陆地棉GhEXO2及其调控株型方面的应用

陆地棉ghexo2及其调控株型方面的应用
技术领域
1.本发明属于棉花种质资源培育和分子生物学技术领域，具体涉及棉花ghexo2(gh_a04g0976)及其调控叶片发育继而影响株型方面的应用。


背景技术：

2.理想株型是高产品质的形态特征。不同作物要求的理想株型不完全相同，但多涉及株高、叶形、叶姿、叶色、叶片的分布以及分蘖和主茎的关系。叶子是植物的主要光合器官，对生长发育有显著影响，并且由于细胞膨胀率的差异而具有惊人的多样性形状。叶子形状的灵活性主要取决于叶缘生长物的大小和排列。
3.然而，植物不同叶形所产生的生理功能却鲜有报道。2003年，拟南芥中首次报道了exordium(exo)基因，该基因在胚以及细胞分裂旺盛的部分高表达，尤其在顶端分生组织和幼嫩的叶片，过表达该基因可以促进植物生长，即莲座叶变大。
4.现有技术中未报道关于陆地棉同源基因ghexo2调控陆地棉叶片发育方面的功能和应用，棉花中该基因功能如何，还未有报道，因此研究exo在棉花叶片发育中的功能，对探究棉花叶片发育机制以及开发理想株型有着重要的意义。


技术实现要素：

5.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种通过首次克隆获得棉花ghexo2基因，并进行表达特性分析，通过转基因技术，在植物(拟南芥和棉花)中验证了该基因的功能，对进一步了解exo的功能，培育棉花理想株型有着重要的实际意义的陆地棉ghexo及其调控株型方面的应用。
6.本发明采取的技术方案如下：本发明一种陆地棉ghexo2(gh_a04g0976)，所述ghexo2基因cds序列如序列表中seq no:2所示，所述ghexo2氨基酸序列如序列表seq no:1所示。
7.本发明还公开了一种陆地棉ghexo2关于调控株型方面的应用，所述ghexo2基因的应用是促进陆地棉叶片发育从而影响株型。
8.在本方案中，利用qrt-pcr技术分析细胞伸长相关基因atagp4、atexp5、atkcs1和atδ-tip在ghexo2转基因植株和wt植株中的表达情况，通过调控atagp4、atexp5、atkcs1和atδ-tip基因的表达，增强了细胞伸长，从而改善了ghexo2转基因植物叶片形状。
9.进一步地，所述atagp4、atkcs1和atδ-tip在3个转基因株系中均上调2-8倍，所述atexp5表达水平上调15-20倍。
10.进一步地，利用vigs技术沉默验证棉花ghexo2基因调控棉花叶片大小以及株高。
11.为了进一步研究ghexo2在棉花叶片形状调控中的作用，利用ptrv系统通过病毒诱导基因沉默(vigs)敲除其表达，验证了ghexo2在棉花中的功能。
12.本方案一种陆地棉ghexo2及其调控株型方面的应用，采用上述结构本发明取得的有益效果如下：
13.1、本发明通过使用过表达载体以及vigs载体，在拟南芥中过表达基因ghexo2，转基因拟南芥叶片比野生型拟南芥的叶片大，其叶面积是野生型拟南芥的两倍多，在中棉所24中利用vigs沉默ghexo2基因，发现沉默植株的叶片明显比对照组中棉所24的叶片小，证明ghexo2在调控棉花叶片发育中的应用。
14.2、通过进一步利用荧光定量发现，在转基因拟南芥中正向调控细胞伸长的相关基因(atagp4、atexp5、atkcs1和atδ-tip)表达水平显著高于对照野生型拟南芥，因此推测该基因能够促进atagp4、atexp5、atkcs1和atδ-tip基因等细胞伸长相关基因的表达从而使植物的叶片变大。
附图说明
15.图1为本方案的ghexo2氨基酸序列；
16.图2为本方案ghexo2核苷酸序列；
17.图3为本方案中ghexo2基因转基因拟南芥叶型表型及其互作分析图；
18.图4为本方案中利用vigs技术验证ghexo2调控叶片发育及株高示意图。
19.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.如图1-2所示，本发明一种陆地棉ghexo2(gh_a04g0976)，所述ghexo2基因cds序列如序列表中seq no:2所示，所述ghexo2氨基酸序列如序列表seq no:1所示。
22.实施例1，如图3所示，ghexo2转基因拟南芥叶型表型鉴定分析以及可能调控网络分析：
23.为了了解ghexo2的生物学功能，通过构建过表达载体在拟南芥中异位过表达ghexo2。
24.引物列表如下表1所示：
25.引物列表1
[0026][0027]
苗期观察表型，发现ghexo2转基因株系与wt植株相比，就像atexo一样，其营养生长增强，测量叶面积，发现ghexo2转基因植株的叶面积明显比wt的大，其是wt植株的两倍多(图3a和b所示)。
[0028]
此外，通过qrt-pcr和半定量rt-pcr分析，再次证实了ghexo2在ghexo2转基因植株中相对表达量较高(图3c和d所示)，说明该基因在转录水平上行使了功能。
[0029]
利用qrt-pcr技术分析细胞伸长相关基因atagp4、atexp5、atkcs1和atδ-tip在ghexo2转基因植株和wt植株中的表达情况。
[0030]
结果表明，与wt相比，在3个独立的ghexo2转基因株系中，所有细胞伸长相关基因的表达量均显著上调(图3e、f、g和h)，其中atagp4、atkcs1和atδ-tip在3个转基因株系中均上调2-8倍。atexp5表达水平上调15-20倍。
[0031]
上述结果表明，ghexo2可能通过调控atagp4、atexp5、atkcs1和atδ-tip基因的表达，增强了细胞伸长，从而改善了ghexo2转基因植物叶片形状。
[0032]
实施例2，如图4所示，利用vigs技术沉默验证棉花ghexo2基因调控棉花叶片大小以及株高：
[0033]
为了进一步地研究ghexo2在棉花叶片形状调控中的作用，利用ptrv系统通过病毒诱导基因沉默(vigs)敲除其表达，验证了ghexo2在棉花中的功能。
[0034]
正如预测的那样，与对照相比，沉默植株中ghexo2表达显著抑制，营养生长减少(图4a)，叶片大小改变(图4b)。
[0035]
统计分析发现，ghexo2沉默植株的三个独立株系的叶面积指数(lai)均显著低于对照(图4e)。qrt-pcr分析表明，与对照相比，观察到的沉默株系中ghexo2的表达显著降低，表明在vigs株系中ghexo2被有效沉默(图4c)。
[0036]
为了深入了解ghexo2沉默植物叶片形态改变的机制，我们对ghexo2沉默植物进行了组织学显微镜分析。从ghexo2沉默植物叶片的显微图像结果可知，与对照的叶片相比，细胞形态小且数量更多，而对照的叶片细胞形态大，但数量少，表明沉默ghexo2抑制细胞伸长，从而减少叶片形态(图4d)。
[0037]
此外，发明人在电子显微镜下测量了沉默植株和对照植株在同一叶面积内的细胞
数量，结果显示，与对照相比，ghexo2沉默的三个株系的细胞数量都显著增加(图4f)。这些发现与之前的研究结果一致，拟南芥过表达ghexo2导致叶片尺寸增大，叶面积指数高于野生型拟南芥。另外，如图4a中，能明细观察到ghexo2基因调节叶片的同时也调节棉花株高。
[0038]
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；
[0039]
所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
[0040]
数据库：cottonfgd(https://cottonfgd.org/)，通过数据库调取ghexo2(gh_a04g0976)序列。
[0041]
拟南芥材料：哥伦比亚野生型(columbia，col-0)，拟南芥植株于温度为21℃，16h光照，8h黑暗环境条件的温室中生长，以用于转基因拟南芥的获得。
[0042]
棉花材料：陆地棉(gossypium hihirsutum)中棉所24(zm24)，vigs实验所用的棉花植株种植于河南郑州温室，在温度为23℃，16h光照，8h黑暗环境。
[0043]
试剂：大肠杆菌感受态：trans1-t1感受态(全式金)；农杆菌感受态：gv3101感受态(上海生工)，同源重组酶、反转录试剂盒，质粒提取试剂盒、基因扩增高保真酶购自大连takara公司。荧光定量试剂盒购买于罗氏公司。多糖多酚植物rna提取试剂盒、胶回收试剂盒及植物dna提取试剂盒购于北京天根生物公司。核酸染液、菌液鉴定pcr mix购于南京诺唯赞公司。抗生素、表面活性剂(silwet-77)、乙酰丁香酮(as)等常规试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。本试验所涉及到的引物均由擎科生物合成。
[0044]
石蜡切片：实验过程中选择同一部位叶片浸泡在faa固定液中，然后用酒精梯度脱水。接着用二甲苯制成透明，再进行石蜡包埋，然后将石蜡包埋的组织横切成10微米厚的切片(莱卡仪器公司，wetzlar，德国)。切片用甲苯胺蓝染色，在莱卡m165fc荧光立体显微镜(莱卡仪器有限公司)下观察。每个样本至少重复三次。
[0045]
叶面积指数计算：利用imagej软件计算。具体如下：将叶片擦拭干净后保存为jpg格式扫描，扫描时注意整个图片扫描为a4大小，方便后期测量；打开imagej软件，file-open，打开拟测量的图片；设置标尺。选择analyze-》set scale。在distance in pixels输入a4宽度的像素值2480，knowndistance输入标准a4纸的宽度21，unit of length输入cm，global复选框打钩(将此标准用于全部图片，也就是说新打开一张图片后不必再设置一次)，点击ok；第一步，image-type-8-bit；第二步，image-adjust-threshold，在threshold下进行图像的背景校正和增强，调整好后apply；第三步，在analysis-set measurements中勾选area(面积)，然后ok；第四步，在analysis-analyzeparticles中选择show-outlines，下面勾选display results，ok，得到的即为叶片的面积。
[0046]
单位面积细胞数目测定：利用imagej软件，在同一倍镜下取相同大小视野，进行细胞计数登记统计。
[0047]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖
非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0048]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
[0049]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。