一种瘤胃体外发酵装置及其方法与流程

1.本发明属于动物实验装置领域，涉及一种瘤胃体外发酵装置及其方法。


背景技术：

2.随着畜牧业的蓬勃发展，有关牛、羊和鹿等经济动物的研究技术不断的加深，关于瘤胃体外发酵相关技术一直是学者们关注的焦点。而关于瘤胃相关的发酵装置具有，成本高、操作困难、干扰因素多等缺点。因此急需一种便捷、简易和成本低廉的瘤胃发酵装置。
3.两步法发酵技术由tilley和terry在1963年以“一级离体消化法”为基础的条件，进行改进提出“二级离体消化法”经过多方面论证和验证，现如今仍然是一些饲料初步研发中较为可靠的发酵技术。主要是通过一些试管和锥形瓶为主要的发酵装置，由于装置简单使用方面因此可以进行大批量试验。该方法主要将整个试验过程分为两大部分，第一部分模拟瘤胃消化过程，将饲料与瘤胃液混合培养48h，第二部分加入胃蛋白酶培养48h，用于模拟真胃和小肠消化过程。一般应用于饲料和微生物实验前期的数据积累。
4.连续培养发酵技术是在许多体外培养技术上的进一步完善。它不但更能准确的模拟瘤胃环境，并且可以保证发酵稳定，培养时间最长可以达数个星期，因此也被称为长期人工瘤胃模拟技术。它长时间稳定主要是将人工唾液(缓冲液)持续的加入发酵罐内，同时将瘤胃罐内产生的发酵产物动态流出的方法。连续培养主要模拟瘤胃的摄取和瘤胃排出，所以该模型是研究瘤胃发酵能力和动态降解率的实验室方法。
5.两步法发酵技术的优势在于，实验装置成本低廉，可以随时更换发酵底物，同时可以进行数量较大的实验，缺点是无法探究更深层次的实验，只能限于瘤胃发酵前的数据积累和预实验。而连续培养发酵技术优势在于实验数据更为全面合理，可以探究瘤胃深层次实验数据。缺点较为明显，主要是实验装置成本过于昂贵，实验条件过于苛刻。可见瘤胃体外发酵实验中需要一种成本低廉、操作简单、多数据挖掘的装置。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的是提供一种瘤胃体外发酵装置，解决目前的瘤胃模拟装置过于昂贵，实验条件过于苛刻，不适于大批量试验的问题。
7.本发明的第二目的是提供上述瘤胃体外发酵装置的方法。
8.本发明通过以下技术方案来实现：
9.一、一种瘤胃体外发酵装置，包括锥形瓶、套管和套管塞，所述的套管中央纵向设有通道，套管底端开有小口，开口处设有横向托架，套管顶端为喇叭口，套管插入到锥形瓶瓶口中，套管塞又插入套管顶端的喇叭口处，套管塞上设有进气管和出气管，出气管又连接单向阀。
10.进一步的，所述的锥形瓶外壁上设有导气管。
11.进一步的，所述的套管外周设有磨砂，锥形瓶瓶口内壁设有磨砂，套管的磨砂部分正好和锥形瓶瓶口的磨砂部分相接触。
12.二、一种根据上述的瘤胃体外发酵装置的使用方法，包括以下步骤：
13.(1)在超净台内，将100ml细胞培养液放入锥形瓶内，所述的细胞培养液的组成为93ml dmem低糖培养基、5ml胎牛血清、2ml 100
×
青链霉素、500ng表皮生长因子、1ml 100
×
胰岛素-转铁蛋白-硒；
14.(2)将经过5
×
青链霉素浸泡10分钟的1cm
×
1cm的瘤胃上皮组织放入套管底部，瘤胃乳头朝向套管内；
15.(3)将套管缓慢放入锥形瓶内，旋转套管，让套管与锥形瓶接口贴合达到隔绝空气的效果，瘤胃组织的另一面正好接触细胞培养液的液面；
16.(4)在套管中放入发酵底物，所述的发酵底物由5ml人工唾液、1gtmr、5ml瘤胃液和5ml益生菌组成；
17.(5)使用套管塞旋紧套管，向套管塞上的进气管缓慢充入co2，当出气管连接的单向阀有气冒出，人工唾液中刃天青从蓝色变为无色，开始计时5min，然后关闭气阀，使套管内为厌氧环境；
18.(6)将发酵瓶整体缓慢移入co2培养箱内39℃进行培养。
19.进一步的，所述的人工唾液包括蒸馏水465ml，微量元素液0.12ml，缓冲液232.5ml，常量元素液232.5ml，刃天青1.2ml，还原液0.699ml，混匀后39℃水浴锅中缓慢充入co2持续15min-20min直至无色。
20.进一步的，所述的微量元素包括cacl
2-2h2o 13.2g，mncl
2-4h2o 10.0g，cocl
2-6h2o 1.0g，fecl
3-6h2o 8.0g，蒸馏水溶解定容至100ml。
21.进一步的，所述的常量元素包括na2hpo
4 5.7g，kh2po
4 6.2g；mgso
4-7h2o 0.06g，蒸馏水溶解定容至1000ml。
22.进一步的，所述的缓冲液包括nahco
3 35.0g，nh4hco
3 410g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，需要现用现配。
23.进一步的，所述的刃天青制备工艺为：用蒸馏水溶解100mg刃天青，冷却并定容至100ml；所述的还原液制备工艺为：将410ml 1mol/l的naoh溶液，na2s-9h2o 625mg，加入95ml蒸馏水，需要现用现配。
24.进一步的，所述的益生菌为嗜酸小球菌或枯草芽孢杆菌。
25.采用上述技术方案的积极效果：本发明提供了一个用于体外发酵培养装置，可以通过本装置进行瘤胃营养吸收代谢的相关实验，装置结构简单，成本低廉，为体外发酵提供一种新的发酵思路，为瘤胃相关动物实验提供一个新的思路；相比于同类别的实验装置，具有多种配件搭配，其他装置充入的气体维持时间短或充气不均匀，而本装置可以通过厌氧指示来判断是否构成厌氧环境，维持厌氧环境时间较长，可以同时进行多个实验，操作简单，成本低廉，为体外发酵实验提供实验基础和理论指导。
附图说明
26.图1是本发明的结构示意图；
27.图2是图1中套管底部的仰视图；
28.图3是瘤胃组织切片示意图。
29.图中，1锥形瓶，2套管，3套管塞，4托架，5进气管，6出气管，7单向阀，8导气管。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
31.本发明中生物材料的来源：
32.1、嗜酸小球菌(嗜酸乳杆菌)：编号：cgmcc 1.12735，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心；
33.2、枯草芽孢杆菌：编号：cgmcc 1.821，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
34.实施例1
35.本实施例说明瘤胃体外发酵装置的结构。
36.图1是本发明的结构示意图，图2是图1中套管底部的仰视图，如图所示，一种瘤胃体外发酵装置，包括锥形瓶1、套管2和套管塞3，所述的套管2中央纵向设有通道，套管2底端开有小口，开口处设有横向托架4，横向托架用于托住瘤胃组织片，套管2顶端为喇叭口，套管2插入到锥形瓶1瓶口中，套管塞3又插入套管2顶端的喇叭口处，套管塞3上设有进气管5和出气管6，出气管6又连接单向阀7。进气管负责通入co2。
37.为了保持锥形瓶内外气压平衡，所述的锥形瓶1外壁上设有导气管8。
38.为了使套管和锥形瓶接触更加严密，防止气体泄漏，所述的套管外周设有磨砂，锥形瓶瓶口内壁设有磨砂，套管的磨砂部分正好和锥形瓶瓶口的磨砂部分相接触。
39.实施例2
40.本实施例说明瘤胃体外发酵装置的使用方法。
41.(1)在超净台内，将100ml细胞培养液放入锥形瓶内，所述的细胞培养液的组成为93ml dmem低糖培养基、5ml胎牛血清、2ml 100
×
青链霉素、500ng表皮生长因子、1ml 100
×
胰岛素-转铁蛋白-硒；
42.(2)将经过5
×
青链霉素浸泡10分钟的1cm
×
1cm的瘤胃上皮组织放入套管底部，瘤胃乳头朝向套管内；
43.(3)将套管缓慢放入锥形瓶内，旋转套管，让套管与锥形瓶接口贴合达到隔绝空气的效果，瘤胃组织的另一面正好接触细胞培养液的液面；
44.(4)在套管中放入发酵底物，所述的发酵底物由5ml人工唾液、1gtmr、5ml瘤胃液和5ml益生菌组成；
45.(5)使用套管塞旋紧套管，向套管塞上的进气管缓慢充入co2，当出气管连接的单向阀有气冒出，人工唾液中刃天青从蓝色变为无色，开始计时5min，然后关闭气阀，使套管内为厌氧环境；
46.(6)将发酵瓶整体缓慢移入co2培养箱内39℃进行培养。
47.试验例
48.1.实验动物
49.实验动物选自大庆市某屠宰场荷斯坦奶牛1头。
50.1.2瘤胃上皮处理
51.准备39℃pbs液2l；00ml烧杯1个；39℃pbs含有青链霉素(5
×
)1l；手术剪刀1把；镊子1把。
52.通过放血处死奶牛，通过外科手术的方式切取瘤胃前腹囊处切除瘤胃10cm
×
10cm
大小组织块。用预热好的39℃pbs导入烧杯中，反复冲洗瘤胃组织块。直至瘤胃组织不再有饲料残渣。装入含有青链霉素的pbs。放入保温箱带回实验室进行后续实验。
53.在超净台内，剥离掉瘤胃的粘膜肌层和浆膜层，使得只剩下粘膜层(既瘤胃上皮)。使用手术刀片将剥离的瘤胃上皮切成直径1cm圆形，分别放入5
×
青链霉素和庆大霉素6μg/ml两性霉素液6μg/ml洗涤30min，用于杀灭瘤胃上皮的细菌和真菌。
54.1.3实验分组
55.材料准备：体外瘤胃上皮培养瓶，由250ml锥形瓶和15ml套管组成。
56.培养液：93ml dmem低糖培养基、5ml胎牛血清、2ml 100
×
青链霉素、500ng表皮生长因子、1ml 100
×
胰岛素-转铁蛋白-硒。
57.发酵底物由5ml人工唾液、1gtmr、5ml瘤胃液和5ml益生菌组成。
58.人工唾液包括蒸馏水465ml，微量元素液0.12ml，缓冲液232.5ml，常量元素液232.5ml，刃天青1.2ml，还原液0.699ml，混匀后39℃水浴锅中缓慢充入co2持续15min-20min直至无色。
59.微量元素包括cacl
2-2h2o 13.2g，mncl
2-4h2o 10.0g，cocl
2-6h2o 1.0g，fecl
3-6h2o 8.0g，蒸馏水溶解定容至100ml。
60.常量元素包括na2hpo
4 5.7g，kh2po
4 6.2g；mgso
4-7h2o 0.06g，蒸馏水溶解定容至1000ml。
61.缓冲液包括nahco
3 35.0g，nh4hco
3 410g，用蒸馏水溶解定容至1000ml，需要现用现配。
62.刃天青：用蒸馏水溶解100mg刃天青，冷却并定容至100ml。
63.还原液制备工艺为：将410ml 1mol/l的naoh溶液，na2s-9h2o 625mg，加入95ml蒸馏水，需要现用现配。
64.益生菌为嗜酸小球菌或枯草芽孢杆菌。
65.表1奶牛tmr日粮配方组成及营养水平
66.试验总共分为6组，1、2、3实验组全部使用瘤胃组织培养瓶进行培养。1组为对照组采用无培养方式，只将瘤胃上皮放进瓶内，无营养液和瘤胃发酵物刺激。2组为标准组采用培养液培养，但无瘤胃发酵物刺激。3组为实验组分别放入培养液和瘤胃发酵物进行刺激。在5％co2培养箱内分别培养0h、2h、4h、8h、16h、24h、36h和48h。最后he染色和测量瘤胃上皮乳头宽度用于评定模型建立是否合理。
67.4组5组6组采用瘤胃发酵装置进行发酵物挥发性脂肪酸的测定，每组3个重复，4组为对照组只加入瘤胃液5ml(4层纱布过滤)、5ml人工唾液、5ml蒸馏水、1gtmr饲料。5组为实验组加入瘤胃液5ml(4层纱布过滤)、5ml人工唾液、5ml嗜酸小球菌菌液、1gtmr。6组为实验组2加入瘤胃液5ml(4层纱布过滤)、5ml人工唾液、5ml枯草芽孢杆菌菌液、1gtmr。
68.表1奶牛tmr日粮配方组成及营养水平
[0069][0070]
样品采集，在连续培养36h后我们收集瓶内发酵液体和瘤胃上皮，我们将瘤胃上皮用pbs处理干净，-80℃冷冻保存。瘤胃发酵液用偏磷酸处理后，送往公司测定挥发性脂肪酸。
[0071]
挥发性脂肪酸结果如表2所示。通过表2结果可见，添加嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的发酵组乙酸和丙酸生成显著高于对照组(p《0.05)，其中添加嗜酸小球菌的发酵组丙酸生成极显著高于对照组(p《0.01)。添加枯草芽孢杆菌的发酵组异戊酸生成显著高于对照组(p《0.05)。添加嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的发酵组戊酸生成极显著高于对照组(p《0.01)。添加嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的发酵组总挥发性脂肪酸含量极显著高于对照组(p《0.01)。添加嗜酸小球菌和枯草芽孢杆菌的发酵组乙酸：丙酸比例极显著高于对照组(p《0.01)。
[0072]
表2挥发性脂肪酸结果
[0073][0074]
注：同行数据肩标含有相同字母差异不显著p》0.05，不含有相同小写字母差异显
著p《0.05，不含有相同大写字母差异极显著p《0.01，数据表示为平均值
±
标准差。
[0075]
综上所述，该发酵装置，厌氧发酵效果较好，并且可以在厌氧发酵的同时对瘤胃上皮组织进行培养，因此应用于厌氧发酵和瘤胃营养代谢相关实验，大大的节省实验成本和实验时间。
[0076]
瘤胃上皮生长实验结果如表3，瘤胃组织切片示意图如图3所示。
[0077]
表3瘤胃上皮乳头宽度差异结果
[0078][0079]
注：同行数据肩标含有相同字母差异不显著p》0.05，不含有相同小写字母差异显著p《0.05，不含有相同大写字母差异极显著p《0.01，数据表示为平均值
±
标准差。
[0080]
如表3所示，对照组与模型组和实验组在0、4、16、36小时具有差异。
[0081]
0h差异解释，虽然瘤胃来源同一头奶牛，但由于切割瘤胃组织块不同，瘤胃上皮乳头宽度出现差异，但随着时间培养可以看出，虽然实验组在0h瘤胃宽度最低，但随着时间增加，瘤胃乳头逐渐变宽。
[0082]
0、4、16、36h对照组瘤胃上皮乳头宽度随着时间延长逐渐减少，且与标准组和实验组显著差异。标准组瘤胃上皮乳头宽度随着时间增长到4h，之后逐渐减少。实验组瘤胃上皮乳头宽度却随着时间延长继续增长且保持稳定。
[0083]
说明在无任何培养下的瘤胃上皮组织，随着时间增加瘤胃乳头变窄最终崩解，而模型组虽然使用血清培养，但无瘤胃内容物刺激，因此也在8h之后瘤胃乳头宽度变窄，但结构完整。实验组在血清和瘤胃内容物刺激下，瘤胃乳头宽度逐渐增加。
[0084]
实验总结：体外发酵装置对瘤胃上皮是否可以正常生长进行实验，通过实验结果可以发现相对于无培养液培养的瘤胃上皮组织，有培养液培养与培养液加益生菌刺激均有瘤胃乳头宽度增加的趋势，证明瘤胃上皮组织可以正常生长无死亡。培养装置可以对瘤胃上皮组织进行培养。
[0085]
本发明提供了一个用于体外发酵培养装置，可以通过本装置进行瘤胃营养吸收代谢的相关实验，装置结构简单，成本低廉，为体外发酵提供一种新的发酵思路，为瘤胃相关动物实验提供一个新的思路；相比于同类别的实验装置，具有多种配件搭配，其他装置充入的气体维持时间短或充气不均匀，而本装置可以通过厌氧指示来判断是否构成厌氧环境，
维持厌氧环境时间较长，可以同时进行多个实验，操作简单，成本低廉，为体外发酵实验提供实验基础和理论指导。