胰腺内分泌祖细胞及其用途

技术特征：
1.一种体外产生胰腺类器官的方法，其特征在于，所述方法包括：提供内分泌祖细胞；和在适合产生包含功能性β细胞和/或β样细胞的胰腺类器官的条件下，在类器官培养基中体外3d培养所述内分泌祖细胞，优选地，所述类器官培养基还包含三维基质如matrigel
tm
和水凝胶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内分泌祖细胞是从成体胰岛细胞中分离的。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内分泌祖细胞在成体胰岛细胞群内提供。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述成体胰岛细胞为人源，且所述内分泌祖细胞是msln ，其中，任选地，所述内分泌祖细胞还表达upk1b,s100a6,lgals4,sdcbp2,sdc1,igfbp3,hmga1,itgb4,itgb6,hn1,gprc5a,slpi,lamc2,fermt1,mgll,sema3b,tst,sfn,cdh3和procr中的一种或多种。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：使分离的成体人胰岛细胞与抗msln抗体或其抗原结合片段体外接触，之后进行荧光辅助细胞分选(facs)，以分离所述内分泌祖细胞。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述类器官培养基包含如dmem/f12的基础培养基，并补充有以下一种或多种：10-200(例如50)ng ml-1egf，1-50(例如10)ng ml-1
fgf2，1-10(例如3)μm wnt激动剂如chir99021或1-100(例如30)ng/ml wnt替代物如ngs(下一代替代物)，0.1-5(例如0.5)μm tgf-beta通路抑制剂如sb431542或a83-01，10-500(例如100)ng ml-1
bmp抑制剂如noggin，1-10(例如2.5)μm rock抑制剂如y27632，和1-10(例如0.5)μm p38抑制剂sb202190；其中，任选地，所述基础培养基还补充有以下一种或多种：1-5％(例如2％)b27,0.1-5％(例如1％)its,0.1-5(例如2)μg ml-1
肝素和1-100(例如50)ng ml-1
vegfa。7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述成体胰岛细胞为鼠源，所述内分泌祖细胞是procr ，所述3d培养包括与多个内皮细胞共培养，其中，任选地，所述内分泌祖细胞还表达rspo1，fgf1，upk3b，hoxa5和msln中的一种或多种。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将分离的成体鼠胰岛细胞与抗procr抗体或其抗原结合片段体外接触，之后进行荧光辅助细胞分选(facs)，以分离所述内分泌祖细胞。9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养基包含如dmem/f12的基础培养基，并补充有以下一种或多种：10-200(例如50)ng ml-1
egf，1-50(例如10)ng ml-1
fgf2和1-20(例如5)ng ml-1
vegfa；任选地，所述基础培养基还补充有以下的一种或多种：1-5％(例如2％)b27，0.1-5％(例如1％)its，和0.1-5(例如2)μg ml-1
肝素。10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养步骤包括培养直至所述内分泌祖细胞形成直径约100-300μm的集落，并继续培养所述集落以形成直径约150-500μm的胰腺类器官。11.一种体外获得胰腺类器官的方法，其特征在于，所述方法包括：从成体胰腺中富集内分泌细胞，优选地，所述富集通过以下方法的一种或多种：(1)用
tsq(6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺-喹啉)染色分离的成体胰腺细胞，之后进行facs；(2)密度梯度离心分离的成体胰腺细胞；和(3)手工挑选和分离胰岛与成体胰腺；在适合产生包含功能性β细胞和/或β样细胞的胰腺类器官的条件下，在类器官培养基中对富集的内分泌细胞进行3d培养，优选地，所述类器官培养基还包含三维基质。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述类器官培养基包含matrigel
tm
或水凝胶和如dmem/f12的基础培养基，所述基础培养基补充有以下一种或多种：10-200(例如50)ng ml-1
egf，1-50(例如10)ng ml-1
fgf2，1-10(例如3)μm wnt激动剂如chir99021或1-100(例如30)ng/ml wnt替代物如ngs(下一代替代物)，0.1-5(例如0.5)μm tgf-beta通路抑制剂如sb431542或a83-01，10-500(例如100)ng ml-1
bmp抑制剂如noggin，1-10(例如2.5)μm rock抑制剂如y27632，和1-10(例如0.5)μm p38抑制剂sb202190；其中，任选地，所述基础培养基还补充有以下一种或多种：1-5％(例如2％)b27,0.1-5％(例如1％)its,0.1-5(例如2)μg ml-1
肝素和1-100(例如50)ng ml-1
vegfa。13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述胰腺类器官的直径约为50-500或约为100-300μm。14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：通过至少10次、至少20次或至少30次传代使胰腺类器官扩张。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括培养扩张的胰腺类器官约1-12或1-4或2-12周以产生成熟的类器官。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述成熟的类器官能检测葡萄糖并响应葡萄糖而产生和分泌胰岛素。17.一种获得内分泌祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：在体外将成体人胰岛细胞与抗msln抗体或其抗原结合片段接触；和分离与抗msln抗体或其片段结合的msln

内分泌祖细胞，优选地，所述分离使用荧光辅助细胞分选(facs)。18.一种获得内分泌祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：在体外将成体鼠胰岛细胞与抗procr抗体或其抗原结合片段接触；和分离与抗procr抗体或其片段结合的procr

内分泌祖细胞，优选地，所述分离使用荧光辅助细胞分选(facs)。19.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括从成体胰岛细胞中分离出的多个内分泌祖细胞，培养基，和任选还包含多个内皮细胞。20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述类器官培养基还包含三维基质，优选为matrigel
tm
或水凝胶。21.如权利要求19或20所述的组合物，其特征在于，所述成体胰岛细胞为人源，且所述内分泌祖细胞表达msln，并且任选还表达以下的一种或多种：upk1b，s100a6，lgals4，sdcbp2，sdc1，igfbp3，hmga1，itgb4，itgb6，hn1，gprc5a，slpi，lamc2，fermt1，mgll，sema3b，tst，sfn，cdh3和procr。22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述培养基包含如dmem/f12的基础培养基，并补充有以下一种或多种：10-200(例如50)ng ml-1
egf，1-50(例如10)ng ml-1
fgf2，1-10(例如3)μm wnt激动剂如chir99021或1-100(例如30)ng/ml wnt替代物如ngs(下一代替
代物)，0.1-5(例如0.5)μm tgf-beta通路抑制剂如sb431542或a83-01，10-500(例如100)ng ml-1
bmp抑制剂如noggin，1-10(例如2.5)μm rock抑制剂如y27632，和1-10(例如0.5)μm p38抑制剂sb202190；其中，任选地，所述基础培养基还补充有以下一种或多种：1-5％(例如2％)b27,0.1-5％(例如1％)its,0.1-5(例如2)μg ml-1
肝素和1-100(例如50)ng ml-1
vegfa。23.如权利要求19或20所述的组合物，其特征在于，所述成体胰岛细胞为鼠源，且所述内分泌祖细胞表达procr，并且任选还表达rspo1，fgf1，upk3b，hoxa5和msln中的一种或多种。24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述培养基包含如dmem/f12的基础培养基，并补充有以下一种或多种：10-200(例如50)ng ml-1
egf，1-50(例如10)ng ml-1
fgf2和1-20(例如5)ng ml-1
vegfa；任选地，所述基础培养基还补充有以下的一种或多种：1-5％(例如2％)b27，0.1-5％(例如1％)its，和0.1-5(例如2)μg ml-1
肝素。25.一种胰腺类器官，其特征在于，所述类胰腺器官包含从内分泌祖细胞体外分化的功能性β细胞和/或β样细胞，其中，所述内分泌祖细胞是从成体胰岛细胞中分离的。26.如权利要求25所述的类器官，其特征在于，所述胰腺类器官能检测葡萄糖并响应葡萄糖而产生和分泌胰岛素。27.如权利要求25或26所述的类器官，其特征在于，所述胰腺类器官的直径约为50-500μm。28.如权利要求25-27中任一项所述胰腺类器官的用途，用于治疗或预防糖尿病，或用于体外筛选治疗或预防糖尿病的试剂。

技术总结
本文提供了体外衍生自成人胰岛的内分泌祖细胞和类器官及其制备和使用方法。组合物可用于治疗或预防糖尿病、以受损胰岛功能为特征的其他疾病或病症及其症状。的其他疾病或病症及其症状。


技术研发人员：曾艺 王代松
受保护的技术使用者：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
技术研发日：2020.09.17
技术公布日：2022/5/31