一种丹参黄瓜花叶病毒病苗期注射接种的方法

1.本发明涉及植物病毒接种领域，特别地，涉及一种丹参黄瓜花叶病毒病苗期注射接种的方法。


背景技术：

2.丹参是我国一种常用的大宗中药材，被广泛地应用于治疗心脑血管疾病。近年来，丹参的需求量日益增大，种植面积也不断扩大。但是由于丹参在生产上主要通过无性繁殖，感染病毒问题严重，限制了丹参产业的发展。研究表明，丹参病毒病的主要病原为黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，cmv)，可以引起丹参退化，在田间发病率较高，有些田块发病率高达60％-80％，表现为花叶、斑驳、卷叶、黄化和矮化等典型症状，感病植株的根系细小，产量大幅度下降，丹参酮ⅱ等药用成分含量急剧降低，严重影响了丹参的质量和品质。
3.建立植物病毒人工接种方法，将其接种到相关寄主植物上，是研究病毒的致病性和危害性，以及筛选该寄主植物抗性品种的前提和基础。机械摩擦接种法是目前常用的一种植物病毒接种方法，但是机械摩擦接种需要较多的感病材料，且对感病材料的寄主范围有一定要求，有的植物只有用同属或同种感病植物的汁液摩擦才能成功侵染。此外，机械摩擦接种需要事先在叶片上喷洒金刚砂，造成微伤口为病毒的侵染提供条件。但金刚砂的用量不好控制，费时费力有一定技术难度。目前，还没有关于植物病毒通过机械摩擦接种成功侵染丹参的报道。关于丹参病毒病的研究，主要采用田间自然发病的方式，该方法通过创造利用发病的自然条件获得感病材料，然而，影响田间发病的因素很多，如温度、湿度、病原微生物数量等，需要建立病圃、鉴定周期长、人力成本高，结果不稳定，实验批次重复性差。此外，丹参病毒病是由多种植物病毒引起的，对接种结果的影响比较复杂，如果田间自然发病无法明确起主要作用的病原的作用，对结果的一致性、客观性和可靠性造成影响。单一病原物接种方法的建立，是研究丹参病毒病致病机制的关键。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对目前缺乏丹参病毒病主要病原——黄瓜花叶病毒在丹参上人工接种体系的现状，针对传统机械摩擦方法的不足，提供一种更为高效、可操作性强的丹参苗期接种方法。该方法不仅实现在苗期对丹参材料的病毒病抗性快速鉴定，还可以为研究黄瓜花叶病毒与丹参间的致病机制提供一个理想模型，对揭示改病毒与寄主植物间互作及病毒演化具有重要的理论价值。
5.本发明采取的技术方案是：以感染了黄瓜花叶病毒的烟草叶片作为毒源的材料，提取叶片中植物总rna，通过注射接种的方式将植物总rna接种到丹参小苗内，成功建立黄瓜花叶病毒对丹参植株的侵染。
6.本发明采用的技术方案具体如下：
7.一种丹参黄瓜花叶病毒苗期接种的方法，从感染了黄瓜花叶病毒的烟草叶片中提取浓度大于等于0.5μg/μl总rna作为接种液，采用针管注射的方式在丹参植株培养至6～8
叶期的叶片背面进行注射接种。
8.进一步地，感染了黄瓜花叶病毒的烟草叶片通过如下方法扩繁：
9.用0.05m pb缓冲液研磨被黄瓜花叶病毒侵染的烟草叶片，将病毒汁液通过机械摩擦方法接种到健康的烟草叶片上扩繁毒源。
10.进一步地，所述烟草为本生烟nicotiana benthamiana或普通烟nicotiana tabacum。
11.进一步地，注射接种具体为：
12.丹参植株培育至6-8叶期，用注射器的针头在丹参第三位和第四位展开叶背面戳3-5个针孔且不能戳透叶片，造成微伤口，将总rna缓慢从叶背面注入完成接种。
13.进一步地，注射接种时每叶片注射接种植物总rna的量为200μl以上。
14.进一步地，接种后丹参苗放置在人工温室培养管理，昼夜温度保持在20-22℃，3天后温度调整为昼夜25℃。
15.本发明提供的丹参黄瓜花叶病毒苗期人工接种方法，比目前生产上采用的田间自然发病法具有接种病原纯和，接种效率高、重复性好等优点。本方法可以在室内进行，条件可控，不受季节和外界环境条件的影响，仅需两周左右就可以鉴定病毒侵染情况，适合用于丹参抗病育种的筛选。同时，注射接种植株叶片的是从病叶中提取的植物总rna，而不是常规的从病毒粒体中提取的病毒rna或病毒侵染性克隆的农杆菌，从而大大简化了实验方法，节约实验成本，并且对无该病毒侵染性克隆的实验室提供了研究该病毒的可能。传统的机械摩擦接种法，喷洒金刚砂的处理损坏了细胞壁，使得病毒通过暴露的膜进入细胞质，这个技术既不能定量，也不能同步感染，难易以对实验处理进行可靠的测定。上述注射接种法可以控制病毒接种量且对叶片锁上较小更接近田间的发病情况。
附图说明
16.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
17.图1为感染黄瓜花叶病毒叶片植物总rna接种丹参苗2周后植株症状图。
18.图2为对发病的丹参系统叶片进行黄瓜花叶病毒外壳蛋白的表达检测结果图。
具体实施方式
19.实施例1病毒侵染的寄主叶片植物组织总rna的提取
20.1、黄瓜花叶病毒毒源扩繁：在健康的本生烟叶片上均匀撒上少量800目金刚砂，取被黄瓜花叶病毒病侵染的本生烟叶片1-2片，用0.05m硼酸缓冲液加入金刚砂充分研磨，双手带干净pe手套蘸取少量病汁液摩擦涂抹整片叶片，2周后可观察到明显发病症状的叶片。
21.2、采集黄瓜花叶病毒病典型症状的本生烟叶片(花叶、皱缩和卷曲)加入液氮充分研磨成粉末，迅速用eppendorf管盛取700μl植物粉末，并加入350μl 80℃预热的水饱和酚(ph5.2-6.0)和等体积的rna提取缓冲液(100mm tris-hcl(ph8.0)，0.1mmlicl，10mm edta，1.0％sds)，振荡15sec；静置5min。加入350ml的氯仿，振荡15sec，放置5min，12000rpm离心15min。
22.3、取上清液至新的rnase-free eppendorf管中，加入等体积4m licl溶液，混匀后-20℃放置5hr以上。然后4℃，12000rpm离心15min。上清转移至新的离心管中。沉淀室温
晾干或超净台吹干。
23.(4)沉淀用70vol％乙醇洗涤一次，可用无水乙醇再次洗涤沉淀，室温晾干或超净台吹干。-20℃保存干粉，接种注射前加入适量的depc ddh2o溶解沉淀获得rna溶液，总rna的浓度大于等于0.5μg/μl，总rna溶液放置冰浴待用。
24.实施例2黄瓜花叶病毒注射接种丹参苗植株
25.1、丹参种子在3wt％次氯酸钠溶液中消毒15min后，用无菌水冲洗3次晾干。东北泥炭土，蛭石和珍珠岩以1:1:1比例混合成种植基质，装入育苗盆中，待基质自然洗水后散播的丹参种子，并在种子上少许覆土，盖上育苗盘盖，待第二片真叶产生后即可进行移栽分苗，每盆分一株，丹参幼苗长至6～8叶期即可接种。
26.2、用1ml无菌注射器取1ml植物总rna，利用注射器上的针头在丹参第3位和第4位叶片背面扎3～5个孔且不戳透叶片，去掉针头后在丹参叶片背面缓慢注入植物总rna，尽量浸润整张叶片，每张叶片注射植物总rna量约200μl。接种后昼夜温度保持在20-22℃，3天后温度调整为昼夜25℃，幼苗正常生长管理即可。
27.3、接种2周后对丹参幼苗进行症状观察，结果图1所示，因为接种创面小，注射接种后的丹参苗长势良好，注射接种无菌水对照的丹参无症状，接种注射黄瓜花叶病叶植物总rna的丹参苗系统叶明显表现出花叶及叶面向下卷曲的症状。
28.实施例3发病丹参植株的病毒western blot检测
29.1、从实施例2中获得黄瓜花叶病毒侵染症状明显的丹参幼苗叶片用于western blot检测，用eppendorf管取100μl体积的液氮中研磨过的植物材料粉末，加入100-150μl 1x蛋白上样缓冲液(100mm tris-hcl(ph 6.8)，20％甘油，4％sds，0.2％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇)，振荡，沸水浴10min，立即置于冰上2min，12000rpm离心10min，取上清置于新的离心管中备用。
30.2、配制page胶(4.5％浓缩胶，12.5％分离胶)，取20μl样品上样至page胶进行电泳，先80v电泳，待样品进入分离胶后，加大电压至120v，电泳至溴酚兰刚刚跑出，停止电泳，用电转移的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(200ma，80min)。转移完毕的硝酸纤维素膜在tbst缓冲液中漂洗一下，转入10ml封闭液(tbst 5％脱脂奶粉)中。37℃封闭至少2hr或4℃封闭过夜。
31.3、封闭完成后，直接在封闭液中加入一定体积的黄瓜花叶病毒cp特异性抗血清，37℃反应至少1hr。将硝酸纤维素膜在tbst缓冲液中漂洗3次，每次10min。将硝酸纤维素膜加入用tbst稀释(1:5000)的ap-a二抗，37℃反应30-60min。再用tbst洗膜3次，每次10min。避光条件下，将硝酸纤维素膜置于含330μg/ml nbt和165μg/ml bcip的碱性磷酸酯酶缓冲液(ap)中显色至条带清晰。结果如图2所示，注射病叶植物总rna的6个样品中均检测出了黄瓜花叶病毒的cp表达，而在注射无菌水对照的丹参植株中检测不到黄瓜花叶病毒cp的表达。说明注射接种两周后，黄瓜花叶病毒能侵染丹参至系统叶，并开始有cp蛋白的表达。多次重复接种实验结果，表明本发明方法的接种成功率高达70-80％。
32.上述方法可以实现黄瓜花叶病毒并对丹参植株的人工接种，且在2周后能够进行系统侵染。注射接种液是从烟草(本生烟或普通烟)病叶中提取的植物总rna，而不是常规的病毒侵染性克隆，从而大大简化了实验方法，对无该病毒侵染性克隆的实验室提供了研究该病毒的可能。此外，注射接种还可以控制单株接种量，对叶片损伤较少更接近田间发病情
况，适合开展黄瓜花叶病毒和丹参寄主间的致病机制研究和抗病毒丹参的种质资源筛选。
33.以上实施例用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。