濒危半红树植物莲叶桐SSR引物及其应用的制作方法

濒危半红树植物莲叶桐ssr引物及其应用
技术领域
1.本发明属于分子遗传学领域，涉及ssr引物，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐的特异性ssr引物。


背景技术：

2.莲叶桐(hernandia nymphaeifolia(j.presl)kubitzki)是莲叶桐科、莲叶桐属常绿乔木，因含木质素和生物碱而具有一定的药用价值。目前针对正处于濒危状态的莲叶桐的研究在国内外都较为少见。刘梨萍、吴银生等对莲叶桐树枝和种子成分进行了研究，发现其中含有多种抗肿瘤和白血病等疾病的物质，验证其重要的药用价值。李佳文等进行了莲叶桐与其近缘物种的对比进化聚类分析，将其归为樟目，还验证了莲叶桐的叶绿体基因组之间具有高度保守性，为莲叶桐的系统进化提供了新的证据。周婉敏，刘楠等对莲叶桐在热带珊瑚岛环境的生理生态适应性进行了探究。尚未有人提出对濒危植物莲叶桐的遗传特征与濒危机制以及应对策略。目前没有应用ssr分子标记设计引物研究莲叶桐的遗传多样性。
3.ssr即简单序列重复(simple sequence repeat)，又称微卫星dna(microsatellite dna)或短串联重复序列(short tandem repeat,str)，是一类由2至6个核苷酸为重复单位的串联而成的简单序列，长度一般在几十个核苷酸左右，其两端序列是相对保守和特异的单拷贝序列。在漫长的进化过程中，生物体内部的核苷酸之间会发生不相等的交换，从而可以渐渐积累出重复频次不同的碱基，并且在不同的生物体内部，即使是在同一微卫星位点，其重复单位的数目也不一定会一样，这就是致使微卫星位点发生突变并可以展现出多态性的原因，这样的突变于生物体本身来说是微弱的，通常不对生物体本身表现出明显的危害，因此生物体内染色体存在十分丰富的微卫星变异。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题为：提供莲叶桐的特异性ssr引物，应用于研究莲叶桐在海南岛不同居群的遗传多样性，分析该物种不同居群遗传结构特征和居群遗传多样性，明晰不同居群遗传分化和基因交流状况以及群体系统发育与进化关系，从而分析莲叶桐的濒危机制，结果将对濒危半红树植物莲叶桐的资源保护与开发有重要意义；此外有助于提出相应的保护和恢复措施,这对保护生物多样性以及维持生态平衡具有十分重要的理论和实践意义。
5.本发明的技术方案为：濒危半红树植物莲叶桐特异性ssr引物，包括如下引物物对：
6.[0007][0008]
同时，本发明还提供所述的特异性ssr引物在来自海南岛10个代表居群共46个莲叶桐样本居群遗传多样性分析、遗传分化分析或遗传结构分析中的应用。
[0009]
进一步地，所述的应用包括如下步骤：
[0010]
(1)提取莲叶桐基因组dna
[0011]
(2)利用权力要求1所述的特异性ssr引物进行荧光pcr扩增；
[0012]
(3)使用毛细管电泳等方法检验扩增产物，获得检测结果；
[0013]
(4)利用步骤(3)的结果进行莲叶桐居群遗传多样性分析、遗传分化分析或遗传结构分析。
[0014]
所述的应用，其pcr的反应体系如下：
[0015][0016]
所述pcr的扩增程序如下：
[0017][0018]
利用本发明的特异性ssr引物开发了试剂盒，该试剂盒含有本发明的特异性ssr引物。
[0019]
进一步地，试剂盒还包括pcr扩增体系试剂。
[0020]
具体地，所述试剂盒组成为：2
×
taq pcr master mix 7.5ul，mix primer 2.0ul，dna template 1ul，ddh2o。
[0021]
本发明具有以下有益效果：
[0022]
1)提供莲叶桐的特异性ssr引物，应用于研究莲叶桐在海南岛不同居群的遗传多
样性，分析该物种不同居群遗传结构特征和居群遗传多样性，明晰不同居群遗传分化和基因交流状况以及群体系统发育与进化关系，这对于掌握其来源及群体分化情况，对其开发利用等具有十分重要的理论与实践意义，
[0023]
2)从而分析莲叶桐的濒危机制，结果将对濒危半红树植物莲叶桐的资源保护与开发有重要意义；此外有助于提出相应的保护和恢复措施,这对保护生物多样性以及维持生态平衡具有十分重要的理论和实践意义。
附图说明
[0024]
图1海南岛莲叶桐8个天然居群分布图；
[0025]
图2基于pcr的毛细管电泳图，展示1组4种引物标记4种荧光标记(tamra、fam、hex、rox)；
[0026]
图3基于nei's遗传距离的8个莲叶桐天然居群的邻接法聚类图；
[0027]
图4基于genalex软件计算8个天然居群的两两居群间遗传分化系数fst热点图；
[0028]
图5利用structure进行莲叶桐8个分类群遗传结构划分
具体实施方式
[0029]
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0030]
莲叶桐采取自海南琼海博鳌1个天然居群，海南琼海潭门5个天然居群，海南文昌东郊1个天然居群，海南文昌会文1个天然居群，具体位置如图1。
[0031]
实施例1特异性ssr引物的设计及筛选
[0032]
1.基于莲叶桐转录组拼接序列进行ssr位点的挖掘
[0033]
(1)样品检测、文库构建与测序：
[0034]
a)总rna的提取：送公司，由公司利用试剂盒提取。测定样品的浓纯度。rna质检符合要求后，进行文库构建等；
[0035]
b)mrna的分离及片段化：分离：利用真核生物成熟的mrna具polya这一特性，用oligo这一磁珠与polya特异性结合的性质以达到富集mrna的目的。片段化：利用fragmentation buffer将mrna片段化
[0036]
c)cdna第1链的合成：用six-base random primer，以mrna为模板形成cdna的第一链。
[0037]
d)cdna第2链的合成：加入缓冲剂，rnaseh，dntps，dna聚合酶形成cdna第二链，并用(qia quick pcr)纯化cdna。
[0038]
e)双链dna的末端修复，加polya尾：纯化后的cdna再进行末端修复、加polya尾并安装测序接头，最后让琼脂糖凝胶电泳筛选片段大小。
[0039]
f)pcr富集文库、上机测序：进行pcr，文库建构后，用illumina hiseqtm pe150s实行测序，获原始数据。
[0040]
(2)原始序列质量评估及拼接：对上述步骤(1)获得的高通量测序获得的原始数据进行质量评估和拼接。用illumina hiseqtm测序得到原始数据后，去除质量差的reads，删除步骤：删除n占比大于百分之十的序列及带接头的序列、去除低质量序列，得到高质量的
clean reads,测序结果符合标准后运用trinity组装软件对过滤后得到的高质量序列实行拼接处理，取最长转录本为基因，再进行质量评估与统计，最终获得65218条unigene作为本次实验的基础数据，以此进行后续分析。
[0041]
(3)基于莲叶桐转录组进行ssr位点挖掘：
[0042]
以组装得到的unigene作为本次实验的基础数据。运用misa软件对莲叶桐转录组数据实行ssr鉴别，两个ssr序列之间的距离》100bp，ssr选取标准如下表：
[0043]
表1 ssr选取标准
[0044][0045]
其中：
[0046]
ssr unit length：组成ssr的重复单位的长度；
[0047]
repeats：ssr单位的最小重复次数，对特定长度的ssr单位，其重复次数必须不小于该值。
[0048]
2.ssr引物设计与筛选
[0049]
一共找出58200个ssr位点，运用primer3.0软件对鉴别出的ssr分别设计引物，设计引物的原则为：引物序列的长度范围在18(bp)到20(bp)，产物长度在100(bp)到300(bp)，上下游引物的tm值不大于2℃，退火温度在55℃到65℃，gc含量在40％到60％，尽量避免出现错配、二聚体、发卡等情况，每一位点设计3对引物。从筛选得到的具有多态性潜力(ssr序列长度》15bp)的引物中随机挑选出100对。
[0050]
对这100对引物做预实验，随机挑选8个莲叶桐样本，来自海南岛天然分布的8个居群提取dna，按照下表2的pcr反应体系进行扩增反应(扩增程序见表3)，并用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，判别条带是否单一、是否有特异性扩增目的条带，片段大小是否与预期一致。将符合要求的扩增产物送至公司进行毛细电泳检测(如图2)。从100对ssr引物中，通过初步筛选和重复验证，挑选出稳定性较好、多态性较高的17对有效ssr标记(表4)。
[0051]
莲叶桐基因组dna的提取：提取方法如下：
[0052]
1)取适量新鲜莲叶桐叶片，置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，将粉末转至离心管中，加入预热温度为65℃的裂解液，混匀，加入rna酶，涡旋振荡1min；裂解液组成为：100mmol/l tris-hcl ph8.0，50mmol/l edta，500mmol/l nacl，2％(v/v)β疏基乙醇，5％(m/v)sds，2％(m/v)pvp；
[0053]
2)混匀后65℃水浴10min，加入等体积的抽提液振荡混匀，抽提液组成为tris平衡酚︰氯仿︰异戊醇＝25︰24︰1，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；
[0054]
3)取上清液转入一新离心管加入等体积的tris平衡酚振荡混匀，在转速为11000～135000rpm 4℃离心15～20min；
[0055]
4)取上清液，加入1/10倍体积的3mol/l naac和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中过夜，在转速为11000～135000rpm 4℃离心15～20min；
[0056]
5)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，加入50～250μl te，充分混匀后，加入1/10倍体积的3mol/l naac和两倍体积的异丙醇，混匀后，至于－20℃中2h，在转速为11000～135000rpm室温下离心10～15min；
[0057]
6)弃上清，沉淀用体积浓度70％乙醇洗涤2～4次，室温静置20～30min晾干，加入50～250μl的te，充分混匀后，置于-20℃保存。
[0058]
表2 ssr-pcr反应体系
[0059][0060][0061]
表3 ssr-pcr扩增程序
[0062][0063]
表4 17对多态性ssr标记
[0064][0065]
实施例2海南岛莲叶桐遗传多样性分析
[0066]
遗传多样性指标主要包括观测等位基因数(na,observed number of alleles)、有效等位基因数(ne,effective number of alleles)、shannon’s信息指数(i,shannon’s information index)、预期杂合度(he,expected heterozygosity)和观测杂合度(ho,observed heterozygosity)和基因流(nm,gene flow)、nei’s标准遗传距离(gd,genetic distance)、遗传分化系数fst、f固定指数等。等位基因数是指对应位点实际观测到的等位
基因类型的数量，反映了居群遗传多样性的高低。有效等位基因数为群体中纯合度的倒数，是反映群体遗传变异大小的指标之一，同时也反映了等位基因间的相互影响，有效等位基因数值越接近等位基因数的绝对值，表明等位基因在群体中分布越均匀。香农信息指数可用于估算种群内的遗传分化，指数越大遗传多样性越大，种群分化的程度越高。观测杂合度het为杂合子，ho表示了所测样品真实的杂合率。期望杂合度，根据每个等位基因的基因频率(pi)，可以算出期望杂合度。he值越高，表明多态性越高。f:固定指数(fixation index)，评估实际观测值与理论值偏离程度的指标。亦指在自然选择和遗传漂变作用下群体内的杂合度与总群体杂合度相比的下降值。取值范围[-1,1]，可通过固定指数来衡量种群中基因型的实际频率是否偏离hardy-weinberg理论比例。我们选取8个天然居群(琼海博鳌1个天然居群，琼海潭门5个天然居群，文昌东郊1个天然居群，文昌会文1个天然居群)的ssr分子标记结果，使用采用genealex软件进行分析8个居群的各项遗传多样性指标。莲叶桐居群的等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、shannon信息指数(i)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、固定指数(f)情况如表5。从中可以看出8个居群的ne均稍低于na，范围分别在1.282—1.583和1.353—1.941。i值平均为0.342，其中在qt1居群中有最低值0.222，qh居群中有最高值为0.467。在8个居群中ho比he略高一点，其范围分别在0.206—0.0417和0.154—0.306，均值为为0.300和0.229。
[0067]
表5 8个居群平均多样性指数信息表
[0068][0069]
实施例3莲叶桐居群遗传分化分析
[0070]
为了探究莲叶桐居群间遗传分化水平，我们使用genealex软件进行8个居群(琼海博鳌1个天然居群，琼海潭门5个天然居群，文昌东郊1个天然居群，文昌会文1个天然居群)两两居群间遗传分化以(表6)及nei’s居群遗传距离(表7)，同时还进行了居群间分子方差分析(amova)(表8)
[0071]
表6 各群体间的遗传分化系数
[0072]
[0073][0074]
表7 遗传一致性和遗传距离
[0075][0076]
表8 amova分析
[0077][0078]
实施例4莲叶桐居群遗传结构分析
[0079]
利用phylip软件，基于样品间及群体间的nei's遗传距离对海南岛莲叶桐的8个居群构建邻接法聚类树状图(图3)。莲叶桐的8个自然居群被分为了4个组群。qt5、qt1、wh各单独为一个组群，余下5个居群为一个大组群，且可进一步分为两个亚群：wd和qh为一个亚群，qt2、qt3、qt4为一个亚群。
[0080]
利用genealex软件对莲叶桐的8个天然群体和2个人工群体进行pcoa分析即主坐标分析(图4)：海南岛莲叶桐的10个居群中，总体上分布较分散，qt2、qt3、qt4的个体明显的大致全部聚集在一起相似性高，qt5部分个体与其它居群差异性较大，hn的人工居群可能取自于qt2，wd与qh的个体之间遗传差异性大，但两居群个体基本聚集在一起。pcoa分析结果与前面聚类分析结果不完全耦合，但具有较高的耦合度。
[0081]
利用structure 2.3.4软件对8个莲叶桐天然居群进行居群结构分组分析，当k＝4时，
△
k值达到最高值，所以应当取k＝4为本次研究的居群结构分组结果(图5)。