抗PD-L1的人源化抗体的制作方法

抗pd-l1的人源化抗体
技术领域
1.本发明总的来说涉及pd-l1的抗体及其组合物，以及使用抗pd-l1抗体治疗人类疾病的免疫疗法。


背景技术：

2.越来越多来自于临床前和临床结果的证据显示，靶向免疫检查点正变成治疗癌症患者的一种最有希望的方法。程序性死亡受体1(pd-1)是一个与cd28蛋白具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制性成员，在活化的b细胞、t细胞和髓系细胞上表达(agata等，同上；okazaki等，(2002)curr.opin.immunol.14:391779-82；bennett等，(2003)j immunol 170:711-8)，并在调节免疫系统中的刺激性和抑制性信号方面具有关键作用(okazaki,taku等，2007international immunology 19:813-824)。pd-1通过在凋亡细胞中筛选差异表达而被发现(ishida等，(1992)embo j 11:3887-95)。
3.pd-1是一种i型跨膜蛋白，是ig基因超家族的一部分(agata等，(1996)bit immunol 8:765-72)，并且pd-1的结构由免疫球蛋白可变区样细胞外结构域和含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和免疫受体酪氨酸开关基序(itsm)的胞质结构域组成。尽管在结构上与ctla-4相似，但pd-1缺少对于b7-1和b7-2结合来说关键的mypppy基序。pd-1具有两个已知配体pd-l1(b7-h1，cd274)和pd-l2(b7-dc，cd273)，它们是b7家族的细胞膜蛋白成员(freeman等，(2000)j exp med 192:1027-34；latchman等，(2001)nat immunol 2:261-8；carter etal(2002)eur j immunol 32:634-43)。pd-l1和pd-l2两者都是b7同源物，与pd-1结合，但不与其他cd28家族成员结合。
4.作为免疫检查点蛋白之一的pd-1是在活化的b细胞、t细胞和髓系细胞上表达的cd28家族的抑制性成员(agata等，同上；okazaki等，(2002)curr opin immunol 14:391779-82；bennett等，(2003)j immunol 170:711-8)，通过提供一种肿瘤细胞借以逃避免疫监督的重要免疫抗性机制，在限制t细胞的活性方面发挥了重要作用。pd-1在t细胞中诱导细胞无能或无响应性状态，导致细胞不能产生最佳水平的效应细胞因子。pd-1还可以通过其抑制存活信号的能力在t细胞中诱导凋亡。pd-1缺陷型动物发展出各种不同的自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病和伴有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(nishimura等，(1999)immunity 11:141-51；nishimura等，(2001)science 291:319-22)。此外，已发现pd-1在自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病(gvhd)、i型糖尿病和类风湿性关节炎中发挥作用(salama等，(2003)j exp med 198:71-78；prokunina和alarcon-riquelme(2004)hum moi genet 13:r143；nielsen等，(2004)lupus 11:510)。在鼠类b细胞肿瘤细胞系中，已显示pd-1的itsm对于阻断bcr介导的ca
2
流出和下游效应分子的酪氨酸磷酸化来说是必需的(okazaki等，(2001)pnas 98:13866-71)。
5.在活化的t细胞上表达的pd-1与在肿瘤细胞上表达的pd-l1的相互作用负调节免疫应答并抑制抗肿瘤免疫。pd-l1在各种不同的人类癌症中含量丰富(dong等，(2002)nat.med 8:787-9)。pd-l1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其他类型癌症中的存活率降
低相关，突出表明这条途径是肿瘤免疫治疗的有希望的靶点。几个研究组显示，pd-1/pd-l相互作用会加重疾病，导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少、t细胞受体介导的增殖减少以及癌细胞的免疫逃避(dong等，(2003)j.moi.med.81:281-7；blank等，(2005)cancer immunol.immunother.54:307-314；konishi等，(2004)clin.cancer res.10:5094-100)。免疫抑制可以通过抑制pd-1与pd-l1的局部相互作用来逆转，并且当pd-1与pd-l2的相互作用也被阻断时，所述效应是累加的。
6.大型制药公司例如medimmune、bristol-myers squibb(bms)、merck、roche和glaxosmithkline(gsk)已经开发了多种靶向pd-1/pd-l1途径的药剂。来自于临床试验的数据证实了在各种不同肿瘤类型的患者中持久的临床活性和令人鼓舞的安全性的早期证据。由medimmune开发的德瓦鲁单抗是一种抗pd-l1的工程化改造的单克隆igg1抗体，其在获得令人印象深刻的用于晚期转移性尿路上皮膀胱癌的i期数据后获得了fda的突破性疗法称号。所述来自于i期研究的结果显示在39％的pd-l1阳性患者和5％的pd-l1阴性患者中出现客观抗肺癌响应。纳武单抗是一种由bms开发的抗pd-1药物，其正处于下一代领域的中央舞台。目前在6项后期研究中，所述治疗在所研究的5个癌症组中的3个组中促进肿瘤缩小，包括18％的肺癌患者(n＝72)、接近三分之一的黑素瘤患者(n＝98)和27％的肾癌患者(n＝33)。由merck开发的派姆单抗是一种抗pd-1的人源化单克隆igg4抗体，其在获得令人印象深刻的用于皮肤癌的ib数据后获得了fda的突破性疗法称号。所述来自于ib期研究的结果显示在51％的癌症患者(n＝85)中出现客观抗肿瘤响应，并在9％的患者中出现完全响应。
7.抗pd-l1的抗体作为治疗剂仍有一些改进空间。目前在临床试验中测试的抗pd-l1的大多数单克隆抗体仅靶向人类pd-l1，这限制了临床前体内研究，并且由于小鼠来源的蛋白质序列的免疫原性而效能降低。与小鼠pd-l1具有交叉反应性的人源化抗体克服了这些缺点，并在患者体内显示出更高的耐受性和更高的效率。因此，对于新的抗pd-l1抗体仍存在着需求。


技术实现要素：

8.本发明提供了分离的抗体，特别是单克隆抗体或人类单克隆抗体。
9.一方面，本发明提供了一种与pd-l1的表位结合的人类和鼠类pd-l1的抗体或其抗原结合片段，所述表位包含seq id no：1的第19-22、43-46、48-49、70、118-120、122位的氨基酸。
10.上述抗体或其抗原结合片段，其中所述鼠类pd-l1是小鼠或大鼠pd-l1。
11.本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含含有与seq id no：2的序列至少70％、80％、90％或95％同源的氨基酸序列的重链可变(vh)结构域，
12.其中所述抗体与pd-l1特异性结合。
13.本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其还包含含有与seq id no：3的序列至少70％、80％、90％或95％同源的氨基酸序列的轻链可变(vl)结构域。
14.上述抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变(vh)结构域包含seq id no：2的氨基酸序列。
15.上述抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变(vl)结构域包含seq id no：3的氨基酸序列。
16.本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：
17.a)重链可变(vh)结构域，其包含与seq id nos：2的序列至少70％、80％、90％或95％同源的氨基酸序列；和
18.b)轻链可变(vl)结构域，其包含与seq id nos：3的序列至少70％、80％、90％或95％同源的氨基酸序列，
19.其中所述抗体与pd-l1特异性结合。
20.本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：
21.a)重链可变(vh)结构域，其包含seq id nos：2的氨基酸序列；和
22.b)轻链可变(vh)结构域，其包含seq id no：3的氨基酸序列，
23.其中所述抗体与pd-l1特异性结合。
24.本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：seq id no：10的氨基酸序列。
25.所述抗体的序列示出在表1和序列表中。
26.表1.抗体的序列
[0027][0028][0029]
另一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含：包含cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区；和包含cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区，
[0030]
其中所述重链可变区cdr3序列包含seq id no：4的序列及其保守修饰。
[0031]
其中所述抗体与pd-l1特异性结合。
[0032]
优选地，其中所述重链可变区cdr2序列包含seq id no：5的序列及其保守修饰。
[0033]
优选地，所述重链可变区cdr1序列包含seq id no：6的序列及其保守修饰。
[0034]
优选地，所述轻链可变区cdr3序列包含seq id no：7的序列及其保守修饰。
[0035]
优选地，所述轻链可变区cdr2序列包含seq id no：8的序列及其保守修饰。
[0036]
优选地，所述轻链可变区cdr1序列包含seq id no：9的序列及其保守修饰。
[0037]
优选的抗体包含：
[0038]
a)包含seq id no：6的重链可变区cdr1；
[0039]
b)包含seq id no：5的重链可变区cdr2；
[0040]
c)包含seq id no：4的重链可变区cdr3；
[0041]
d)包含seq id no：9的轻链可变区cdr1；
[0042]
e)包含seq id no：8的轻链可变区cdr2；
[0043]
f)包含seq id no：7的轻链可变区cdr3；
[0044]
其中所述抗体与pd-l1特异性结合.
[0045]
所述抗体的cdr序列示出在表2和序列表中。
[0046]
表2.抗体的序列
[0047][0048]
本发明的抗体可以是人源化的。
[0049]
本发明的抗体可以表现出下述性质中的至少一者：
[0050]
a)基本上不与人类pd-l2结合；
[0051]
b)提高t-细胞增殖；
[0052]
c)增加干扰素-γ生产；或
[0053]
d)增加白介素-2分泌。
[0054]
另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码所述抗体或其抗原结合片段。
[0055]
本发明提供了一种克隆或表达载体，其包含编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
[0056]
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含一个或多个克隆或表达载体。
[0057]
另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞并分离所述抗体，其中所述抗体通过在sd大鼠中用人类pd-l1细胞外结构域和小鼠pd-l1细胞外结构域共同免疫接种来制备。
[0058]
本发明提供了一种包含人类免疫球蛋白重链和轻链转入基因的转基因大鼠，其中所述大鼠表达本发明的抗体。
[0059]
本发明提供了从本发明的大鼠制备的杂交瘤，其中所述杂交瘤产生所述抗体。
[0060]
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明中的抗体或所述抗体的抗原结合片段，以及一种或多种可药用赋形剂、稀释剂或载体。
[0061]
本发明提供了一种免疫偶联物，其包含与治疗剂相连的本发明中所述的抗体或其抗原结合片段。
[0062]
其中，本发明提供了一种药物组合物，其包含所述免疫偶联物和可药用赋形剂、稀释剂或载体。
[0063]
本发明还提供了一种制备抗pd-l1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
[0064]
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含seq id no：6的cdr1序列、seq id no：5的cdr2序列和seq id no：4的cdr3序列；和/或
[0065]
(ii)轻链可变区抗体序列，其包含seq id no：9的cdr1序列、seq id no：8的cdr2序列和seq id no：7的cdr3序列；以及
[0066]
(b)将所述改变的抗体序列表达成蛋白质。
[0067]
本发明还提供了一种在受试者中调节免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药本发明中所述的抗体中的任一者的抗体或其抗原结合片段。
[0068]
本发明还提供了所述抗体的用途，其用于制造治疗或预防免疫障碍或癌症的药物。
[0069]
本发明还提供了一种在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的所述抗体或所述抗原结合片段，以抑制所述肿瘤细胞的生长。
[0070]
其中，本发明提供了所述方法，其中所述肿瘤细胞是选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌和直肠癌的癌症的细胞。
[0071]
其中，本发明提供了所述方法，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
[0072]
本发明的特点和优点
[0073]
抗pd-l1的抗体作为治疗剂仍存在一些改进空间。目前在临床试验中测试的抗pd-l1的大多数单克隆抗体仅抗人类pd-l1，这限制了临床前体内研究，并且由于小鼠来源的蛋白质序列的免疫原性而效能降低。与小鼠pd-l1具有交叉反应性的人源化抗体克服了这些缺点，并在患者中显示出更高的耐受性和更高的效率。在本发明中，我们利用杂交瘤技术产生了抗pd-l1的人源化抗体。本发明中报道的抗体对人和小鼠pd-l1蛋白两者均具有高结合亲和性，没有家族交叉反应，有效阻断pd-l1与cd80的结合，并有效调节免疫应答，包括增强t细胞增殖和提高细胞因子ifn-γ和白介素-2生产，并对人类treg细胞具有优越的抑制效能。
附图说明
[0074]
图1示出了通过facs得到的与细胞表面人类pd-l1结合的结果。
[0075]
图2示出了通过facs得到的与细胞表面小鼠pd-l1结合的结果。
[0076]
图3示出了通过facs得到的与细胞表面食蟹猴pd-l1结合的结果。
[0077]
图4示出了与细胞表面人类pd-l2的家族交叉结合试验的结果。
[0078]
图5示出了人类pd-1/pd-l1结合竞争。
[0079]
图6示出了小鼠pd-1/pd-l1结合竞争。
[0080]
图7示出了人类pd-l1/cd80结合竞争。
[0081]
图8示出了人类同种异体mlr中的il-2分泌。
[0082]
图9示出了人类同种异体mlr中的ifn-γ分泌。
[0083]
图10示出了人类同种异体mlr中的t细胞增殖。
[0084]
图11示出了人类自体mlr中的ifn-γ分泌。
[0085]
图12示出了人类自体mlr中的t细胞增殖。
[0086]
图13示出了在treg细胞存在下人类cd4

t细胞的ifn-γ分泌的结果。
[0087]
图14示出了在treg细胞存在下人类cd4

t细胞的t细胞增殖。
[0088]
图15示出了pd-l1抗体对树突状细胞的adcc作用。
[0089]
图16示出了赫赛汀对sk-br-3细胞的adcc作用。
[0090]
图17示出了pd-l1抗体对树突状细胞的cdc作用。
[0091]
图18示出了利妥昔单抗对ramos细胞的cdc作用。
[0092]
图19示出了抗pd-l1抗体与wbp315bmk1的表位竞争分析。
[0093]
图20示出了抗pd-l1抗体与wbp315bmk6的表位竞争分析。
[0094]
图21示出了与固定化的人类pd-l1的结合。
[0095]
图22示出了w3152-r11.135.5-zab17-igg4l在人类pd-l1结构上的热点残基。
[0096]
图23示出了对照和治疗组中小鼠的体重。
[0097]
图24示出了对照和治疗组中小鼠的体重变化。
[0098]
图25示出了治疗期间的肿瘤体积。
[0099]
详细描述
[0100]
本公开的下述描述仅仅旨在说明本公开的各个不同实施方式。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对本领域技术人员来说，显然可以制造各种不同的等同物、改变和修改而不背离本公开的范围，并且应该理解此类等同的实施方式将被包括在本文中。本文引用的包括公布、专利和专利申请在内的所有参考文献，整体通过参考并入本文。
[0101]“一个”，“一个”和“该”的指称在本文中用于指称一个或超过一个(即至少一个)指称物。例如，“多肽复合物”意味着一个多肽复合物或超过一个多肽复合物。
[0102]
当在本文中使用时，术语“约”或“大约”是指相对于参比数量、水平、值、数目、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度变动多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度。在特定实施方式中，术语“约”或“大约”当在数值之前时是指所述值加或减15％、10％、5％或1％的范围。
[0103]
在整个本公开中，除非上下文另有要求，否词词语“包含”应该被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或一组步骤或要素。“由
……
组成”表示包括但限于跟在短语“由
……
组成”之后的任何项。因此，短语“由
……
组成”表示所列出的要素是必需或强制性的，并且不可存在其他要素。“基本上由
……
组成”意味着包括在所述短语后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开中为所述列出的要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示所列出的要素是必需或强制性的，但其他要素是任选的，并且取决于它们是否影响所述列出的要素的活性或作用而可能存在或不存在。
[0104]
短语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物或多个氨基酸残基聚合物的集合体。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷
酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢、羧基、氨基和r基团键合的α-碳的类似物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的r基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。α-碳是指附连到官能团例如羰基的第一个碳原子。β-碳是指与所述α-碳相连的第二个碳原子，并且系统继续用希腊字母胺字母顺序命名所述碳。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的通用化学结构的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。术语“蛋白质”通常是指大的多肽。术语“肽”通常是指短的多肽。多肽序列通常被描述为多肽序列的左侧末端是氨基端(n-端)，多肽序列的右侧末端是羧基端(c-端)。当在本文中使用时，“多肽复合物”是指包含相结合以执行某些功能的一个或多个多肽的复合物。在某些实施方式中，所述多肽是免疫相关的。
[0105]
术语“程序化死亡蛋白1”、“程序化细胞死亡蛋白1”、“蛋白pd-1”、“pd-1”、“pd1”、“pdcd1”、“hpd-1”和“hpd-f”可互换使用，并且包括人类pd-1的变体、同型、物种同源物以及与pd-1具有至少一个共同表位的类似物。
[0106]
术语“程序化细胞死亡配体1”、“pd配体1”、“pd-l1”、“pd l1”、“b7同源物1”、“b7-h1”、“b7 h1”、“cd274”可互换使用，并且包括人类pd-l1的变体、同型、物种同源物以及与pd-l1具有至少一个共同表位的类似物。
[0107]
当在本文中提及时，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的蛋白质或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(在本文中简写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中简写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域cl。所述vh和vl区可以被进一步细分成被称为互补决定区(cdr)的高度可变的区域，并散布有被称为构架区(fr)的更加保守的区域。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端以下述顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链中的cdr被简写为h-cdr，例如h-cdr1、h-cdr2、h-cdr3，轻链中的cdr被简写为l-cdr，例如l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3。
[0108]
当在本公开中使用时，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，不论它是在体外还是体内产生的。所述术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变和嫁接抗体。术语“抗体”还包括抗体片段，例如scfv、dab、包含第一vh结构域和第二vh结构域的双特异性抗体，以及保留了抗原结合功能、即特异性结合pd-1和lag-3的能力的其他抗体片段。通常，此类片段将包含抗原结合片段。
[0109]
抗原结合片段通常包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不是必定包含两者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh结构域和ch1结构域构成，但仍保留完整抗体的一些抗原结合功能。
[0110]
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”和“结合片段”是指抗体分子的包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸的部分。在抗原大的情况下，抗原结合片段可能只与抗原的一部分结合。抗原分子的负责与所述抗原结合片段特异性相互作用的部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。
[0111]
抗原结合片段通常包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，然而，它不是必定包含两者。例如，所谓的fd抗体片段仅由vh结构域构成，但仍保留完整抗体的一些抗原结合功能。
[0112]
与上文相一致，术语“表位”定义了抗原决定簇，其被如上所定义的结合片段特异性结合/识别。所述结合片段可以与构象或连续表位特异性结合/相互作用，所述表位对于靶结构例如人类和鼠类pd-l1来说是独一无二的。对于多肽抗原来说，构象或不连续表位的特征在于存在两个或多个分立的氨基酸残基，它们在一级序列中隔开，但在所述多肽折叠成天然蛋白质/抗原时在分子表面上聚在一起。所述对表位有贡献的两个或更多个分立的氨基酸残基存在于一条或多条多肽链的分开的区段上。当所述多肽链折叠成三维结构时这些残基在分子表面上聚在一起，构成所述表位。相反，连续或线性表位由存在于多肽链的单一线性区段中的两个或更多个离散的氨基酸残基组成。
[0113]
术语“与pd-l1的表位结合”是指抗体对pd-l1的特定表位具有特异性结合，所述表位可以由pd-l1多肽的一部分上的线性氨基酸序列或三级、即三维构象定义。结合意味着抗体对所述pd-l1部分的亲和性实质性高于它们对其他相关多肽的亲和性。术语“实质性更高的亲和性”意味着与对其他相关多肽的亲和性相比，对所述pd-l1部分的亲和性存在着可测量的提高。优选地，对所述pd-l1的特定部分的亲和性比对其他蛋白质的亲和性高至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。优选地，结合亲和性通过酶联免疫吸附测定法(elisa)或通过荧光活化细胞分拣(facs)分析或表面等离子体共振(spr)来确定。更优选地，结合特异性通过荧光活化细胞分拣(facs)分析来获得。
[0114]
术语“交叉反应性”是指本文中描述的抗原片段与人类和鼠类(小鼠或大鼠)中的相同靶分子的结合。因此，“交叉反应性”应该被理解为与在不同物种中表达的同一分子x的物种间反应性，但不与x之外的分子反应。识别例如人类pd-l1的单克隆抗体对鼠类(小鼠或大鼠)pd-l1的跨物种特异性，可以例如通过facs分析来确定。
[0115]
术语“保守修饰”是指核苷酸和氨基酸序列修饰，其不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码或含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸替换、添加和缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术例如定点突变和pcr介导的突变引入到所述序列中。保守氨基酸替换包括其中所述氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
[0116]
当在本文中使用时，术语“同源物”和“同源的”可互换使用，并且是指核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列与另一个序列在最佳比对时具有至少70％(例如至少70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性。
[0117]
对于氨基酸序列(或核酸序列)来说，“百分(％)序列同一性”被定义为在将序列对齐并在必要时引入间隙以实现最大数目的相同氨基酸(或核酸)后，候选序列中的氨基酸
(或核酸)残基与参比序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的百分率。氨基酸残基的保守替换可以被认为是相同的残基，也可以不被认为是相同的残基。出于确定百分氨基酸(或核酸)序列同一性目的的比对可以例如使用可公开获得的工具来实现，例如blastn、blastp(可以在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的网站上获得，也参见altschul s.f.等，j.mol.biol.,215:403-410(1990)；stephen f.等，nucleic acids res.,25:3389-3402(1997))、clustalw2(可以在欧洲生物信息研究所的网站上获得，也参见higgins d.g.等，methods in enzymology,266:383-402(1996)；larkin m.a.等，bioinformatics(oxford,england),23(21):2947-8(2007))和align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数，或者可以例如通过选择适合的算法来定制适合于比对的参数。
[0118]
当在本文中使用时，术语“特异性结合”或“特异地结合”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方式中，本文中提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物以≤10-6
m(例如≤5
×
10-7
m、≤2
×
10-7
m、≤10-7
m、≤5
×
10-8
m、≤2
×
10-8
m、≤10-8
m、≤5
×
10-9
m、≤2
×
10-9
m、≤10-9
m或≤10-10
m)的结合亲和性(kd)特异性结合抗原。当在本文中使用时，kd是指解离速率与结合速率的比率(k off/k on)，可以例如使用诸如biacore的仪器，使用表面等离子体共振方法来确定。
[0119]
制备方法
[0120]
本公开提供了分离的核酸或多核苷酸，其编码本文中提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物。
[0121]
当在本文中使用时，术语“核酸”或“多核苷酸”是指采取单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非特别限制，否则所述术语涵盖了含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，其具有与参比核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有指明，否则特定多核苷酸序列也暗示地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列以及明确指明的序列。具体来说，简并密码子替换可以通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现(参见batzer等，nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和rossolini等，mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
[0122]
编码本文中提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物的核酸或多核苷酸可以使用重组技术来构建。为此，可以使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)将编码母体抗体的抗原结合组成部分(例如cdr或可变区)的dna分离并测序。同样地，也可以获得编码tcr恒定区的dna。作为实例，获得编码可变结构域(vh)的多核苷酸序列和编码第一tcr恒定区的多核苷酸序列并将其可操作连接，以允许在宿主细胞中转录和表达，以产生第一多肽。类似地，将编码vl的多核苷酸序列可操作连接到编码第二tcr恒定区的多核苷酸序列，以便允许第二多肽在所述宿主细胞中表达。如果需要，也将编码一个或多个间隔物的多核苷酸序列可操作连接到其他编码序列，以允许所需产物的表达。
[0123]
所述编码多核苷酸序列可以任选地在表达载体中被进一步可操作连接到一个或多个调控序列，使得所述第一和第二多肽的表达或生产是可行的并在适合的控制之下。
[0124]
可以使用本领域中已知的重组技术将所述编码多核苷酸序列插入到用于进一步克隆(dna的扩增)或表达的载体中。在另一个实施方式中，本文中提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物可以通过本领域中已知的同源重组来生产。许多载体是可用的。所述载体的组分包括但不限于下述一者或多者：信号序列，复制原点，一个或多个标志物基因，增强子元件，启动子(例如sv40、cmv、ef-1α)和转录终止序列。
[0125]
当在本文中使用时，术语“载体”是指可以在其中可操作地插入编码蛋白质的多核苷酸，以便引起该蛋白质的表达的运载物。通常，所述构建物还包括适合的调控序列。例如，所述多核苷酸分子可以包括位于编码指导rna的核苷酸序列和/或编码定点修饰的多肽的核苷酸序列的5'-侧翼区中的调控序列，其以能够在宿主细胞中表达所需转录本/基因的方式可操作连接到所述编码序列。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以便引起它携带的遗传元件在所述宿主细胞内的表达。载体的实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生人工染色体(pac)、噬菌体例如λ噬菌体或m13噬菌体以及动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括反转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如sv40)。载体可以含有各种不同的用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择性元件和报告基因。此外，载体可以含有复制原点。载体还可以包括有助于它进入细胞的材料，包括但不限于病毒粒子、脂质体或蛋白质包被。
[0126]
在某些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并包括质粒例如但不限于palter、pbad、pcdna、pcal、pl、pet、pgemex、pgex、pci、pcmv、pegfp、pegft、psv2、pfuse、pvitro、pvivo、pmal、pmono、pselect、puno、pduo、psg5l、pbabe、pwpxl、pbi、p15tv-l、ppro18、ptd、prs420、plexa、pact2.2等，以及其他实验室和可商购的载体。适合的载体可以包括质粒或病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0127]
包含本文中提供的多核苷酸序列的载体可以被引入到宿主细胞，用于克隆或基因表达。当在本文中使用时，短语“宿主细胞”是指在其中引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
[0128]
适用于克隆或表达本文中的载体中的dna的宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，例如埃希氏杆菌属如大肠埃希氏杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌属，以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌属。
[0129]
除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是适用于编码多肽复合物和双特异性多肽复合物的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，大量其他属、种和株是通常可用的并在本文中有用，例如粟酒裂殖酵母，克鲁维酵母属宿主例如乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc 12,424)、k.bulgaricus(atcc 16,045)、k.wickeramii(atcc 24,178)、k.waltii(atcc 56,500)、k.drosophilarum(atcc 36,906)、k.thermotolerans和k.marxianus，耶氏酵母属(ep 402,226)，巴斯德毕赤酵母(ep 183,070)，假丝酵母属，里氏木霉(ep 244,234)，粗糙脉孢霉，许旺酵母属例如schwanniomyces occidentalis，以及丝状真菌例如脉
孢霉属、青霉素、弯颈霉属和曲霉属宿主例如构巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。
[0130]
适用于本文中提供的糖基化多肽复合物和双特异性多肽复合物的表达的宿主细胞源自于多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定到大量杆状病毒毒株和变体和来自于诸如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊)、白纹伊蚊(蚊)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕的宿主的相应容许性昆虫宿主细胞。各种不同的用于转染的病毒毒株是可公开获得的，例如苜蓿银纹夜蛾npv的l-1变体和家蚕npv的bm-5毒株，并且根据本发明此类病毒可以用作本文中的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
[0131]
然而，最大的兴趣在于脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养物中的繁殖(组织培养)已变成常规程序。有用的哺乳动物细胞系的实例是用sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos-7，atcc crl 1651)，人类胚胎肾细胞系(被亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞，graham等，j.gen virol.36:59(1977))例如expi293，幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)，中华仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho，urlaub等，proc.natl.acad.sci.usa 77:4216(1980))，小鼠sertoli细胞(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))，猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)，非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcc crl-1587)，人类宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)，狗肾细胞(mdck，atcc ccl 34)，水牛鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)，人肺细胞(w138，atcc ccl 75)，人肝细胞(hep g2，hb 8065)，小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt 060562，atcc ccl51)，tri细胞(mather等，annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982))，mrc 5细胞，fs4细胞和人肝细胞瘤细胞系(hep g2)。
[0132]
用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞可以在被适合地改良的常规营养培养基中培养，以诱导启动子、选择转化体或扩增所述克隆载体。
[0133]
为了产生本文中提供的多肽复合物和双特异性多肽复合物，可以将用表达载体转化的宿主细胞在各种不同培养基中培养。可商购的培养基例如ham
′
s f10(sigma)、最低必需培养基(mem)(sigma)、rpmi-1640(sigma)和dulbecco改良的eagle培养基(dmem)(sigma)适合于培养宿主细胞。此外，在ham等，meth.enz.58:44(1979)，barnes等，anal.biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469，wo 90/03430、wo 87/00195或u.s.pat.re.30,985中描述的任何培养基，均可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一者在需要时可以用激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如hepes)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素药物)、微量元素(被定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源增补。任何其他需要的增补剂也可以以本领域技术人员已知的适合浓度被包含。培养条件例如温度、ph等是以前用于所选宿主细胞的表达的条件，并且对于普通专业技术人员来说是显而易见的。
[0134]
在某些实施方式中，所述多肽复合物或双特异性多肽复合物可以被直接地或例如通过另一个偶联物或通过连接物间接地连接到偶联物。例如，具有反应性残基例如半胱氨酸的多肽复合物或双特异性多肽复合物可以被连接到硫醇反应性试剂，在所述试剂中反应性基团是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物或其他硫醇反应性偶联配偶体(haugland,2003，《荧光探针和研究化学品的分子探针手册》(molecular probes handbook of fluorescent probes and research chemicals)，molecular probes,inc.；brinkley,
1992,bioconjugate chem.3:2；garman,1997，《非放射活性标记：实用方法》(non-radioactive labelling:a practical approach)，academic press,london；means(1990)bioconjugate chem.1:2；hermanson,g.，《生物偶联技术》(bioconjugate techniques)(1996)academic press,san diego,pp.40-55,643-671)。
[0135]
作为另一个实例，可以将所述多肽复合物或双特异性多肽复合物偶联到生物素，然后间接偶联到与亲和素偶联的第二个偶联物。作为又一个实例，可以将所述多肽复合物或双特异性多肽复合物连接到连接物，所述连接物进一步连接到偶联物。连接物的实例包括双功能偶联剂例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(smcc)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、酰亚胺基酯的双功能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双重氮盐衍生物(例如双-(对重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和组氨酸活性的含氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括提供二硫键的n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)(carlsson等，biochem.j.173:723-737(1978))和n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(spp)。
[0136]
所述偶联物可以是可检测标记物、药代动力学的修饰部分、纯化组成部分或细胞毒性组成部分。可检测标记物的实例可以包括荧光标记物(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-d-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如123i、124i、125i、131i、35s、3h、111in、112in、14c、64cu、67cu、86y、88y、90y、177lu、211at、186re、188re、153sm、212bi和32p，其他镧系元素，发光标记物)、发色组成部、地高辛、生物素/亲和素、dna分子或检测用金。在某些实施方式中，所述偶联物可以是药代动力学的修饰部分，例如帮助增加抗体的半衰期的peg。其他适合的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。在某些实施方式中，所述偶联物可以是纯化组成部分例如磁珠。“细胞毒性组成部分”可以是对细胞有害或可以损伤或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性组成部分的实例包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c和顺二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类药物(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素d(以前的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(amc))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
[0137]
用于将偶联物偶联到蛋白质例如抗体、免疫球蛋白或其片段的方法可以在例如美国专利号5,208,020、美国专利号6,441,163、wo2005037992、wo2005081711和wo2006/034488中找到，其整体通过参考并入本文。
[0138]
药物组合物
[0139]
本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文中提供的多肽复合物或双特异性多
肽复合物和可药用载体。
[0140]
术语“可药用的”表示所指称的载体、介质、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成剂型的其他成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
[0141]“可药用载体”是指药物剂型中除了活性成分之外的成分，其对于受试者来说是生物活性可接受的且无毒的。用于本文公开的药物组合物的可药用载体可以包括例如可药用液体、凝胶或固体载体、水性载体、非水性载体、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域中已知的其他组分或其各种不同组合。
[0142]
治疗方法
[0143]
还提供了治疗方法，所述方法包括：向需要的受试者给药治疗有效量的本文中提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物，由此治疗或预防病症或障碍。在某些实施方式中，所述受试者已被鉴定为患有可能对本文提供的多肽复合物或双特异性多肽复合物做出响应的障碍或病症。
[0144]
当在本文中使用时，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖类、爬行类等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。
[0145]
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗性治疗和预防性措施两者。需要治疗的个体可以包括已经患有特定医学障碍的个体以及最终可能患上所述障碍的个体。
[0146]
在某些实施方式中，所述病症和障碍包括肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样肉芽肿、默克尔细胞癌和其他血液系统恶性肿瘤，例如经典霍奇金淋巴瘤(chl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、富含t细胞/组织细胞的b细胞淋巴瘤、ebv阳性和阴性ptld、ebv相关弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、浆母细胞性淋巴瘤、淋巴结外nk/t细胞淋巴瘤、鼻咽癌、hhv8相关原发性渗出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统(cns)肿瘤例如原发性cns淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤。
实施例
[0147]
实施例1：研究材料制备
[0148]
1.抗原和其他蛋白的制备
[0149]
免疫原的制备：合成编码pd-1和pd-l1的细胞外结构域(ecd)或全长的dna并插入到表达载体pcdna3.3中。插入的dna序列通过测序来验证。通过将pd-1或pd-l1 ecd基因转染到cho或hek293细胞中来获得含有包括人类fc、小鼠fc和his标签在内的各种标签的融合蛋白pd-1ecd和pd-l1 ecd。5天后，从转染细胞的培养物收获上清液。将所述融合蛋白纯化并定量，以用于免疫和筛选。
[0150]
在实施例中使用基准抗体即wbp315bmk1和wbp315bmk6作为阳性对照。这些基准抗体通过将可变结构域与人类igg4恒定结构域融合来构建。可变结构域的序列来自于已发表的专利。wbp315bmk1根据pct公布号wo2007005874(bms)的12a4克隆合成。wbp315bmk6根据美国专利号us8779108(medimmune)的2.7a4克隆合成。
[0151]
2.细胞系建立
[0152]
为了获得用于抗体筛选和验证的工具，制备了表达pd-1和pd-l1的细胞系。简单来说，使用lipofectamine 2000转染试剂盒，按照制造商的方案将cho-k1或293f细胞用含有全长pd-1或pd-l1的pcdna3.3表达载体转染。转染后2至3天，将转染的细胞在含有杀稻瘟菌素或g418的培养基中培养，以选择在基因组dna中稳定地并入有pd-1或pd-l1基因的细胞。同时，检查插入基因在细胞上的表达。一旦表达被确认，通过有限稀释法挑取感兴趣的单个克隆并放大培养到大体积。然后将建立的单克隆细胞系在含有低剂量抗生素杀稻瘟菌素或g418的培养基中维持培养。
[0153]
实施例2：抗体杂交瘤产生
[0154]
1.免疫接种
[0155]
将6-8周龄sd大鼠用10μg/动物的人类pd-l1 ecd蛋白和10μg/动物的小鼠pd-l1 ecd蛋白与titermax混合后通过足垫注射进行初次免疫，并每周两次用人类pd-l1 ecd蛋白或小鼠pd-l1 ecd蛋白与铝佐剂混合轮流加强免疫。每两周通过酶联免疫吸附测定法(elisa)或流式细胞术(facs)测量血清中的抗体滴度。
[0156]
2.细胞融合
[0157]
当血清抗体滴度足够高时，对大鼠进行最后一次使用不含佐剂的d-pbs中的人类和小鼠pd-l1 ecd蛋白两者的加强。细胞融合按如下进行：准备骨髓瘤细胞sp2/0，在融合前一周将骨髓瘤细胞融化，并每天以1:2的比例传代直至融合前一天，以保持对数生长。将从被免疫sd大鼠的淋巴结分离的b淋巴细胞与骨髓瘤细胞合并(以1:1的比例)。将细胞混合物清洗，并以2
×
106个细胞/ml的密度重悬于ecf溶液中，用于电子细胞融合(ecf)。在ecf后，将来自于融合室的细胞悬液立即转移到含有培养基的无菌试管中，并在37℃温箱中温育至少24小时，然后转移到96孔板中(1
×
104个细胞/孔)。将所述96孔板在37℃、5％co2下温育并定期监测。当克隆足够大时，将100μl上清液从组织培养板转移到96孔测定板，用于筛选。
[0158]
3.杂交瘤上清液的初次和确认筛选
[0159]
使用elisa测定法作为初筛方法来测试杂交瘤上清液与人类或小鼠pd-l1蛋白的结合。简单来说，将培养板(nunc)用1μg/ml的人类或小鼠pd-l1 ecd在4℃包被过夜。在封闭和清洗后，将杂交瘤上清液加入到上述包被的培养板中，并在室温温育1小时。然后将所述培养板清洗，随后与二抗山羊抗大鼠igg hrp(bethyl)温育45min。在清洗后，加入tmb底物，并用2m hcl终止反应。使用微孔板读板器(molecular device)读取450nm处的吸光值。
[0160]
为了确认抗pd-l1抗体对在细胞膜上表达的构象pd-l1分子的结合，使用pd-l1转染的细胞系进行了facs分析。将表达人pd-l1的cho-k1细胞或表达小鼠pd-l1的293f细胞以1
×
105个细胞/孔的密度转移到96孔u形底板(bd)中。然后添加杂交瘤上清液，并与所述细胞在4℃温育1小时。在用1
×
pbs/1％bsa清洗后，加入二抗山羊抗大鼠fitc(jackson immunoresearch lab)，并与细胞在4℃下暗处温育1小时。然后将细胞清洗并重悬浮在1
×
pbs/1％bsa中或用4％聚甲醛固定，然后通过流式细胞术(bd)进行分析。分别使用与亲代cho-k1或293f细胞系结合的抗体作为阴性对照。
[0161]
为了选择潜在的拮抗性抗体，通过facs分析来测试所选抗体阻断pd-1与pd-l1转染的细胞结合的能力。将表达人类pd-l1的cho-k1细胞或表达小鼠pd-l1的293f细胞以1
×
105个细胞/孔的密度转移到96孔u形底板(bd)中。加入杂交瘤上清液，并与所述细胞在4℃
温育1小时。在清洗后，加入小鼠fc融合的人类pd-1蛋白或小鼠fc融合的小鼠pd-1蛋白，并与细胞在4℃温育1小时。将二抗山羊抗小鼠igg fc fitc抗体(对大鼠igg fc无交叉反应性，jackson immunoresearch lab)与细胞在4℃下在暗处温育1小时。然后将细胞清洗并重悬浮在1
×
pbs/1％bsa中或用4％聚甲醛固定，然后通过流式细胞术(bd)进行分析。
[0162]
4.杂交瘤亚克隆
[0163]
在通过初次和确认筛选验证了特异性结合和阻断活性后，将阳性杂交瘤细胞系用于亚克隆。简单来说，对于每个杂交瘤细胞系，对细胞进行计数并稀释，以给出每200μl克隆培养基5个细胞、1个细胞或0.5个细胞。将细胞悬液以200μl/孔铺于96孔板中，一块板密度为5个细胞/孔，一块板密度为1个细胞/孔，四块板密度为0.5个细胞/孔。将板在37℃、5％co2下温育，直至细胞生长到可以进行如上所述的elisa筛选。收集所挑选单克隆的耗尽的上清液，并纯化抗体用于进一步表征。
[0164]
实施例3：抗体杂交瘤细胞序列以及人源化抗体分子的构建和亲和成熟
[0165]
1.抗体杂交瘤细胞序列
[0166]
使用trizol试剂从单克隆杂交瘤细胞分离rna。如下所述扩增抗pd-l1嵌合抗体的vh和vl：首先如本文中所述使用反转录酶将rna反转录成cdna，
[0167][0168]
反应条件
[0169] 步骤1步骤2步骤3步骤4温度25℃37℃85℃4℃时间10min120min5min∞
[0170]
将得到的cdna作为模板，使用特异性引物用于后续pcr扩增。pcr反应如下进行：
[0171]
[0172][0173]
反应条件：
[0174][0175]
将得到的pcr产物(10μl)与pmd18-t载体连接。用10μl连接产物转化top10感受态细胞。阳性克隆使用m13-48和m13-47引物通过pcr，然后通过测序进行检查。
[0176]
2.人源化抗体分子的构建
[0177]
使用“best fit”方法将抗pd-l1抗体的轻链和重链人源化。对于轻链来说，将相应v-基因的氨基酸序列与内部人类种系v-基因数据库进行blast比对。使用kabat cdr定义，通过将排名前二的命中物中的人类互补决定区(cdr)序列用大鼠cdr序列代替，推演出人源化vl-基因的序列。对于重链来说，通过将大鼠框架区与人类种系v-基因数据库进行blast比对，推演出人源化序列。框架区使用扩展cdr定义来定义，其中将kabat cdr1在n-端扩展5个氨基酸。将排名前二的命中物用于推演人源化vh-基因的序列。将人源化基因反向翻译，为哺乳动物表达进行密码子优化，并由geneart costum基因合成(life technologies)进行合成，以表达人源化抗体。
[0178]
通过cdr grafting方法进行的人源化可能导致结合能力的部分或完全丧失。为了恢复结合能力，通过定点突变将人类向小鼠的回复突变引入到人源化vh和vl基因中。具体的氨基酸替换在原始的大鼠和人源化抗体的结构建模的基础上并使用来自于以前的人源化计划的信息来选择。4个人源化vh基因在构架区2和3中含有3个回复突变，5个人源化vl基因在构架区2和3中含有4个回复突变。所有突变使用quick change定点突变试剂盒(agilent technologies)来引入。
[0179]
选择杂交瘤克隆w3152-r11.135.5用于人源化，所述克隆的嵌合抗体被命名为w3152-r11.135.5.xab.igg4l(w3152-r11.135.5.xab.igg4λ)。表3示出了人源化候选物的表达上清液与细胞表面人pd-l1结合的结果。
[0180]
表3.人源化变体与细胞表面人pd-l1的结合
[0181][0182]
3.亲和成熟
[0183]
使用杂交突变方法将亲本克隆w3152-r11.135.5-zab17-igg4l的5个cdr(vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1和vlcdr3)的每个氨基酸单独地突变成其他20种氨基酸。使用含有编码20种氨基酸的nns密码子的dna引物向每个靶向cdr位置引入突变。在杂交突变反应中使用各个简并引物。简单来说，将每个简并引物磷酸化，然后与尿苷化ssdna以10:1的比例使用。将混合物加热至85℃5分钟，然后在1小时过程中冷却至55℃。然后添加t4连接酶和t4 dna聚合酶，并将混合物在37℃温育1.5小时。将vh和vl cdr的合成产物分别合并。通常，将200ng合并的文库dna电转化到bl21中，用于bl21菌苔上的噬斑形成或用于scfv片段的产生。
[0184]
初筛通过单点elisa(spe)测定，其使用在96孔深孔板中生长的细菌的周质提取物(pe)来进行。简单来说，该捕获elisa将96孔maxisorp immunoplate的每个孔用ph 9.2的包被缓冲液(200mm na2co3/nahco3)中的抗c-myc抗体在4℃包被过夜。第二天，将培养板在环
境温度下用casein阻断。然后向培养板中加入scfv pe并在环境温度下温育1小时。在清洗后，向孔添加生物素标记的抗原蛋白，并将混合物在环境温度下温育1小时。然后将其与hrp偶联物在环境温度下温育1小时。hrp活性使用tmb底物来检测，并将反应用2m hcl淬灭。在450nm处读板。挑取在450nm处表现出高于母体克隆的光密度(od)信号的克隆，并一式两份通过elisa(如上所述)重新测定，以确认阳性结果。对重复地表现出高于亲本抗体的信号的克隆进行测序。然后通过定量scfv elisa确定具有cdr改变的每个克隆的scfv蛋白浓度，其中使用浓度已知的scfv作为参比。通过将所述elisa信号与由参比scfv产生的信号进行比较来确定scfv蛋白浓度。对于所有可能的变体来说，在标准化scfv浓度下再次重复结合测定，以确定突变的scfv和亲本抗体的相对结合亲和性。
[0185]
将vh和vl中被确定为对结合抗原有益的点突变进一步组合，以获得额外的结合协同效果。将所述组合突变体表达成scfv并使用捕获elisa进行筛选。对在450nm处表现出比母体克隆更高的od信号的克隆进行测序，并通过如上所述的结合elisa进一步排序。
[0186]
在亲和成熟后，获得总共17个排序靠前的克隆(m1-m17)。表4示出了这17个克隆对人、食蟹猴和小鼠pd-l1的亲和性数据。将所述17个克隆在人igg4骨架上重新编排并通过spr进一步确认。这些候选物对人pd-l1的koff数据示出在表5中。选择w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l用于进一步表征，并重命名为“315e”。
[0187]
表4.通过elisa获得的对人、食蟹猴和小鼠pd-l1的亲和性
[0188][0189]
表5.通过spr获得的对人pd-l1的koff
[0190][0191][0192]
实施例4：抗体表征
[0193]
1.通过spr获得的对人类和食蟹猴pd-l1的亲和性
[0194]
使用proteon xpr36(bio-rad)，通过spr测定法表征抗体对pd-l1的亲和性和结合动力学。通过胺偶联将蛋白a(sigma)固定化到glm传感器芯片(bio-rad)。使纯化的抗体在传感器芯片上流过并被蛋白a捕获。将芯片旋转90
°
并用运行缓冲液(1
×
pbs/0.05％tween20，bio-rad)清洗，直至基线稳定。将5种浓度的人或食蟹猴pd-l1和运行缓冲液以100μl/min的流速流过传感器芯片，结合时间为240s，解离600s。芯片再生后，将5种浓度的小鼠pd-l1和运行缓冲液以100μl/min的流速流过传感器芯片，结合时间为240s，解离600s。在每次运行后将芯片用ph 1.5h3po4再生。结合和解离曲线使用proteon软件通过1:1朗缪尔结合模型来拟合。
[0195]
表6示出了通过spr获得的对人pd-l1的全动力学结合亲和性的结果。表7示出了通过spr获得的对食蟹猴pd-l1的全动力学结合亲和性的结果。
[0196]
表6.通过spr获得的对人类pd-l1的亲和性
[0197]
[0198]
表7.通过spr获得的对食蟹猴pd-l1的亲和性
[0199][0200]
2.与人类、食蟹猴和小鼠pd-l1的交叉反应性(种间交叉)
[0201]
交叉反应性通过facs来测量。简单来说，将构建的分别表达人、食蟹猴或小鼠pd-l1的细胞系以2
×
105个细胞/孔的密度转移到96孔u形底板(bd)中。将测试抗体在清洗缓冲液(1
×
pbs/1％bsa)中稀释，并与细胞在4℃温育1小时。在清洗后，添加二抗山羊抗人类igg fc fitc(jackson immunoresearch lab)并在4℃下在暗处温育1小时。然后将细胞清洗一次，重悬浮在1
×
pbs/1％bsa中，并通过流式细胞术(bd)进行分析。
[0202]
抗pd-l1抗体与细胞表面人类、小鼠和食蟹猴pd-l1的结合的数据分别示出在图1、图2和图3中。所述数据显示，抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l以剂量依赖性方式与细胞表面人、小鼠和食蟹猴pd-l1结合。
[0203]
3.与人类pd-l1家族成员pd-l2的交叉反应性(家族间交叉)
[0204]
将构建的分别表达人pd-l1或pd-l2的细胞系以2
×
105个细胞/孔的密度转移到96孔u形底板(bd)中。将测试抗体在清洗缓冲液(1
×
pbs/1％bsa)中稀释，并与细胞在4℃温育1小时。在清洗后，添加二抗山羊抗人类igg fc fitc(jackson immunoresearch lab)，并在4℃下在暗处温育1小时。然后将细胞清洗一次，重悬浮在1
×
pbs/1％bsa中，并通过流式细胞术(bd)进行分析。
[0205]
抗pd-l1抗体与人类pd-l2的家族间交叉结合试验的结果示出在图4中。所述结果证实抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l与pd-l1特异性结合，并且不与pd-l2结合。
[0206]
4.与pd-l1的配体结合的阻断
[0207]
如实施方式3.1.2中所述，通过facs测试了抗pd-l1抗体阻断pd-1与pd-l1的结合的能力。结果示出在图5和图6中。所述数据证实，抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l可以以剂量依赖性方式阻断人pd-1与pd-l1的结合和小鼠pd-1与pd-l1的结合。
[0208]
通过facs测试了抗pd-l1抗体阻断cd80与pd-l1的结合的能力。简单来说，将抗pd-l1抗体和人类fc融合-pd-l1蛋白在4℃预温育1小时，然后将cd80转染体cho-k1细胞以2
×
105个细胞/孔的密度转移到96孔u形底板。在4℃温育1小时后，将细胞清洗并与山羊抗人igg fc抗体(jackson immunoresearch lab)温育，以检测pd-l1与cd80的结合。在4℃下在暗处温育1小时后，将细胞清洗一次，重悬浮在1
×
pbs/1％bsa中，并通过流式细胞术(bd)进行分析。
[0209]
pd-l1/cd80结合竞争的结果示出在图7中。所述数据证实抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l可以以剂量依赖性方式阻断人类cd80与pd-l1的结合。
[0210]
5.通过基于细胞的测定法测试的抗pd-l1抗体的体外功能
[0211]
5.1人类同种异体混合淋巴细胞反应(mlr)
[0212]
使用ficoll-paque plus(ge)梯度离心从健康供体新鲜分离人类pbmc。使用人类
单核细胞富集试剂盒(stemcell)，按照制造商的说明书分离单核细胞。将细胞在含有重组人类gm-csf和il-4的培养基中培养5至7天，以分化成树突状细胞。在mlr前18至24小时，向培养物添加1μg/ml lps以诱导dcs的成熟。使用人类cd4

t细胞富集试剂盒(stemcell)，按照制造商的说明书分离人类cd4

t细胞。
[0213]
使用混合淋巴细胞反应来测试抗pd-l1抗体对调节t淋巴细胞功能的影响。简单来说，在96孔u形底组织培养板中，在200μl含有10％fcs和1％抗生素的rpmi 1640中进行原代树突状细胞(dc)刺激的mlr。在存在或不存在测试抗体或基准抗体(从166.75nm直至0.00667nm，通常总共6个浓度)的条件下，将dcs与1
×
105cd4

t细胞以1:10至1:200之间的dc:t细胞比例混合。为了确定抗pd-l1抗体对t细胞功能的影响，检测了细胞因子的产生和t细胞增殖。
[0214]
cd4

t细胞增殖通过3h-胸苷掺入测定法来确定。将3h-胸苷(目录号perkinelmer-net027001mc)在0.9％nacl溶液中1:20稀释，并以0.5μci/孔的量添加到细胞培养板。将所述板在5％co2和37℃下培养16至18小时，然后确定3h-胸苷在增殖的细胞中的掺入。
[0215]
人ifn-γ和il-2使用配对的抗体对通过elisa来测量。将板分别用特异性抗人ifn-γ(目录号pierce-m700a)或il-2(目录号r&d-mab602)的捕获抗体预包被。使用生物素偶联的抗ifn-γ抗体(目录号pierce-m701b)或抗il-2抗体(目录号r&d-baf202)作为检测抗体。
[0216]
图8、9和10分别示出了抗pd-l1抗体对il-2和ifn-γ分泌和t细胞增殖的影响。证实了抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l可以增强人类il-2和ifn-γ分泌并促进t细胞增殖。
[0217]
5.2人类自体混合淋巴细胞反应
[0218]
在这个测定法中，cd4

t细胞和dc来自于同一供体。简单来说，将新鲜分离的pbmc在cmv pp65肽和低剂量il-2(通常为20u/ml)存在下进行培养。同时，通过将来自于同一供体pbmc的单核细胞在重组人类gm-csf和il-4中培养，产生dcs。5天后，将从cmv pp65肽处理的pbmc富集的cd4

t细胞与用同一种肽预先脉冲1小时的dcs，在不存在或存在抗pd-l1抗体或基准抗体(作为对照)的情况下共培养。第5天，从每个培养物取出100μl上清液，用于通过如上所述的elisa进行ifn-γ测量。cmv pp65特异性t细胞的增殖通过如上所述的3h-胸苷掺入来评估。
[0219]
图11和12示出的人类自体mlr的结果证实了抗pd-l1抗体可以增强人类cd4

t细胞的功能。图11示出了w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l以剂量依赖性方式增加ifn-γ分泌。图12示出了w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l以剂量依赖性方式提高cd4

t细胞增殖。
[0220]
5.3抗pd-l1抗体对调节性t细胞(treg)抑制功能的影响
[0221]
t细胞的亚群treg是关键免疫调节剂，并在维持自身耐受中发挥关键作用。cd4

cd25

treg数量的增加存在于多种癌症患者中，并与不良预后相关。为了确定抗pd-l1抗体是否影响treg的免疫抑制作用，我们在使用或未使用抗pd-l1抗体处理的treg存在下比较了t细胞功能。使用特异性抗cd25抗体微珠(stemcell)，按照制造商的说明书分离cd4

cd25

和cd4

cd25-t细胞。将2000个成熟dc、1
×
105个cd4

cd25-t细胞、1
×
105个treg细胞和抗pd-l1抗体在96孔板中温育。将板在37℃下在5％co2温箱中保持5天。如上所述确定ifn-γ产生
和cd4

cd25-t细胞增殖。
[0222]
图13和14示出了抗体对treg细胞的影响。抗体w3152-r11.135.5-zab17-uigg4l可以通过逆转treg细胞的抑制功能来恢复cd4

cd25-t细胞分泌的ifn-γ(图13)和增殖(图14)。
[0223]
6.adcc和cdc测试
[0224]
pd-l1在各种不同的细胞类型上表达。为了最小化对健康pd-l1阳性细胞的潜在毒性，评估了抗pd-l1抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)的能力。
[0225]
6.1adcc测试
[0226]
将人类树突状细胞和各种不同浓度的抗pd-l1抗体在96孔板中预温育30分钟，然后以50:1的效应细胞/靶细胞比例添加pbmc。将板在37℃下在5％co2温箱中保持6小时。靶细胞裂解通过基于ldh的细胞毒性检测试剂盒(目录号roche-11644793001)来确定。使用微孔板读板器(molecular device)在492nm处读取吸光值。使用赫赛汀诱导的sk-br-3细胞裂解作为阳性对照。
[0227]
图15和16示出了抗pd-l1抗体对pd-l1阳性树突状细胞(图15)和赫赛汀对sk-br-3(图16)的adcc效应，证实了抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l不介导对树突状细胞的adcc活性。
[0228]
6.2cdc测试
[0229]
将人类树突状细胞和各种不同浓度的抗pd-l1抗体在96孔板中混合。以1:50的稀释比例添加人类补体。将板在37℃下在5％co2温箱中保持2小时。靶细胞裂解通过celltiter-glo来确定。使用利妥昔单抗诱导的ramos细胞裂解作为阳性对照。使用微孔板读板器(molecular device)读取发光。
[0230]
图17和18示出了抗pd-l1抗体对pd-l1阳性树突状细胞(图17)和利妥昔单抗对ramos(图18)的cdc效应，证实了抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l不介导对树突状细胞的cdc活性。
[0231]
7.表位分析测试
[0232]
通过facs将抗pd-l1抗体的结合表位与基准抗体进行比较。将在细胞表面上表达人类pd-l1的cho-k1细胞与生物素化基准抗体和测试抗体(在清洗缓冲液中连续稀释)的混合物在4℃温育1小时。将细胞清洗，添加第二抗体链霉亲合素-pe，并在4℃下温育30min。然后将细胞清洗一次，重悬浮在1
×
pbs/1％bsa中，并通过流式细胞术进行分析。
[0233]
图19和20示出了抗体w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l抗wbp315bmk1(图19)和wbp315bmk6(图20)的表位分析的结果。正如在图中所示，w3152-r11.135.5-zab17-m6-uigg4l享有与wbp315bmk1不同的箱，但享有与wbp315bmk6相近或紧密相关的箱。
[0234]
8.表位作图
[0235]
对人类pd-l1进行丙氨酸扫描实验，并评估它们对抗体结合的影响。将人类pd-l1上的丙氨酸残基突变成甘氨酸密码子，并将所有其他残基突变成丙氨酸密码子。对于人类pd-l1 ecd的每个残基来说，使用两个顺序的pcr步骤制造点氨基酸替换。使用quikchange lightning多定点突变试剂盒(agilent technologies,palo alto,ca)，使用编码人类pd-l1的ecd和c-端his标签的pcdna3.3-hpd-l1_ecd.his质粒作为模板，并将一组突变引物用
于第一步pcr。在突变链合成反应后，使用dpn i内切核酸酶消化亲本模板。在第二步pcr中，扩增由cmv启动子、pd-l1的ecd、his标签和单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)多腺苷化信号构成的线性dna表达盒，并在hek293f细胞(life technologies,gaithersburg,md)中瞬时表达。
[0236]
在用于elisa结合测定法的板中，向用2μg/ml山羊抗人类igg fc抗体(bethyl laboratories,montgomery,tx)预包被的板添加单克隆抗体w3152-r11.135.5-zab17-igg4l(2μg/ml)。在与含有定量pd-l1突变体或人类pd-l1-ecd-his蛋白(sino biological,china)的上清液相互作用后，添加hrp偶联的抗his抗体(1:5000；rockland immunochemicals,pottstown,pa)作为检测抗体。将吸光值按照对照突变体的平均值进行标准化。在为结合变化倍数设定另外的截止值(《0.55)后，鉴定到最终确定的表位残基。
[0237]
对抗体w3152-r11.135.5-zab17-igg4l与人类pd-l1的结合活性进行分析，结果示出在图22中。
[0238]
131种pd-l1点突变对抗体结合的影响示出在表8中。检查所有这些残基在hpd-l1晶体结构(pdb编码3bik和4zqk)上的位置，揭示出某些氨基酸(例如tyr160、thr201)不可能直接接触任何抗体。观察到的结合降低最可能由hpd-l1结构在丙氨酸替换后的不稳定性或甚至瓦解引起。在为结合变化倍数设定另外的截止值(《0.55)后，最终确定的表位残基列于表9中。对于w3152-r11.135.5-zab17-igg4l来说，它们是15个残基。
[0239]
因此，将表9中的所有数据在hpd-l1的晶体结构上作图，以做出更好的可视化和比较(图16)。图片上的颜色是为了帮助分辨表位之间的差异。
[0240]
正如在图16中所示，负责人类pd-l1结合的热点残基全都集中在a链、bc环、c’d环、f链、fg环和g链中。所调查的抗体w3152-r11.135.5-zab17-igg4l在结合pd-l1和阻断pd-1中有功能，具有几乎相同的表位。检查hpd-1/hpd-l1复合体晶体结构(pdb编码4zqk，)上的残基位置揭示出这些残基主要位于a、c、f和g链上。w3152-r11.135.5-zab17-igg4l的表位主要由bc环上的残基贡献，其与pd-l1结合位点完全没有交集。这表明w3152-r11.135.5-zab17-igg4l的pd-1阻断功能更多地依赖于它们的由抗体大小提供的空间位阻效应。
[0241]
表8.pd-l1点突变对抗体结合的影响
[0242]
[0243]
[0244]
[0245][0246]
a，结合的变化倍数是相对于几种沉默丙氨酸替换的结合。
[0247]
表9.pd-l1点突变对抗体结合的影响
[0248]
[0249][0250]
9.体内效能研究
[0251]
9.1实验设计
[0252]
表10.体内动物效能实验的分组和给药方案
[0253][0254]
注：
[0255]1n：每个组中的小鼠数目
[0256]2剂量-体积：根据小鼠的体重10μl/g。如果体重减轻超过15％，则给药方案应该被相应地调整。
[0257]
9.2方法
[0258]
9.2.1细胞培养
[0259]
将其中敲入有人类pd-l1基因的mc38-hupd-l1细胞在1640培养基中作为单层培养物体外培养，所述培养基中补充10％胎牛血清、1％潮霉素b的，37℃下和空气中的5％co2的环境中。将肿瘤细胞日常通过胰蛋白酶-edta处理每周两次进行传代培养。收获在指数生长期中生长的细胞并计数，用于肿瘤接种。
[0260]
9.2.2肿瘤接种
[0261]
将每只小鼠用0.1ml pbs中的mc38-hupd-l1肿瘤细胞(5
×
105)在右肋处皮下接种。当平均肿瘤尺寸达到大约144mm3时开始治疗。将测试品按照实验设计表(表10)中所示的预定方案给药到小鼠。
[0262]
9.2.3肿瘤测量和终点
[0263]
主要终点是观察肿瘤生长是否可以被延迟或小鼠是否可以治愈。每周2或3次使用卡尺在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且肿瘤体积使用下述公式以mm3为单位表示：v＝0.5a
×
b2，其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。使用下述公式计算每个组的tgi：tgi(％)＝[1-(t
i-t0)/(v
i-v0)]
×
100；ti是治疗组在指定日期的平均肿瘤体积，t0是治疗组在治疗开始当天的平均肿瘤体积，vi是空白对照组在与ti同一天的平均肿瘤体积，并且v0是空白组在治疗开始当天的平均肿瘤体积。
[0264]
9.3结果
[0265]
9.3.1动物观察和体重变化
[0266]
在整个研究期间没有观察到明显的临床体征。在研究期间所有动物的体重逐渐增加。体重和体重变化的结果示出在图24和25中。在研究期间没有观察到明显的临床体征。因此，在mc38-hupd-l1模型中没有观察到明显的毒性。
[0267]
9.3.2肿瘤生长抑制
[0268]
在整个实验期间密切监测所有小鼠的肿瘤生长，并每周两次测量和记录肿瘤尺寸。在最佳治疗时间点(分组后16天)计算并分析肿瘤生长抑制(tgi
tv
)。肿瘤体积的结果示出在图26中并概述在表11和12中。
[0269]
表11.肿瘤体积的概述
[0270][0271]
注：a，平均值
±
sem
[0272]
表12.肿瘤生长抑制
[0273][0274]
注：
[0275]
a，平均值
±
semb，p值使用t-检验在肿瘤尺寸的基础上计算，治疗组相比于同型对照组。
[0276]
9.3.3结论
[0277]
在本研究中，我们评估了以10mg/kg和30mg/kg给药的315e在治疗已移植到pd-1人源化小鼠中的mc38-hupd-l1鼠类结肠癌中的体内效能。在本研究期间，所有动物的体重逐渐增加。所有治疗过的动物的体重与higg4同型对照组没有明显差异，表明所述测试品在所有测试的剂量水平上没有毒性。在给药后第16天，315e治疗组315e 10mg/kg和315e 30mg/kg的平均肿瘤体积分别为847
±
134mm3和526
±
89mm3。tgi
tv
值分别为15.5％和54.1％。基于统计学分析，315e 30mg/kg与higg4同型对照组相比具有明显更小的平均肿瘤体积(p《0.05)。
[0278]
测试品315e在30mg/kg的剂量水平下表现出对肿瘤生长的显著抑制效应，而在10mg/kg的剂量水平下仅显示出有限的抗肿瘤活性。所有分组的小鼠对所有测试的剂量水平均耐受良好。