此同时，相比于wt-rbd，s663v-rbd可诱导产生更高水平的cd8 tnfα 和cd4 il4 细胞。对于上清细胞因子分泌，同上所述使用rbd蛋白与mhci肽刺激分离的小鼠脾细胞72小时后，收集培养上清液，测定其中ifnγ、tnfα、il4、il6、il12以及il17a的含量。结果如图9-b所示，相较于bbibp-corv，s663v-rbd可诱导其免疫小鼠产生更高水平ifnγ、tnfα、il4、il6以及il17a。相较于wt-rbd,s663v-rbd可诱导其免疫小鼠产生相当水平的tnfα与il4，以及更高水平的ifnγ、il6以及il17a。(ns,p≥0.05；*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001)[0115]4.4elispot细胞免疫应答考察[0116]仅使用rbdmhci表位肽刺激4.1所分离的脾细胞24小时，使用ifnγelispot检测试剂盒(dakewe)测定各组产生的ifnγ特异性斑点数。结果如图10所示，相较于bbibp-corv，wt-rbd与s663v-rbd均可产生更多斑点，其中s663v-rbd产生的斑点数最多，说明s663v-rbd免疫后可产生最强的细胞免疫应答。(ns,p≥0.05；*,p《0.05；**,p《0.01；***,p《0.001；****,p《0.0001)[0117]5.抗原表达动力学预测[0118]大量的临床前与临床数据表明，aav能够表达携载基因超过数月甚至数年。因此，通过报告基因，将表达基因可视化以预测疫苗作用持续时间。结果如图11所示，wt-luc与s663v-luc均能持续表达超过270天，同时s663v在相同剂量下能提高2倍左右的表达量，结合上述wt-rbd与s663v-rbd的持久免疫数据，这一结果表明s663v-rrd能够产生强大且持久的特异性免疫应答。(*p《0.05)[0119]6.安全性评价[0120]尽管基于aav载体的药物已有3款上市，同时大量的临床及临床前研究表明aav是目前最安全的病毒载体，本实施例中仍对免疫小鼠的主要器官及注射部位进行组织学考察，结果如图12a&b所示，除注射部位有轻度发炎，主要器官未见任何异常。此外，对免疫超过70天的小鼠进行血常规检测，结果如图13所示，各组小鼠未见异常。综上，初步的安全性评估表明aav疫苗是安全的。[0121]实施例3.不同给药途径重组腺病毒在小鼠模型上的免疫学评价及探索[0122]1.肺部气管内给药体液免疫应答检测[0123]12只spf级雌性balb/c小鼠(6-8周龄)，随机分成2组，每组6只。实验组按每只小鼠2×1010gc(30μl)s663v-rbd，使用气管内喷雾装置进行肺部免疫。对照组按每只小鼠30μlpbs同样方式给药。[0124]小鼠于免疫后第14天和第28天采血，分离血清，使用elisa法检测血清中针对新型冠状病毒rbd蛋白的igg、igg1、igg2a抗体滴度。结果如图14所示，肺部给药同样能够引起强烈的体液免疫应答。[0125]2.滴鼻给药可行性考察[0126]3只spf级雌性balb/c小鼠(6-8周龄)，对小鼠进行s663v-luciferase滴鼻给药，给药方式为左右鼻孔各10μl(1×1010gc)，间隔10分钟。给药后第3天开始，在给定时间节点给予底物d-荧光素钾盐，检测给药部位发光信号强度及维持表达的周期。结果如图15所示，鼻腔给药能够维持转基因表达超过30天，表明鼻腔免疫同样具备面免疫潜能。[0127]实施例4.重组腺病毒储存稳定性考察[0128]将wt-luc与s663v-luc病毒储存于2-8℃环境，放置10天、20天、35天后。每个时间节点使用上述病毒对balb/c小鼠(6-8周龄)进行免疫，每组3只spf级雌性balb/c小鼠给药方式肌肉注射50μl(1×109gc)。给药后第7天检测各组给药部位的发光信号，结果表示在储存35天后，病毒体内感染能力未明显下降，结果如图16所示，表明突变载体与野生型载体同样具备较好稳定性。[0129]实施例5.重组腺病毒受预存中和抗体影响考察[0130]预存中和抗体对病毒载体类药物有着显著影响，本实施例中，通过人为实验设计来模拟这一因素对本文疫苗的影响。首先，16只spf级雌性balb/c小鼠(6-8周龄)，免疫时间如图17a所示，免疫分组情况如表3所示：[0131]表3预存抗体影响考察小鼠分组情况[0132][0133]结果表明，wt与s663v产生相当水平的中和抗体滴度(图17b)，但wt-rbd显著受到中和抗体影响，产生的rbd特异性抗体滴度显著低于s663v-rbd产生的滴度(图17c)。[0134]总结[0135]综上，本发明的研究结果表明单剂s663v-rbd能够诱导持久强大且均衡的体液与细胞免疫应答，且在免疫后14天，就能够诱导产生较高的抗原特异性抗体滴度，这提示s663v-rbd具备成为一种新型的仅需单次注射即可提供快速强大且长效保护的疫苗潜力。此外，s663v-rbd能够较好的保护宿主细胞免于突变株感染，这提示若与其他策略开发的疫苗进行序贯接种，s663v-rbd具备提供更广谱且强大的突变株保护力。当前第1页12当前第1页12