使用光可切割连接的无模板酶促多核苷酸合成的制作方法

使用光可切割连接的无模板酶促多核苷酸合成
背景
1.最近对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣增加了，这不仅是因为在许多领域(如合成生物学、crispr-cas9应用和高通量测序)中对合成多核苷酸的需求增加，而且还因为多核苷酸合成的化学方法的局限性，诸如产物长度的上限以及有机溶剂的使用和所需处置，jensen等人，biochemistry,57:1821-1832(2018)。酶促合成因其特异性和效率以及其对温和水性反应条件的要求而具有吸引力。
2.目前，大多数酶促方法采用无模板聚合酶将3
’‑
o封闭的三磷酸核苷重复添加到与支撑物连接的单链引发剂或延长链，然后去封闭直到获得所期望序列的多核苷酸。设计此类酶促合成的实际实施的挑战之一是找到一种成本效益好且高效的方法来从引发剂序列和支撑物上切割所期望的多核苷酸产物。
3.鉴于上述情况，如果方法可用于从它们的单链引发剂高效切割多核苷酸产物，则多核苷酸的酶促合成将得到推进。发明概述
4.本发明涉及用于多核苷酸的无模板酶促合成的方法和试剂盒，其包括从其采用光可切割连接的引发剂高效切割多核苷酸产物的步骤或使得能够进行从其采用光可切割连接的引发剂高效切割多核苷酸产物的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法包括使抗核酸外切酶的dntp与活性链连接、失败序列的核酸外切酶消化以及切割全长多核苷酸产物的最终步骤。在一些实施方案中，本发明涉及合成具有预定序列的多核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)提供引发剂，其通过5’端与固体支撑物连接，并且具有包含游离3’羟基的3
’‑
末端核苷酸以及通过下式限定的内部连接：其中dna1和dna2各自为多核苷酸，并且x为1至12范围内的整数；(b)重复以下循环，直到形成多核苷酸：(i)在延长条件下使所述引发剂或具有游离3
’‑
o-羟基的延长片段与3
’‑
o封闭的三磷酸核苷以及不依赖模板的dna聚合酶反应，使得通过掺入3
’‑
o封闭的三磷酸核苷来延长所述引发剂或所述延长片段，以形成3
’‑
o封闭的延长片段，和(ii)对所述延长片段去封闭，以形成具有游离3
’‑
羟基的延长片段；以及(c)使所述多核苷酸暴露于具有预定强度和波长的光(如uv光)以从所述引发剂切割所述多核苷酸。
5.在一些实施方案中，本发明还包括重复的最终循环，其中所述3
’‑
o封闭的三磷酸核苷是3
’‑
o-氨基-三磷酸核苷，并且其中仅进行所述反应步骤(i)，使得最终的多核苷酸产物具有3
’‑
o-氨基；所述暴露步骤c)产生与具有酮部分的所述固体支撑物连接的可切割产物；并且所述方法还包括步骤d)：使所述最终的多核苷酸产物的3
’‑
o-氨基与与固体支撑物
连接的所述酮部分反应。附图简述
6.图1以图示方式示出了多核苷酸的无模板酶促合成的方法。发明详述
7.本发明的一般原理在本文中被更详细地公开，特别是通过实例的方式，如附图中所示和详细描述的那些实例。然而，应当理解，本发明不将本发明限制于所描述的特定实施方案。本发明可进行各种修改和可替代形式，其细节针对若干实施方案示出。本发明将涵盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等效物和可替代物。
8.除非另有指示，否则本发明的实践可以采用有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述，这些都在本领域的技术范围内。此类常规技术可以包括但不限于合成肽、合成多核苷酸、单克隆抗体的制备和使用，核酸克隆，扩增，测序和分析以及相关技术。此类常规技术的方案可在制造商的产品文献和标准实验室手册中找到，诸如基因组分析：实验室手册系列(第i-iv卷)(genome analysis:a laboratory manual series(vols.i-iv))；pcr引物：实验室手册(pcr primer:a laboratory manual)；和分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)(全部来自冷泉港实验室出版社)；lutz和bornscheuer，编辑，蛋白质工程手册(protein engineering handbook)(wiley-vch,2009)；hermanson,bioconjugate techniques,第2版(学术出版社(academic press),2008)；以及类似文献。
9.本发明涉及无模板酶促合成多核苷酸的方法，其采用通过下式限定的光可切割连接：其中dna1和dna2各自为多核苷酸，并且x为1至12范围内的整数。根据实施方案，光可切割的连接被掺入到通过其5’端与固体支撑物连接的引发剂中。在重复循环(i)和(ii)之后；因此，延长的片段或合成的链(即[dna2])也通过其5’与固体支撑物连接。通过使多核苷酸暴露于光，且更具体地暴露于波长优选为约350nm或更大的uv光，从固体支撑物上切割延长的片段。在一些实施方案中，当合成的链通过其5’端与固体支撑物连接时，上述连接的切割在固体支撑物上留下游离酮基，因此每当合成的链具有通过氨基保护基团保护的末端3
’‑
羟基时，此类氨基保护基团可以与游离酮反应并被捕获。因此，在此类实施方案中，可以使用固体合成支撑物来分离全长序列。可替代地，可出于相同目的添加包含游离酮基的固体支撑物。没有受保护的3
’‑
羟基的合成链可以通过洗涤或通过暴露于3
’→5’
核酸外切酶来去除，然后通过用羟胺衍生物(如甲氧胺)处理可以切割酮与胺反应形成的肟。
[0010]
在一些实施方案中，不同的可切割连接可以被用于将抗核酸外切酶dntp与活性链连接、核酸外切酶消化失败序列(特别是不能连接抗核酸外切酶的dntp的序列)和切割全长多核苷酸产物的最终步骤。如本文中所用的，术语“活性链”意指能够掺入dntp的多核苷酸，例如具有游离3
’‑
羟基的多核苷酸。在示例性实施方案中，可切割的连接可以是核苷酸类似
物，诸如脱氧尿苷、8-氧代-脱氧鸟苷或肌苷，它们被特定的糖基化酶识别(例如尿嘧啶脱氧糖基化酶)，然后是分别针对脱氧尿苷的核酸内切酶viii；针对8-氧代-脱氧鸟苷的8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶；针对肌苷的核酸内切酶v。无模板酶促合成
[0011]
通常，无模板的(或等效地，“不依赖模板”)酶促dna合成的方法包括重复的步骤循环(如图1所示的重复的步骤循环)，其中在每个循环中预定的核苷酸与引发剂或生长链连接。在以下参考文献中描述了无模板酶促合成的一般要素：ybert等人，国际专利公开wo/2015/159023；ybert等人，国际专利公开wo/2017/216472；hyman，美国专利5436143；hiatt等人，美国专利5763594；jensen等人，biochemistry，57:1821-1832(2018)；mathews等人，organic&biomolecular chemistry,doi:0.1039/c6ob01371f(2016)；schmitz等人，organic lett.,1(11):1729-1731(1999)。
[0012]
例如，提供了与固体支撑物(102)连接的具有游离3
’‑
羟基(103)的引发剂多核苷酸(100)。在将3
’‑
o-经保护的dntp有效酶促掺入到引发剂多核苷酸(100)(或延长的引发剂多核苷酸)的3’端上的条件(104)下，引发剂多核苷酸(100)(或随后循环中的延长的引发剂多核苷酸)与3
’‑
o-经保护的dntp以及无模板聚合酶(如tdt或其变体(例如ybert等人，wo/2017/216472；champion等人，wo2019/135007))接触。该反应产生延长的引发剂多核苷酸，其3
’‑
羟基被保护(106)。如果延长的引发剂多核苷酸包含竞争序列，则3
’‑
o-保护基可以被去除，或去保护，并且可以从原来的引发剂多核苷酸切割所期望的序列。可以采用多种单链切割技术中的任一种来进行此类切割，例如，通过在原始引发剂多核苷酸内的预定位置处插入可切割的核苷酸。示例性的可切割核苷酸可以是尿嘧啶核苷酸，其被尿嘧啶dna糖基化酶切割。如果延长的引发剂多核苷酸不包含完整的序列，则3
’‑
o-保护基被去除以暴露游离3
’‑
羟基(103)，并且延长的引发剂多核苷酸进行另一循环的核苷酸添加和去保护。
[0013]
如本文所用的，“引发剂”(或等效术语，诸如“引发片段”、“引发剂核酸”、“引发剂寡核苷酸”等)通常是指具有游离3’端的短寡核苷酸序列，其可以通过无模板聚合酶(如tdt)被进一步延长。在一实施方案中，引发片段是dna引发片段。在可替代的实施方案中，引发片段是rna引发片段。在一些实施方案中，引发片段具有3-100个核苷酸，特别是3-20个核苷酸。在一些实施方案中，引发片段是单链的。在可替代的实施方案中，引发片段是双链的。在一些实施方案中，引发剂可以包含具有tdt可以将3
’‑
o-经保护的dntp与其连接的游离羟基的非核酸化合物，例如baiga，美国专利公开us2019/0078065和us2019/0078126。
[0014]
回到图1，在一些实施方案中，在每个合成步骤中，在3
’‑
o-经保护的dntp存在的情况下，使用无模板聚合酶(如tdt)将核苷酸的有序序列与引发剂核酸连接。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3
’‑
羟基的引发剂；(b)在延伸条件下，在3
’‑
o-经保护的三磷酸核苷存在的情况下，使具有游离3
’‑
羟基的引发剂或延伸中间体与无模板的聚合酶反应，以产生3
’‑
o-经保护的延伸中间体；(c)对延伸中间体进行去保护，以产生具有游离3
’‑
羟基的延伸中间体；以及(d)重复步骤(b)和(c)，直到合成多核苷酸。(有时，术语“延伸中间体”和“延伸片段”可互换使用)。在一些实施方案中，引发剂提供为例如通过其5’端与固体支撑物连接的寡核苷酸。上述方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及去保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预定的孵育期或反应时间后去除未掺入的三磷酸核苷的子步骤(例如通过洗涤)。此类预定的孵育期或反应时间可
以是几秒钟(例如30sec)至几分钟(例如30min)。
[0015]
没有碱基保护的3
’‑
o-封闭的dntp可从商业供应商购得，或使用发表的技术合成，例如，美国专利7057026；guo等人，proc.natl.acad.sci.,105(27):9145-9150(2008)；benner,美国专利7544794和8212020；国际专利公开wo2004/005667、wo91/06678；canard等人，gene(本文中引用的)；metzker等人，nucleic acids research,22:4259-4267(1994)；meng等人，j.org.chem.，14:3248-3252(3006)；美国专利公开2005/037991。可按如下所述合成具有碱基保护的3
’‑
o-封闭的dntp。
[0016]
当采用碱基保护的dntp时，图1的上述方法还可以包括步骤(e)：去除碱基保护部分，在酰基或脒保护基团的情况下，该碱基保护部分可以(例如)包括用浓氨处理。
[0017]
上述方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及去保护步骤之后的加帽步骤以及洗涤步骤。如上所述，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中未延伸的游离3
’‑
羟基与防止加帽链的任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，此类化合物可以是三磷酸双脱氧核苷。在其他实施方案中，可以通过用3
’‑
核酸外切酶活性(例如exo i)处理它们来降解具有游离3
’‑
羟基的非延伸链。例如，参见hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，可以对未能去封闭的链进行处理以去除该链或使其对进一步延伸呈惰性。
[0018]
在一些实施方案中，延伸或延长步骤的反应条件可以包括以下物质：2.0μm纯化的tdt；125-600μm的3
’‑
o-封闭的dntp(例如，3
’‑
o-nh
2-封闭的dntp)；约10至约500mm的卡可基酸钾缓冲液(6.5-7.5的ph)，以及约0.01至约10mm的二价阳离子(例如，cocl2或mncl2)，其中所述延长反应可以在50μl反应体积中，在rt至45℃范围内的温度下进行3分钟。在实施方案中，其中3
’‑
o-封闭的dntp是3
’‑
o-nh
2-封闭的dntp，去封闭步骤的反应条件可以包括以下物质：700mm的nano2；1m的乙酸钠(用乙酸调节ph范围为4.8-6.5)，其中所述去封闭反应可以在50μl体积中，在rt至45℃范围内的温度下进行30秒至几分钟。
[0019]
取决于特定的应用，去封闭和/或切割的步骤可以包括多种化学或物理条件，例如光、热、ph、特定试剂(如能够切割特定化学键的酶)的存在。选择3
’‑
o-封闭基团和相应的去封闭条件的指导可以在以下参考文献中找到，这些参考文献通过引用并入本文中：benner，美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公开wo91/06678；以及下列参考文献。在一些实施方案中，切割剂(有时也被称为去封闭剂或试剂)是化学切割剂，诸如例如二硫苏糖醇(dtt)。在可替代实施方案中，切割剂可以是酶促切割剂，诸如例如磷酸酶，其可以切割3
’‑
磷酸封闭基团。本领域技术人员将理解，去封闭剂的选择取决于所使用的3
’‑
核苷酸封闭基团的类型、是否使用一个或多个封闭基团、引发剂是否与活细胞或生物体或固体支撑物连接等，这使得需要进行温和的处理。例如，膦，如三(2-羧乙基)膦(tcep)可以被用于切割3’o-叠氮甲基，钯络合物可以被用于切割3’o-烯丙基，或亚硝酸钠可以被用于切割3’o-氨基。在具体实施方案中，切割反应涉及tcep、钯络合物或亚硝酸钠，例如参见美国专利8212020，其通过引用并入本文中。
[0020]
如上所述，在一些实施方案中，期望采用两个或更多个封闭基团，这些封闭基团可以使用正交去封闭条件来去除。以下示例性的保护基对可以被用于平行合成实施方案中。应当理解，其他保护基团对或包含多于两个的基团可能可用于本发明的这些实施方案中。3
’‑
o-nh23
’‑
o-叠氮甲基3
’‑
o-nh23
’‑
o-烯丙基3’‑
o-nh23
’‑
o-磷酸酯3
’‑
o-叠氮甲基3
’‑
o-烯丙基3
’‑
o-叠氮甲基3
’‑
o-磷酸酯3
’‑
o-烯丙基3
’‑
o-磷酸酯
[0021]
在活细胞上合成寡核苷酸需要温和的去封闭或去保护的条件，即不破坏细胞膜、不使蛋白质变性、不干扰关键细胞功能等的条件。在一些实施方案中，去保护的条件在与细胞存活相容的生理条件范围内。在此类实施方案中，酶促去保护是可期望的，因为它可以在生理条件下进行。在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团与特定的酶缔合以去除它们。例如，基于酯-或酰基-的封闭基团可以用酯酶(如乙酰酯酶)或类似酶去除，并且磷酸酯封闭基团可以用3’磷酸酶(如t4多核苷酸激酶)去除。例如，可以通过用100mm的tris-hcl(ph 6.5)、10mm的mgcl2、5mm的2-巯基乙醇和一种unit t4多核苷酸激酶的溶液处理来去除3
’‑
o-磷酸酯。反应在37℃的温度下进行一分钟。
[0022]“3
’‑
磷酸酯封闭的”或“3
’‑
磷酸酯保护的”核苷酸是指其中3
’‑
位置处的羟基通过存在的含磷酸酯部分封闭的核苷酸。根据本发明的3
’‑
磷酸酯封闭的核苷酸的实例是核苷酸基(nucleotidyl)-3
’‑
磷酸单酯/核苷酸基-2’,3
’‑
环磷酸酯、核苷酸基-2
’‑
磷酸单酯和核苷酸基-2’或3
’‑
烷基磷酸二酯，以及核苷酸基-2’或3
’‑
焦磷酸酯。也可以使用硫代磷酸酯或此类化合物的其他类似物，只要该取代不会阻止磷酸酶去磷酸化导致游离的3
’‑
oh。
[0023]3’‑
o-酯保护的dntp或3
’‑
o-磷酸酯保护的dntp的合成和酶促去保护的其他实例在以下参考文献中有详细描述：canard等人，proc.natl.acad.sci.,92:10859-10863(1995)；canard等人，gene,148:1-6(1994)；cameron等人，biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；rasolonjatovo等人，nucleosides&nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；ferrero等人，monatshefte fur chemie,131:585-616(2000)；taunton-rigby等人，j.org.chem.,38(5):977-985(1973)；uemura等人，tetrahedron lett.,30(29):3819-3820(1989)；becker等人，j.biol.chem.,242(5):936-950(1967)；tsien,国际专利公开wo1991/006678。
[0024]
在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含修饰的核苷酸或核苷分子，其包含嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖糖部分，所述糖部分具有与其共价连接的可去除的3
’‑
oh封闭基团，使得3’碳原子连接一组结构：-o-z其中
–
z是以下中的任一个：
–
c(r’)
2-o-r”、-c(r’)
2-n(r”)2、-c(r’)
2-n(h)r”、-c(r’)
2-s-r”和
–
c(r’)
2-f，其中每个r”是可去除的保护基团或其一部分；每个r’独立地是氢原子、烷基、取代烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或氨基，或通过连接基团连接的可检测标记；条件是在一些实施方案中，此类取代基具有至多10个碳原子和/或至多5个氧或氮杂原子；或(r’)2表示式＝c(r
”’
)2的基团，其中每个r
”’
可以相同或不同，并且选自氢和卤原子以及烷基，条件是在在一些实施方案中，每个r
’”
的烷基具有1-3个碳原子；并且其中所述分子可以反应产生中间体，其中每个r”被交换为h，或者，其中z是
–
(r’)
2-f，f被交换为oh、sh或nh2，优选oh，该中间体在水性条件下解离得到具有游离3
’‑
oh的分子；条件是其中z是
–
c(r’)
2-s-r”，两个r’基团都不是h。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的r’是烷基或取代的烷基，条件是此类烷基或取代的
烷基具有1至10个碳原子和0至4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-z具有式
–
c(r’)
2-n3。在某些实施方案中，z是叠氮甲基。
[0025]
在一些实施方案中，z是具有或不具有分子量为200或更小的杂原子的可切割有机部分。在其他实施方案中，z是具有或不具有分子量为100或更小的杂原子的可切割有机部分。在其他实施方案中，z是具有或不具有分子量为50或更小的杂原子的可切割有机部分。在一些实施方案中，z是具有或不具有分子量为200或更小的杂原子的酶促可切割的有机部分。在其他实施方案中，z是具有或不具有分子量为100或更小的杂原子的酶促可切割的有机部分。在其他实施方案中，z是具有或不具有分子量为50或更小的杂原子的酶促可切割的有机部分。在其他实施方案中，z是分子量为200或更小的酶促可切割的酯基。在其他实施方案中，z是可被3
’‑
磷酸酶去除的磷酸酯基团。在一些实施方案中，以下3
’‑
磷酸酶中的一种或多种可以与制造商推荐的方案一起使用：t4多核苷酸激酶、小牛肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如可从new england biolabs,beverly,ma获得)
[0026]
在其它实施方案中，3
’‑
封闭的三磷酸核苷酸被3
’‑
o-叠氮甲基、3
’‑
o-nh2或3
’‑
o-烯丙基封闭。
[0027]
在其它实施方案中，本发明的3
’‑
o封闭基团包括3
’‑
o-甲基、3
’‑
o-(2-硝基苄基)、3
’‑
o-烯丙基、3
’‑
o-胺、3
’‑
o-叠氮甲基、3
’‑
o-叔丁氧基乙氧基、3
’‑
o-(2-氰乙基)和3
’‑
o-炔丙基。
[0028]
在一些实施方案中，3
’‑
o-保护基团是电化学不稳定的基团。即，保护基团的去保护或可切割是通过改变导致可切割的保护基团附近的电化学条件来完成的。电化学条件的此类变化可以通过改变或施加物理量(如电压差或光)来引起以激活辅助物质，这反过来会导致保护基位置处电化学条件的变化(如ph升高或降低)。在一些实施方案中，电化学不稳定基团包括例如ph敏感保护基团，其在ph变化至预定值时被切割。在其他实施方案中，电化学不稳定的基团包括保护基团，当还原或氧化条件改变时，例如通过增加或减少保护基团位置处的电压差，其直接被切割。碱基保护基团
[0029]
可以采用多种保护基团(或等效地，“碱基保护部分”)来减少或消除在多核苷酸链延伸过程中二级结构的形成。通常，去除碱基保护基团的条件与去除3
’‑
o-封闭基团的条件是正交的。具体地，当3
’‑
o-封闭基团的去除或去封闭条件为酸性时，则可选择碱基保护基团为碱不稳定的。在此类情况下，由于使用了酸不稳定的5
’‑
o-三苯甲基保护单体，在亚磷酰胺合成化学中开发出了许多碱不稳定的保护基团，例如beaucage和iyer,tetrahedron letters，48(12):2223-2311(1992)。特别地，用于亚磷酰胺化学的酰基和脒保护基团适用于本发明的实施方案(例如，beaucage和iyer(上文引用的)的表2和表3的保护基团)。在一些实施方案中，碱基保护基团是脒，如在beaucage和iyer(上文引用的)的表2中所描述的。通常，碱基保护的3
’‑
o-封闭的三磷酸核苷单体可以通过文献中所描述的方法的常规修改来合成，如以下实例中所描述的。
[0030]
在一些实施方案中，碱基保护基团与三磷酸脱氧腺苷的6-氮、三磷酸脱氧鸟苷的2-氮和/或三磷酸脱氧胞苷的4-氮上。在一些实施方案中，碱基保护基团与所有指定的氮连接。在一些实施方案中，与三磷酸脱氧腺苷的6-氮连接的碱基保护基团选自：苯甲酰基、邻苯二甲酰基、苯氧基乙酰基和甲氧基乙酰基；与三磷酸脱氧鸟苷的2-氮连接的碱基保护基
团选自：异丁酰基、异丁酰氧基乙烯、乙酰基、4-异丙基-苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基和甲氧基乙酰基；并且与三磷酸脱氧胞苷的4-氮连接的碱基保护基团选自：苯甲酰基、邻苯二甲酰基、乙酰基和异丁酰基。
[0031]
在一些实施方案中，与三磷酸脱氧腺苷的6-氮连接的保护基团是苯甲酰基；与三磷酸脱氧鸟苷的2-氮连接的碱基保护基团是异丁酰基或二甲基甲脒；并且与三磷酸脱氧胞苷的4-氮连接的碱基保护基团是乙酰基。
[0032]
在一些实施方案中，与三磷酸脱氧腺苷的6-氮连接的碱基保护基团是苯氧乙酰基；与三磷酸脱氧鸟苷的2-氮连接的碱基保护基团是4-异丙基-苯氧基乙酰基或二甲基甲脒；并且与三磷酸脱氧胞苷的4-氮连接的碱基保护基团是乙酰基。
[0033]
在一些实施方案中，碱基保护部分被去除(即产物被去保护)，并且在同一反应中产物被从固体支撑物上切割。例如，引发剂可以包括核糖尿苷，其可以通过用1m的koh或类似试剂(氨、氢氧化铵、naoh等)处理而被切割以释放多核苷酸产物，所述试剂同时去除碱不稳定的碱基保护部分。延长条件的其他修改
[0034]
除了提供具有碱基保护基团的3
’‑
o-封闭的dntp单体外，延伸反应可以使用热稳定的无模板聚合酶在更高的温度下进行。例如，可以采用具有高于40℃活性的热稳定的无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以采用在40-85℃范围内具有活性的热稳定的无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以采用具有在40-65℃范围内具有活性的热稳定的无模板聚合酶。
[0035]
在一些实施方案中，延伸条件可以包括向延伸反应混合物中添加抑制氢键或碱基堆积的溶剂。此类溶剂包括具有低介电常数的水混溶性溶剂，如二甲亚砜(dmso)、甲醇等。同样，在一些实施方案中，延伸条件可以包括提供离液剂，其包括但不限于正丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、尿素等。在一些实施方案中，延伸条件包括存在二级结构抑制量的dmso。在一些实施方案中，延伸条件可以包括提供抑制二级结构形成的dna结合蛋白，其中此类蛋白包括但不限于单链结合蛋白、解旋酶、dna糖基化酶等。定义
[0036]“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，并且每个意指核苷酸单体或其类似物的线性聚合物。组成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的规则模式的方式与天然多核苷酸特异性结合，如watson-crick类型的碱基配对、碱基堆叠、hoogsteen或反向hoogsteen类型的碱基配对等。此类单体及其核苷间连接可以是天然存在的或可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括pna、硫代磷酸酯核苷间连接、含有允许连接标记(如荧光团)或半抗原的连接基团的碱基等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶促加工(诸如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时)，普通技术人员将理解在那些情况下寡核苷酸或多核苷酸将不包含核苷间连接的某些类似物、糖部分或任何或某些位置处的碱基。多核苷酸的大小范围通常从几个单体单元开始(例如5-40个，此时它们通常被称为“寡核苷酸”)至几千个单体单元。每当多核苷酸或寡核苷酸通过字母序列(大写或小写，如“atgcctg”)表示时，应理解核苷酸从左到右按5
’→3’
顺序排列，并且“a”表示脱氧腺苷，“c”表示脱氧胞苷，“g”表示脱氧鸟苷，并且“t”表示胸苷，“i”表
示脱氧肌苷，“u”表示尿苷，除非另有指示或从上下文中显而易见。除非另有说明，否则术语和原子编号约定将遵循strachan和read,human molecular genetics 2(wiley-liss,new york,1999)中公开的那些。通常多核苷酸包含通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如对于dna的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或对于rna的它们的核糖对应物)；然而，它们也可以包含非天然核苷酸类似物，例如包括修饰的碱基、糖或核苷间连接。本领域技术人员清楚，酶对活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求，例如单链dna、rna/dna双链体等，则为寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适的组成完全在普通技术人员的知识范围内，尤其是在论文(如sambrook等人，molecular cloning，第2版(冷泉港实验室，纽约，1989))和类似参考资料的指导下。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补物的双链体)。普通技术人员从术语使用的上下文中将清楚，旨在哪种形式或哪两种形式。
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本公开不旨在限制于所阐述的特定形式的范围，而是旨在涵盖本文所描述的变化的可替代物、修改和等效物。此外，鉴于本公开，本公开的范围完全涵盖对于本领域技术人员而言可能变得显而易见的其他变化。本发明的范围仅受所附权利要求的限制。