一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用的制作方法

1.本发明涉及毒素制备技术领域，尤其涉及一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用。


背景技术：

2.河鲀毒素(tetradotoxin，简写为ttx)是小分子量的非蛋白质神经毒素，中毒潜伏期短，死亡率高，毒素吸收后迅速作用于末梢神经和中枢神经系统，使神经传导产生障碍，首先使感觉神经麻痹，而后运动神经麻痹，严重者脑干麻痹导致呼吸循环衰竭。河鲀的表皮、内脏、血液、睾丸、卵巢、肝、脾、眼球等不同组织中含有该河鲀毒素，它是一种剧毒的非蛋白神经毒素。河鲀毒素的分子式为c11h
17
o8n3，分子量为319，该神经毒素经腹腔注射对小鼠的ld
50
为8μg/kg。ttx的化学性质稳定，一般烹调手段难以将其破坏。
3.而ttx作为一种重要的工具药，广泛应用于生理学和药理学研究。ttx可用来镇痛、镇静、抗心律失常、预防肾功能衰竭及降血压等，还可作为广谱抗生素的代替药物。同时，其镇痛效果是吗啡的3000倍,比普鲁卡因和可卡因强10万倍；作为戒毒剂,其戒毒有效率达98％,且不具毒副作用和成瘾性，可取代化学药物和中草药戒毒，且无副作用。河豚毒素具有极高的经济价值。
4.目前，河豚毒素主要是从河豚鱼内脏中提取纯化。该方法步骤繁琐、得率低、产品纯度不高，难以进行工业化生产；同时，因人工养殖的河豚鱼含毒极低甚至无毒，因此需消耗大量的野生河豚鱼资源，会破坏生态环境。而利用产河豚毒素的微生物进行发酵来生产ttx的方法，更适用于工业化生产，更具有发展前景，但是，目前已有发现产河豚毒素的微生物，但是种类较少，且其产量较低且不稳定，因此，需要找到能够实现持续、高效、稳定地产ttx的微生物菌株。
5.因此，现有技术有待进一步改进。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提供了一株来自黄鳍东方鲀takifugu xanthopterus卵巢组织的产河豚毒素的假单胞菌pseudomonas adaceae hty-1，可利用该假单胞菌hty-1进行发酵培养，用于大批量生产河豚毒素。
7.为了解决上述问题，本技术提供以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种假单胞菌，其被命名为假单胞菌hty-1(pseudomonas.sp hty-1)，保藏号为cgmcc no.23768。
9.该假单胞菌hty-1是从黄鳍东方鲀(pseudomonas adaceae)的卵巢组织中分离得到，进行鉴定后，确定其为假单胞菌，并将其于2021年11月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，保藏地址为：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该假单胞菌hty-1的保藏号为cgmcc no.23768。
10.第二方面，本发明还提供上述假单胞菌在河豚毒素制备中的应用。可通过利用假单胞菌hty-1发酵技术，对菌液中产生的河豚毒素进行提取和纯化，从而得到河豚毒素产品。
11.第三方面，本发明提供一种河豚毒素的制备方法，其包括以下步骤：
12.将上述假单胞菌hty-1接种到液体培养基中进行发酵培养，将得到的发酵液进行离心处理后，收集发酵上清液；浓缩发酵上清液后，进行纯化处理。
13.所述液体培养基可采用现有的适合假单胞菌生长的各种培养基。可选地，所述液体培养基：5g/l的胰蛋白胨，5g/l的大豆蛋白胨，10g/l的酵母抽提物，20g/l的蔗糖，10g/l的nacl，ph为7.0-7.2。
14.优选地，假单胞菌hty-1的培养条件为：28℃下，150转/分钟，培养48h，得到发酵液。
15.优选地，上述河豚毒素的制备方法包括以下步骤：
16.s1、将前述的假单胞菌进行发酵培养后，离心分离分离发酵上清液；
17.s2、通过减压旋蒸浓缩上一步的发酵上清液；
18.s3、使用c18固相萃取柱纯化发酵浓缩液毒素；
19.s4、将得到洗脱液进行过滤，再将过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌水中。
20.优选地，s4步骤后还设置以下步骤：
21.s5、利用系统来分析河豚毒素；对河豚毒素质谱分析。
22.优选地，所述制备方法中，采用减压旋蒸的方式浓缩发酵上清液，其条件为：水浴温度40-60℃，压力为0.01mpa，浓缩比例为1：(50-200)。
23.优选地，所述制备方法中，纯化方法为：将c18柱进行活化；加入发酵浓缩液，控制流速为1滴/min，使用1倍柱体积的0.3％甲酸水冲洗，用2倍柱体积0.3％甲酸水洗脱。本发明的方法不限于上述具体的纯化条件。
24.优选地，发酵采用的液体发酵培养基包括以下成分：5g/l的胰蛋白胨，5g/l的大豆蛋白胨，10g/l的酵母抽提物，20g/l的蔗糖，10g/l的nacl，ph为7.0-7.2。
25.第四方面，本发明还提供另一种河豚毒素的制备方法，其包括如下步骤：
26.s1、将前述的假单胞菌hty-1进行发酵培养后，进行离心处理，并收集菌体细胞；
27.s2、向菌体细胞中加入体积浓度为1％的乙酸甲醇提取液，吹吸上一步得到的菌体细胞；
28.s3、进行超声破碎细胞并提取毒素；
29.s4、离心去除细胞沉淀后，将得到的液体进行0.22um有机滤膜的过滤。
30.优选地，所述制备方法中，所述超声波破碎的条件为：功率90-120w，频率30-50hz，超声20-40min。优选条件为：功率100w，频率40hz，超声30min；离心条件为：4℃，3000-5000rpm条件下，离心10-30min。
31.本发明具有以下有益效果：
32.1、本发明提供一株高效且稳定的产出河豚毒素的假单胞菌hty-1，可通过液体发酵培养该菌株从而实现河豚毒素的大规模生产，不仅降低河豚毒素的产量，并且不会破坏生态环境，具有更好的发展前景。
33.2、本技术提供了两种不同的河豚毒素的制备方法，都是通过对假单胞菌hty-1的
no:1。
55.将该16srdna基因序列提交ncbi进行在线比对，发现：该基因序列与atcc菌株(pseudomonas otitidis baa-1130)亲缘关系最近，结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，确定菌株该分离的菌株为假单胞菌pseudomonas otitidis，将其命名为hty-1。
56.实施例3假单胞菌hty-1的发酵培养及河豚毒素的提取
57.1、假单胞菌hty-1的发酵：
58.将假单胞菌hty-1接种在液体发酵培养基中，在28℃下，150转/分钟，培养48h，得到发酵液。
59.其中，所述液体发酵培养基的配置方法为：分别称取5g胰蛋白胨，5g大豆蛋白胨，10g酵母抽提物，20g蔗糖，10g nacl，加入到1l的超纯水中，再加入1mol/l naoh溶液，将培养基的ph调节至7.0-7.2即可。
60.2、河豚毒素的粗提
61.2.1方法一：
62.(1)假单胞菌pseudomonas adaceae细菌发酵培养后，4℃下4000rpm离心20min分离发酵上清液与菌体细胞；
63.(2)减压旋蒸浓缩发酵上清液，设置水浴温度50℃，压力为0.01mpa，浓缩比例为1：100；
64.(3)使用c18固相萃取柱纯化发酵浓缩液毒素，c18柱使用1倍柱体积甲醇，1倍柱体积水活化；加入发酵浓缩液，控制流速1滴/min；1倍柱体积0.3％甲酸水冲洗；2倍柱体积0.3％甲酸水洗脱；
65.(4)将洗脱液过滤；
66.(5)过滤液冷冻干燥后，溶解在1ml无菌去离子水中；
67.(6)加入1％乙酸甲醇提取液，吹吸汇总收集菌体细胞；
68.(7)超声破碎细胞并提取毒素；
69.(8)4000rpm离心20min去除细胞沉淀；
70.(9)过0.22um有机滤膜；
71.2.2方法二：
72.(1)假单胞菌pseudomonas adaceae细菌发酵培养后，4℃下4000rpm离心20min分离发酵上清液与菌体细胞；
73.(2)加入1％乙酸甲醇提取液，吹吸汇总收集菌体细胞；
74.(3)超声破碎细胞并提取毒素；
75.(4)4000rpm离心20min去除细胞沉淀；
76.(5)过0.22um有机滤膜。
77.3、毒素的鉴定
78.检测采用液相质谱联用仪
79.液相色谱条件如下：
80.1.色谱柱：hilic柱(100*3mm，3um)
81.2.流动相
[0082][0083]
3.流速：0.3ml/min
[0084]
4.柱温：40℃
[0085]
5.进样量：10ul
[0086]
质谱条件如下：
[0087]
1.质谱：thermofisher tsq quantis。
[0088]
2.离子源：esi离子源；
[0089]
3.气流量：反吹气2(arb)鞘气35(arb)辅助气10(arb)；
[0090]
4.扫描模式：正离子；
[0091]
5.喷雾电压：3500v；
[0092]
6.离子参数：见下表：
[0093][0094]
2、检测结果及分析
[0095]
(1)方法一的毒素的检测
[0096]
样品检测图谱的图5对比ttx标准品检测图谱的图4，可见在出峰时间6.47位置附近出现一个特征峰，根据峰面积计算得到ttx浓度为14.287ppb。
[0097]
(2)方法二的毒素检测(参照(1))
[0098]
样品检测图谱图6对比ttx标准品检测图谱图4，可见在出峰时间6.47位置附近出现一个特征峰，根据峰面积计算得到ttx浓度为11.83ppb。
[0099]
(3)毒素的产量或纯度
[0100]
方法一得到的河豚毒素的产量为14.287ug/l，方法二得到的河豚毒素的产量为11.83ug/l，这不仅说明本技术提供的假单胞菌hty-1是产河豚毒素的，并且通过本发明提
供的前述方法一或方法二可对该假单胞菌hty-1的发酵液进行河豚毒素的高效提取，该方法可用于河豚毒素的制备。
[0101]
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。