一种促进豆科作物结瘤尤其是耐盐结瘤的方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种提高豆科作物根瘤数目的方法，以期提高作物的结瘤固氮能力；尤其是提高盐胁迫下大豆耐盐结瘤固氮的能力，从而为大豆产量提升提供保障。


背景技术：

2.大豆（glycine max（l.）merill）源起于中国，因为自身富含约40%的蛋白质和20%的油脂，使其在世界范围内具有很大的经济意义，并且在国民生活中也具有十分重要的作用，是世界上目前最重要的蛋白和油料作物。
3.和其他的重要作物不同，豆科植物的根系能和根瘤菌相互作用形成具有固氮功能的特异器官——根瘤，根瘤可以把大气中的氮气转化为植物可以利用的铵根离子，植物可以为根瘤菌提供碳水化合物和能量，形成生物界独特的共生固氮系统。据统计根瘤共生固氮每年可向农业系统提供约5000万吨氮素营养，为豆科植物的生长提供的氮素占其总需求量的2/3以上，可见根瘤共生固氮对农业可持续发展及对大豆的生长和产量的重要意义，盐胁迫对大豆根系结瘤及根瘤的固氮效率有显著的抑制，如何提高大豆结瘤及固氮过程的耐盐性是挖掘盐碱地种植大豆潜力的重要前提。
4.nac转录因子在植物生长发育和逆境响应中发挥着重要作用。据报道部分nac基因也会参与调控由生长素信号所介导的侧根形成，部分nac基因可以被包括生长素、脱落酸、乙烯在内的多种植物激素和盐胁迫显著诱导，能够促进植物侧根的形成。但是，目前尚未见有关大豆中的gmnac181参与调控大豆根瘤数量，特别是在盐胁迫条件下能够显著提高大豆结瘤的耐盐性，稳定大豆根瘤数量的研究和报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种促进豆科作物结瘤尤其是耐盐结瘤的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
7.序列表中seq id no：1所示核苷酸序列在提高豆科作物根瘤数目上的用途。
8.序列表中seq id no：1所编码的蛋白在提高豆科作物根瘤数目上的用途。
9.包含seq id no：1所示核苷酸序列的重组表达载体或重组菌在提高豆科作物根瘤数目上的应用。
10.提高豆科作物根瘤数目的方法，在植物体内过表达序列表中seq id no：1所示的核苷酸序列或者与seq id no：1具有同种功能的核苷酸序列，获得与野生植物相比根瘤数目增多的转基因植物。
11.作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有seq id no：1所示核苷酸序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体植物根系，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增多的转基因植物；所述过表达载体以pegad为骨架载体；所述过表达载体上连接有35s启动子；对seq id no：1所示的核苷酸序列进行pcr
扩增时，其正向扩增引物如序列表中的seq id no：2所示，其反向扩增引物如序列表中的seq id no：3所示；利用所述过表达载体转化发根农杆菌k599获得转化体，然后再利用发根农杆菌k599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比根瘤数目增多的转基因植物；所述植物为大豆。
12.序列表中seq id no：1所示核苷酸序列在盐胁迫条件下显著增高豆科作物根瘤数目上的用途。
13.序列表中seq id no：1所编码的蛋白在盐胁迫条件下显著增高豆科作物根瘤数目上的用途。
14.包含seq id no：1所示核苷酸序列的重组表达载体或重组菌在盐胁迫条件下显著增高豆科作物根瘤数目上的用途。
15.在盐胁迫条件下显著增高豆科作物根瘤数目的方法，在植物体内过表达序列表中seq id no：1所示的核苷酸序列或者与seq id no：1具有同种功能的核苷酸序列，获得与野生植物相比根瘤数目增多的转基因植物。
16.作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有seq id no：1所示核苷酸序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体植物根系，筛选阳性植株，获得与正常植物相比根瘤数目增多的转基因植物；所述过表达载体以pegad为骨架载体；所述过表达载体上连接有35s启动子；对seq id no：1所示的核苷酸序列进行pcr扩增时，其正向扩增引物如序列表中的seq id no：2所示，其反向扩增引物如序列表中的seq id no：3所示；利用所述过表达载体转化发根农杆菌k599获得转化体，然后再利用发根农杆菌k599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比根瘤数目增多的转基因植物；所述植物为大豆。
17.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的研究发现gmnac181能够增加大豆根瘤数量，与对照组大豆相比，过表达gmnac181的转基因大豆毛状根植株，毛状根根瘤数量明显高于对照组大豆毛状根，当盐胁迫显著减少对照根系根瘤根瘤数目时，过表达gmnac181能够增强大豆结瘤过程的耐盐性，根瘤数目与正常条件下相近。本发明的研究首次证明了大豆中的gmnac181参与调控盐胁迫下大豆根瘤的数量，过表达gmnac181可以显著促进盐胁迫下大豆的根瘤发育，从而明显增加了盐胁迫下大豆的根瘤数量。可以预期，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮以及抗盐胁迫能力，对于提高大豆产量具有重要意义。
附图说明
18.图1为本发明试验结果图。其中，图a为在正常条件与盐胁迫条件下gmnac181过表达毛状根转化植株与野生型对照对比图；图b、c为gmnac181过表达毛状根转化植株与野生型每株大豆根部表达量图；图d为在正常条件与盐胁迫条件下gmnac181过表达毛状根转化植株与野生型每株大豆根部根瘤数量平均值图。
具体实施方式
19.以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常
规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
20.实施例1、大豆gmnac181载体构建1）通过大豆数据库获得gmnac181序列，设计引物，引物序列具体如下：gmnac181-ecor
ⅰ‑
f:ccggaattcatgggaaacccagaatccaattt（seq id no：2）；gmnac181-hind
ꢀⅲ‑
r:cccaagctttccttgaaattgaagatgaggaccaa（seq id no：3）。
21.2）片段扩增提取williams 82大豆rna并利用逆转录酶将其反转为cdna，将此cdna作为模板，用上面所设计的引物进行扩增，得到目的片段。
22.3）将扩增片段连接t载体并鉴定将所扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，将有目的片段的凝胶用刀子切下装入离心管，利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr产物，将回收片段连接blunt3后转化大肠杆菌dh5α，pcr鉴定之后送公司进行测序验证序列是否正确。
23.4）目的片段连接pegad载体将测序正确的大肠杆菌中的质粒提取出来，使用限制性内切酶ecorⅰ和hind
ꢀⅲ
通过酶切酶连的方法将目的片段连接到pegad载体上，转化大肠杆菌dh5α。
24.5）目的片段转化发根农杆菌k599将大肠杆菌dh5α中的带有目的片段的pegad质粒提取出来，转化进入农杆菌k599，鉴定正确后保存到-80℃超低温冰箱中待用。
25.实施例2、大豆毛状根转化1）农杆菌接种将带有目的片段载体的发根农杆菌k599在50 ml lb液体培养基（添加卡那霉素、链霉素）中扩大培养，28 ℃下200 rpm培养过夜。4500 rpm下将菌液离心10分钟，弃上清，用液体共培养基（ccm）重悬菌液至od
600
值为0.8左右。
26.2）共培养用已灭菌的解剖刀从离子叶节大约0 .5 cm的下胚轴切下萌发的种子，放入准备好的含有菌液的液体共培养基（ccm）中，在室温下摇床上150 r/min轻摇一小时后将外植体放到固体ccm上，在暗下与农杆菌共培养三天。
27.3）移土将共培养后的外植体移到事先用低氮营养液浸湿的蛭石中并覆膜保湿，移栽六天左右取掉膜。
28.4）接根瘤菌以及盐胁迫处理大豆慢生型根瘤菌（bradyrhizobium diazoefficiens）菌株usda110提前用ty培养液培养至指数生长时期，并用ddh2o稀释至适当密度（od
600
=0.16）。将外植体移栽到用75 mm nacl和usda110（15 ml 150 mm nacl 和 15 ml usda110 od
600
=0.16）处理的蛭石中；对照组移栽到用ddh2o和usda110（15 ml ddh2o和15 ml usda110 od
600
=0.16）处理的蛭石中。
29.5）取样并进行毛状根单根根部数据统计将接菌10天后的外植体取样，将单条毛状根取样，将每条毛状根编好后分为提取dna与rna两份，在取样前统计每条毛状根根瘤数量。
30.6）dna及rna提取将取好的样品利用ctab试剂提取dna，利用bar引物检测鉴定转基因根系，引物序列如下：f: ctacatcgagacaagcacggtcaa（seq id no：4）；r: agaaacccacgtcatgccagttc（seq id no：5）。
31.利用tripure reagent试剂提取阳性毛状根样品的rna。
32.7）反转录及定量检测利用rna逆转录酶将其反转为cdna；利用设计好的基因表达检测引物进行qpcr检测，引物序列如下：f：gaggagcacaagagagcgtt（seq id no：6）；r：catggaggagtctttgagctt（seq id no：7）；将检测成功过表达的材料的单条毛状根根瘤数量进行进一步分析后与对照组进行对比得出结论。
33.结果分析：将过表达gmnac181毛状根材料的单根毛状根根瘤数量与对照组毛状根材料单根毛状根根瘤数量进行分析，结果如图a-d所示，过表达gmnac181的毛状根与对照组毛状根相比根瘤数量明显增多，并且显著促进了盐胁迫的根系结瘤数目增加。
34.综上，本发明的研究首次证明了大豆中的gmnac181参与调控大豆根瘤的数量，过表达gmnac181可以显著促进大豆的根瘤发育，从而明显增加了大豆的根瘤数量，当盐胁迫显著减少对照根系根瘤根瘤数目时，过表达gmnac181能够增强大豆结瘤过程的耐盐性，根瘤数目与正常条件下相近。
35.以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。