用于治疗阿尔茨海默病的组合物和方法

用于治疗阿尔茨海默病的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年7月12日提交的美国临时申请第62/873,566号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
技术领域
3.本发明涉及治疗阿尔茨海默病的组合物和方法


背景技术：

4.阿尔茨海默病(ad)是世界范围内最常见的神经退行性疾病之一。仅在2011年，1500万家庭成员就为确诊的阿尔茨海默病(ad)患者提供了超过174亿小时的护理。该护理转化为超过2100亿美元的ad相关服务(alzheimer’s，assn，2012阿尔茨海默病的事实与数字(alzheimer’s disease facts and figures)，阿尔茨海默痴呆(alzheimer’s dement)，2012；8:131-168)。该疾病转化为看护者以及医疗保健系统的巨大医疗和经济负担。到目前为止，还没有开发出有效的治疗方法来治愈或延缓ad的进展(saxena，阿尔茨海默病的生物能量分解：新疗法的目标(bioenergetics breakdown in alzheimer’s disease:targets for new therapies)，int j physical pathophysical pharmacol.2011；3:133-139；等人，阿尔茨海默病中aβ的毒性模式(modes of aβtoxicity in alzheimer’s disease)，细胞分子生命科学(cell mol life sci.)2011；68:3359-3375)。到2050年，估计将有1100万至1600万美国人患有该病(alzheimer’s，assn，2012阿尔茨海默病的事实与数字)。阿尔茨海默痴呆，2012；8:131-168；brookmeyer等人，预测阿尔茨海默病的全球负担，阿尔茨海默痴呆，2007；3:186-191)。因此，存在着对于阿尔茨海默病有效治疗的巨大的未满足需求。
5.发明概述
6.一些实施方式提供了包含如下物质的组合物：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂。
7.一些实施方式提供了治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括将组合物给予需要其的对象，其中，所述组合物包含：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂。
8.一些实施方式提供了鼻内给予组合物的方法，所述组合物包含：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂；并且其中，给予包括鼻内递送装置。
附图说明
9.图1a是描述非转基因(ntg)小鼠对照(ctr)组属性的表。图1b是描述转基因(tg)小鼠对照(ctr)组属性的表。图1c是描述ntg和tg小鼠组属性的表，各组接受了含有thc、褪黑素和胰岛素的制剂(tmi制剂)。
10.图2a是在放射状臂水迷宫(radial arm water maze，rawm)前行为测试中ntg和tg小鼠的试验1(t1)和试验5(t5)失误的图。图2b是在放射状臂水迷宫(rawm)前行为测试中ntg和tg小鼠的t1和t5逃避延迟的图。
11.图3a是描绘tg ctr组和tg tmi组的血浆β淀粉样蛋白浓度的柱形图。图3b是描绘在rawm前行为测试中ntg ctr组、ntg tmi组、tg ctr组和tg tmi组中观察到的失误次数的柱形图。
12.图4a是在rawm后行为测试中ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi小鼠组的t1和t5失误的一系列图。图4b是在rawm后行为测试中ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi小鼠组的t1和t5延迟的一系列图。
13.图5a是显示β淀粉样蛋白40(aβ40)和β淀粉样蛋白42(aβ42)血浆浓度和rawm失误的表格。图5b是显示aβ40和aβ42血浆浓度和rawm延迟的表格。
14.图6a为1.5个月后行为测试的免疫细胞群变化的表格。图6b为3个月后行为测试的免疫细胞群变化的表格。
15.图7a是显示ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi小鼠组在1.5个月后行为测试中的cd3 /cd11c 免疫细胞群的柱状图。图7b是显示ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi组在1.5个月后行为测试中的cd3 /cd8 免疫细胞群的柱状图。图7c是显示ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi小鼠组在3个月后行为测试中的cd3 /cd11c 免疫细胞群的柱状图。图7d是显示ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi组在3个月后行为测试中的cd3 /cd8a 免疫细胞群的柱状图。
16.图8a是显示在1.5个月后行为测试的细胞毒性t细胞群测量中所用的ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi组中小鼠的数量和性别的表格。图8b显示在1.5个月后行为测试的细胞毒性t细胞群测量中所用的ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi组中小鼠的属性。
具体实施方式
17.阿尔茨海默病(ad)的特征是与年龄相关的进行性记忆衰退。ad的两个标志是β和τ淀粉样蛋白(amyloid beta and tau)，其与疾病的发展和进展有关。自2003年以来，没有批准新的ad治疗方法，甚至批准的治疗方法也效果有限。本公开提供了用于治疗ad的组合物和方法。
18.定义
19.本文所用术语“一个”、“一种”或“该所述”不仅包括一个构建的方面，还包括一个以上构建的方面。例如，除非另有明确说明，单数形式的“一个”、“一种”或“该所述”包括复数指代物。因此，例如，提到“一个接头”包括指一个/种或多个/种这样的接头，并且提到“一个细胞”则包括指多个/种这样的细胞。
20.当提及数字或数值范围时，术语“约”意味着所提及的数字或数值范围是近似值，例如，在实验可变性和/或统计实验误差范围内，因此数字或数值范围可能会在所述数字或数值范围的
±
10％内改变。
21.本文所用术语“对象”应理解为包括动物，特别是哺乳动物，尤其是人类。
22.如本文所用，缩写“iu”是指“胰岛素单位”。
23.如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以导致阿尔茨海默病或其他神经退行性疾
病或其一种或多种症状的改善、预防阿尔茨海默病或其他神经退行性疾病进展、或导致阿尔茨海默病或其他神经退行性疾病的消退的化合物、化合物组合或组合物的量。
24.除非上下文中另有指明或暗示，术语“处理”或“治疗”指的是治疗性治疗和预防复发的预防性检测，其中，目标是抑制不希望的生理变化或病症，例如，阿尔茨海默病的发展或进展。对于本公开的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的缓解症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态以及缓解(部分或全部)。在某些方面中，“治疗”也表示相对于未接受治疗的预期存活期而言的存活期延长。需要治疗的人包括已经患有该病痛或病症的人，在某些方面还包括容易患有该病痛或病症的人。
25.在阿尔茨海默症的情况中，术语“治疗”包括以下的任何或全部情况：改善情绪、认知和记忆中的一种或多种；减少大脑中的aβ聚集；以及改善与该疾病相关的一种或多种症状。
26.如本文所述，“心理障碍和副作用”是指在接受剂量约为3mg/kg及以上thc的对象中观察到的不良反应，包括但不限于：兴奋(“亢奋”)、线粒体功能下降、app蛋白水平下降、焦虑、妄想、海马神经元缺失和类似影响。
27.如本文所用，“纳米乳剂”是一种非均相混合物，包括有机相分散在水相中，或水相分散在有机相中，其中，乳剂的各相均为离散液滴形式的，各液滴的直径约为5至200nm。
28.组合物
29.一些实施方式提供了包含如下物质的组合物：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂。
30.在一些实施方式中，组合物包含约5μg至约20mg的thc。在其它实施方式中，组合物包含约25μg至约1mg的thc。在其它实施方式中，组合物包含约50μg至约5mg的thc。在一些实施方式中，组合物包含约100μg至约10mg的thc。在其它实施方式中，组合物包含约500μg至约15mg的thc。例如，约5μg、10μg、20μg、25μg、50μg、100μg、250μg、500μg、750μg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg，或其之间的任意值。
31.在一些实施方式中，组合物包含约1mg至约150mg的褪黑素。在其它实施方式中，组合物包含约1mg至约25mg的褪黑素。在其它实施方式中，组合物包含约10mg至约50mg的褪黑素。在一些实施方式中，组合物包含约25mg至约100mg的褪黑素。在其它实施方式中，组合物包含约50mg至约150mg的褪黑素。例如，约1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、40mg、50mg、60mg、80mg、100mg、120mg、140mg、150mg，或其之间的任意值。
32.在一些实施方式中，组合物包含约1iu至约50iu的胰岛素。在其它实施方式中，组合物包含约1iu至约4iu的胰岛素。在其它实施方式中，组合物包含约2iu至约6iu的胰岛素。在一些实施方式中，组合物包含约3iu至约8iu的胰岛素。在其它实施方式中，组合物包含约4iu至约10iu的胰岛素。例如，约1iu、2iu、3iu、4iu、5iu、6iu、7iu、8iu、9iu、10iu、15iu、20iu、25iu、30iu、35iu、40iu、45iu、或50iu，或其之间的任意值。
33.在一些实施方式中，该组合物包含：(i)约25μg至约1mg thc；(ii)约1mg至约150mg褪黑素；和(iii)约1iu至约50iu的胰岛素；以及至少一种赋形剂；其中，组合物被配制为用于鼻内给予的乳剂。在一些实施方式中，所述组合物是油/水乳剂。
34.在一些实施方式中，thc是有机thc、合成thc、屈大麻酚、δ9-thc或thc-a。在一些实施方式中，thc是δ9-thc。
35.在一些实施方式中，thc与褪黑素之比为约1:1至约1:500。在一些实施方式中，thc与褪黑素之比为约1:1至约1:10。在一些实施方式中，thc与褪黑素之比为约1:1至约1:5。在一些实施方案中，thc与褪黑素之比为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5，或其之间的任意值。在一些实施方式中，thc与褪黑素之比为约1:2。
36.在一些实施方式中，thc与褪黑素之比为约1:400至约1:4000。例如，约为1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1250、1:1500、1:1750、1:2000、1:2250、1:2500、1:2750、1:3000、1:3250、1:3500、1:3750、1:4000，或其之间的任意值。
37.在一些实施方式中，thc与胰岛素之比为约1:5至约1:50。例如，约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:13、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50，或其之间的任意值。例如，约1:12或1:13。
38.本发明的药物组合物可根据制备药学上可用的组合物的已知方法来配制。此外，如本文所用，术语“赋形剂”是指任意标准的药学上可接受的载体。赋形剂可以包括稀释剂、佐剂、防腐剂和媒介物，以及植入物载体，以及不与本发明活性成分反应的惰性的无毒固体或液体填料、稀释剂或封装材料。示例包括但不限于：磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水和乳剂，如油/水乳剂。载体可以是包含例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。药学上可接受的赋形剂还包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬质酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(sedds)，例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，药物剂型中使用的表面活性剂，例如吐温(tweens)、泊洛沙姆或其它类似的聚合物递送基质，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质，例如磷酸盐，tris，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电介质，例如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯基吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物，以及羊毛脂。环糊精如α-、β和γ-环糊精，或化学改性的衍生物如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精，或其它增溶的衍生物也可用于提高文中所述的化合物的递送。防腐剂包括但不限于抗氧化剂、抗菌剂和螯合剂。例如，对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯钠和对羟基苯甲酸丙酯钠)、亚硫酸盐、亚硝酸盐、苯甲酸盐、苯甲醇、氯丁醇、苯酚、甲酚、山梨酸、硫柳汞、丙二醇和苯扎氯铵(benalkonium chloride)。制剂见述于已知的且本领域技术人员易获得的许多来源。例如，雷明顿制药科学(remington’s pharmaceutical sciences)(martin ew[1995]，宾夕法尼亚州伊斯顿，麦克出版公司(mack publishing company)，第19版)描述了可用于本发明的制剂。
[0039]
本文所述的药物组合物可经口服、肠胃外、肺、腹腔内、颊(bucally)或作为口服或鼻喷雾剂给予。本文使用的术语“胃肠外”或“肠胃外”指的是给予方式，包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内(intrasternal)、皮下和关节内注射和输液。
[0040]
所述组合物可配制为固体或液体。液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油类(尤其是棉籽油，花生油(groundnut)，玉米油，
胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。在一些实施方式中，液体剂型是鼻内给予的。在一些实施方式中，液体剂型是封装在胶囊中用于口服给予。本领域技术人员理解，当液体组合物包含油和水成分(例如乳剂)或固体和液体成分(例如混悬剂或分散剂)时，特定的附加制剂参数(例如缓冲液的内含物或特定ph值)是指水成分(例如乳剂)和/或液体成分(例如混悬剂或分散剂)。
[0041]
本文所述的组合物可配制为乳剂(例如，纳米乳剂)，其可包括形成thc、褪黑素和胰岛素溶解或悬浮在其中的有机相的一种或多种油和/或有机溶剂、水相以及一种或多种乳化剂或表面活性剂。其它成分可以包括：例如，如前文所述的赋形剂(例如，稀释剂、佐剂、防腐剂和媒介物，以及植入物载体，以及不与本发明活性成分反应的惰性的无毒固体或液体填料、稀释剂或封装材料)。油和/或有机溶剂包括但不限于卵磷脂、中链甘油三酯油(mct)、大麻油和鱼油。乳化剂和/或表面活性剂包括但不限于：聚乙二醇(如peg 400)、甘油、普流罗尼克(pluronic)f68、聚山梨酯(如聚山梨酯20)和鲸蜡硬脂醇聚醚20。
[0042]
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种增溶剂。增溶剂在组合物中的存在量可以为约5重量％至约50重量％、约10重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％。例如，增溶剂的存在量可以为约5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％，或其之间的任意值。
[0043]
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种缓冲剂。在一些实施方式中，一种或多种缓冲剂可包括但不限于：柠檬酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、马来酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂或醋酸盐缓冲剂。在一些实施方式中，缓冲液为如下物质中的一种或多种：乳酸锂、乳酸钠、乳酸钾、乳酸钙、磷酸锂、磷酸钠、磷酸钾、磷酸钙、马来酸锂、马来酸钠、马来酸钾、马来酸钙、酒石酸锂、酒石酸钠、酒石酸钾、酒石酸钙、琥珀酸锂，琥珀酸钠，琥珀酸钾，琥珀酸钙，醋酸锂，醋酸钠，醋酸钾，醋酸钙、柠檬酸锂一水合物、柠檬酸钠一水合物、柠檬酸钾一水合物、柠檬酸钙一水合物、柠檬酸锂二水合物、柠檬酸钠二水合物、柠檬酸钾二水合物、柠檬酸钙二水合物、柠檬酸锂三水合物、柠檬酸钠三水合物、柠檬酸钾三水合物、柠檬酸钙三水合物、柠檬酸锂四水合物、柠檬酸钠四水合物、柠檬酸钾四水合物、柠檬酸钙四水合物、柠檬酸锂五水合物、柠檬酸钠五水合物、柠檬酸钾五水合物、柠檬酸钙五水合物、柠檬酸锂六水合物、柠檬酸钠六水合物、柠檬酸钾六水合物、柠檬酸钙六水合物、柠檬酸锂七水合物、柠檬酸钠七水合物、柠檬酸钾七水合物或柠檬酸钙七水合物。缓冲剂在组合物中的存在量为约0.01重量％至约5重量％。
[0044]
在一些实施方式中，制剂的ph为约2至约7。例如，制剂的ph可以为约3至约4。在一些实施方式中，制剂的ph为约3.5。
[0045]
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种甜味剂。可以将甜味剂添加至液体制剂中以使得其不太苦和/或可口。适用于包含在制剂中的甜味剂包括天然甜味剂和人造甜味剂。在一些实施方式中，甜味剂是人造甜味剂，并且可以包括强力或高强度甜味剂。强力甜味剂通常用作糖替代品或糖代替品，因为其比糖甜很多倍，但添加到食物中时只贡献很少的热量或不贡献热量。示例性强力甜味剂包括：山梨糖醇，蔗糖，糖精如糖精钠，环己基氨基磺酸盐如环己基氨基磺酸钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、奇异果甜蛋白(thaumatin)和安赛蜜k(acesulfam k)。在一些实施方式中，甜味剂是天然糖。例如，单糖、双糖和多糖等糖可用于本文提供的液体制剂中。糖可以包括：木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、右
旋糖、蔗糖、麦芽糖、部分水解的淀粉或玉米糖浆，以及糖醇，例如山梨醇、木糖醇、甘露醇、甘油及其组合。在一些实施方式中，液体制剂还包含甜味剂。甜味剂可以包括糖。例如，甜味剂可以包括蔗糖。
[0046]
在一些实施方式中，甜味剂在组合物中的存在量可以为约5重量％至约50重量％、约10重量％至约25重量％、或约10重量％至约20重量％。例如，甜味剂的存在量可以为约5重量％、10重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、35重量％、40重量％、45重量％、50重量％，或其之间的任意值。
[0047]
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种矫味剂。一种或多种矫味剂可以包括至少一种天然矫味剂、天然水果矫味剂、人造矫味剂、人造水果矫味剂、风味增强剂或它们的混合物。示例性的矫味剂可以在如下文件中找到：例如，us cfr 21
§
172.515(apr.1,2015)，其通过引用全文纳入本文。例如，肉桂、覆盆子、橙子、枫树、奶油糖果、甘草(欧亚甘草)糖浆、水果、浆果、香草、阿拉伯胶糖浆、古柯(coca)、巧克力薄荷、野樱桃、胡桃、圣草(eriodictyon)、泡泡糖(bubblegum)、葡萄柚、酸橙、蜀葵糖浆(marshmellow)、瓜拉纳、咖啡、桃、柠檬、茴香、杏、蜂蜜、薄荷、鹿蹄草和樱桃。矫味剂在组合物中的存在量可以为约0.01重量％至约2重量％、约0.01重量％至约0.1重量％、或约0.2重量％至约0.5重量％。例如，矫味剂的存在量可以为约0.01重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.7重量％、1.0重量％、1.5重量％、或2.0重量％。在一些实施方式中，矫味剂可以约0.5重量％的量存在于液体制剂中。
[0048]
在一些实施方式中，所述组合物还包含一种或多种着色剂。
[0049]
在一些实施方式中，组合物配制用于鼻内给予。
[0050]
在一些实施方式中，组合物配制用于口服给予。
[0051]
在一些实施方式中，所述组合物是混悬剂或乳剂。在其它实施方式中，所述组合物是乳剂。在一些实施方式中，组合物是纳米乳剂。在一些实施方式中，所述组合物是油/水乳剂。
[0052]
在一些实施方式中，液滴尺寸为约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm、约15nm至约150nm、约20nm至约100nm，或其之间的任意值。在一些实施方式中，液滴尺寸为约1nm至约20nm、约5nm至约50nm、约25nm至约75nm、约50nm至约100nm、约75nm至约150nm、约100nm至约200nm，或其之间的任意值。
[0053]
在一些实施方式中，存在于组合物中的液滴尺寸的分布为约1nm至约500nm、约5nm至约250nm、约10nm至约200nm、约15nm至约150nm、约20nm至约100nm，或其之间的任意值。在一些实施方式中，存在于组合物中的液滴尺寸的分布为约1nm至约20nm、约5nm至约50nm、约25nm至约75nm、约50nm至约100nm、约75nm至约150nm、约100nm至约200nm，或其之间的任意值。
[0054]
用途和治疗方法
[0055]
一些实施方式提供了治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括将组合物给予需要其的对象，其中，所述组合物包含：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂，如上文所述。
[0056]
一些实施方式提供了防止或减少有需要的对象的大脑中病理性tau接种(seeding)和/或扩散的方法，所述方法包括：将组合物给予对象、给予需要其的对象，其中，
组合物包含：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂，如上文所述。
[0057]
一些实施方式提供了防止或减少有需要的对象的大脑中病理性β淀粉样蛋白聚集物接种和/或扩散的方法，所述方法包括：将组合物给予对象、给予需要其的对象，其中，组合物包含：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂，如上文所述。
[0058]
在一些实施方式中，减少量约为10％至100％(防止进一步接种和/或扩散)，约为10％至50％，约为25％至75％，约为50％至100％，或其之间的任意值。
[0059]
一些实施方式提供了提高有需要的对象的大脑中cd8 t细胞和/或树突细胞数量的方法，所述方法包括：将组合物给予对象、给予需要其的对象，其中，组合物包含：(i)四氢大麻酚(thc)；(ii)褪黑素；以及(iii)胰岛素；或上述任意物质药学上可接受的盐；以及至少一种赋形剂，如上文所述。
[0060]
在一些实施方式中，有需要的对象的大脑中cd8 t细胞和/或树突细胞数量的增加为增加约1.1倍至约100倍、约1.1倍至约50倍、约1.1倍至约25倍、约1.1倍至约10倍、约1.1倍至约5倍、约10倍至约40倍、约25倍至约60倍、约40倍至约75倍、约60倍至约90倍、约75倍至约100倍，或其之间的任意值。
[0061]
在一些实施方式中，已经诊断出有需要的对象患有ad。在一些实施方式中，有需要的对象有发展ad的风险。在一些实施方式中，有需要的对象被怀疑患有ad。
[0062]
在一些实施方式中，所述组合物不会导致与高剂量thc相关的心理障碍和副作用。
[0063]
在一些实施方式中，每个剂量给予有需要的对象的总thc至少为0.2μg/kg对象体重。在其它实施方式中，每个剂量给予有需要的对象的总thc为约0.2μg/kg对象体重至约0.16mg/kg对象体重。在其它实施方式中，每个剂量给予有需要的对象的总thc为约0.2μg/kg对象体重至约0.02mg/kg对象体重。例如，约0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg、60μg/kg、80μg/kg、100μg/kg、120μg/kg、140μg/kg、160μg/kg，或其之间的任意值。
[0064]
在一些实施方式中，每个剂量给予有需要的对象的总褪黑素为约0.11mg/kg对象体重。例如，约0.11mg/kg、0.15mg/kg、0.20mg/kg、0.25mg/kg、0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.45mg/kg、0.50mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.65mg/kg、0.70mg/kg、0.75mg/kg、0.80mg/kg、0.85mg/kg、0.90mg/kg、0.95mg/kg、1.00mg/kg、1.05mg/kg、1.10mg/kg，或其之间的任意值。
[0065]
在一些实施方式中，每个剂量给予有需要的对象的总胰岛素为约1iu至约50iu胰岛素。在其它实施方式中，组合物包含约1iu至约4iu的胰岛素。在其它实施方式中，组合物包含约2iu至约6iu的胰岛素。在一些实施方式中，组合物包含约3iu至约8iu的胰岛素。在其它实施方式中，组合物包含约4iu至约10iu的胰岛素。例如，约1iu、2iu、3iu、4iu、5iu、6iu、7iu、8iu、9iu、10iu、15iu、20iu、25iu、30iu、35iu、40iu、45iu、或50iu，或其之间的任意值。
[0066]
在一些实施方式中，所述组合物以6小时间隔；12小时间隔；或24小时间隔给予。在一些实施方式中，组合物以6小时间隔给予。在其它实施方式中，组合物以12小时间隔给予。在其它实施方式中，组合物以24小时间隔给予。
[0067]
在一些实施方式中，给予包括鼻内给予。
n＝10；1.5个月后：ntg ctr n＝7，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝6，tg tmi n＝10；3个月后：ntg ctr n＝11，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10)；脑部可溶和不可溶aβ(ntg ctr n＝11，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10。流式细胞术1.5个月后：ntg ctr n＝9，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10；3个月后：ntg ctr n＝10，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝9)；长期rawm1-15天的行为测试(前行为测试：组合集合1-4(ntg ctr n＝8，ntg tmi n＝7，tg ctr n＝8，tg tmi n＝7)；后行为测试：组合集合1-5(ntg ctr n＝9，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝9)。
[0080]
纳米乳剂制备：为了制备纳米乳液制剂，首先制备油相混合物。称取1.0g的卵磷脂(费希尔公司(fisher)，03376-250，批号153621)。向卵磷脂中添加2ml中链甘油三酯油(由现代运动公司(now sports)提供，100％纯，在本文中也称为“mct”)，以产生油相混合物。向油相混合物中加入2毫升鱼油(卡尔森公司(carlson)，顶级挪威鱼油(finest norwegian fish oil)，柠檬味)。然后使用搅拌混合器在500ml玻璃烧杯中以200rpm的转速在37℃下搅拌油相混合物2小时，直到所有添加的成分溶解。烧杯覆盖保鲜膜。一旦油相混合物的成分溶解，油相混合物在室温下搅拌约12小时(例如过夜)。然后，将δ9-thc、褪黑素和胰岛素添加到油相混合物中，然后油相混合物在室温下以200rpm搅拌1小时。然后，通过在50ml锥形管中混合1ml聚乙二醇(peg 400)(sigma p-3265，批号81k0326)、0.5ml甘油(sigma g5516-1l，批号shbd3108v)、0.2g对羟基苯甲酸甲酯钠(pb公司(pfaltz and bause)，商品号506130，批号18552，cas号5026-62-0)、0.2g对羟基苯甲酸丙酯钠(spectrum p1457，批号2ec0375)、0.2g普流罗尼克f68(mp biomedical公司，a1288.0500，批号5x010736，cas 9003-11-6)以及水相混合物的总体积达到14ml的足够的水，来制备水相混合物。水相混合物在室温下摇晃30分钟。
[0081]
然后，在50ml锥形管中混合如上所述制备的油相混合物和水相混合物，以得到乳液组合物。向所得乳液组合物中添加水，使乳液组合物的总体积达到20ml。然后乳液组合物以最大速度旋转20分钟(vwr型号：g560)。然后乳液组合物在冰浴中进行三次11分钟的超声乳化循环，在每次11分钟循环之间使乳液组合物冷却。超声循环产生了纳米乳液制剂。超声处理方案为54s脉冲启动和6s脉冲关闭，振幅为90％。超音波仪为来自费舍尔科技公司(fisher scientific)的型号fb120：120w、120v、50/60hz nom，频率：20khz、全尺寸：3a sl0-bld。
[0082]
药物递送：用手约束小鼠，并且6μl纳米乳剂以2μl滴入鼻孔，每天三次，每次间隔1分钟，持续1.5个月或三个月。
[0083]
血液收集和处理：使用edta管通过下颌静脉穿刺(mandibular vein punctuation)采集血液，并使用10μl进行流式细胞术分析。血液结果在1000rcf下离心以收集血浆，然后血浆在-80℃下冷冻以备将来使用。
[0084]
放射状臂水迷宫(rawm)：放射状臂水迷宫测试用于检测接种(vaccination)前后小鼠的认知功能。其包括从开放中央区域辐射的六条游泳路径(臂)，其中，隐藏的逃生平台位于一条臂的末端处。游泳池被多个额外迷宫线索围绕，以允许进行空间导航。在每次试验中，允许小鼠游泳至多60秒以找到逃生平台。在每次试验中，平台位于相同臂中。在第一天，小鼠接受了15次试验，在可见平台(高于水面)和隐藏平台(低于水面)之间交替进行。在第二天，小鼠接受了15次额外试验，所有试验都使用隐藏平台。每次试验的起始臂都不同，因
此，小鼠依靠空间线索来完成任务，而不是学习运动规则。每只小鼠的目标臂是不同的，以避免气味线索使目标臂暴露。进入不正确的臂(臂内的所有四个分支)被视为失误。未能在15秒内进入臂也被视为失误。将三次连续试验的区组(block)的失误取平均值用于数据分析。第二天结束时平均出现1次或更少失误的小鼠被认为达到了学习标准。第三天，进行颠倒试验，将目标平台放置在与原始位置成180
°
的臂上。小鼠接受了15次试验，所有试验都使用隐藏平台。记录了发现并登上平台的延迟时间(最多60秒)。
[0085]
脑组织制备：在rawm试验后，用somnasol(亨利
·
沙因动物健康公司(henry schein animal health)，cat号024352)对小鼠进行麻醉，并用50毫升盐水进行心内灌注。小心取出脑部，然后将右半球冷冻在-80℃。在最终脑组织制备的当天，经冷冻的组织在含有蛋白酶抑制剂(100mm tris[46]，150mm nacl，0.5％doc，1％np-40，0.2％sds，1mm na3vo4，10mm naf，1mm pmsf，20mm亮肽素)的rapi缓冲液中用组织匀浆机(pellet pestle motor)解冻并均质，并进行10秒超声处理，然后在4℃下以21000g离心20分钟。粗蛋白浓度通过bio-rad dc蛋白质分析(伯乐公司(bio-rad)，cat：5000112)测定，并将所有样品调整至相同水平。从该方案获得的上清液储存在-80℃下。将左半球转移至4％多聚甲醛溶液中，以备将来用于免疫组织化学测试。
[0086]
血浆和脑部aβ1-40/1-42水平检测：通过aβ1-40和1-42特异性夹心elisa试剂盒(美国佛罗里达州的超级纳米生物技术(mega nano biotech))测量aβ40/42的浓度。简言之，96孔板的每个孔用稀释至1xpbs 10μg/ml的50μl g1-42(山羊抗人aβ1-42)抗体(佛罗里达州的超级纳米生物技术(megananobiotech,fl)，ab-001)包被并在4℃下培养过夜。板洗涤5次，并通过在37℃下添加200μl封闭缓冲液1小时来封闭。在对板进行洗涤后，50μl稀释的检测抗体与50μl稀释的肽标准溶液(aβ1-40(佛罗里达州的超级纳米生物技术，ab40 std)或1-42(佛罗里达州的超级纳米生物技术，ab42-std))或稀释的样品在制备板中混合，然后添加到测定板的各孔中。然后，板在4℃孵育过夜。洗涤后，将100μl稀释的二抗添加到各孔中，并在室温下在定轨振荡器(orbital shaker)上孵育45分钟。板洗涤4次，并将tmb过氧物酶底物(塞摩迪克斯公司(surmodics)，cat:tmbs-1000)添加至各孔，并在室温下孵育10分钟。通过100μl/孔的0.4m h2so4来停止反应。用biotek synergy h4酶标仪(microplate reader)读取450nm处的吸光度。根据肽标准物来计算浓度。
[0087]
统计学分析：使用graphpad prism 6软件分析数据。结果的统计学评估最初使用涉及所有组的单向anova进行。.然后，其通过组间差异事后成对分析进行，然后使用fisher lsd测试。使用皮尔逊相关性分析相关性。统计学显著性水平设定在α＝0.05。结果表示为平均值
±
标准误差(mean
±
sem)。
[0088]
实施例1：纳米乳剂的制备
[0089]
根据下表中的配方和以下方法制备纳米乳剂。
[0090][0091]
油相：中链甘油三酯油(triglyercide oil)和卵磷脂在10ml烧杯中以300rpm在60℃下混合2小时。卵磷脂完全溶解后添加褪黑素和thc，并且在300rpm和60℃下搅拌另外1小时。
[0092]
胰岛素：使15.58mg(28.8u/mg)胰岛素悬浮在1ml h2o和5μl 12n hcl中，并添加水，直至胰岛素完全溶解(总体积约为1.3ml)。
[0093]
水相：在40ml烧杯中制备以下组合物，并在300rpm和室温下混合2小时。
[0094]
1％对羟基苯甲酸甲酯＝0.15mg
[0095]
1％对羟基苯甲酸丙酯＝0.15mg
[0096]
1％普流罗尼克f＝0.15mg
[0097]
2.5％甘油＝0.375ml
[0098]
5％peg 400＝0.75ml
[0099]
水，直至总体积为约9.19ml
[0100]
在制备纳米乳剂的各个成分后，将6.128ml的水相转移至含有3ml油相和0.872ml胰岛素溶液的20ml的塑料瓶中。为了形成初级乳液，将混合物旋转三次，每次10分钟。然后将混合物置于在冰上，在约18-21输出瓦数、95％振幅下以55秒开启和5秒关闭进行10分钟超声处理。在超声处理后，混合物冷却10分钟。随后，超声处理和冷却步骤重复三次。得到的混合物以1:800稀释到水中，并且使用malvern nano zs90测量颗粒尺寸。
[0101]
小鼠策略
[0102]
这项研究的小鼠订购自jax实验室公司(jax laboratory inc.)，在南佛罗里达州大学(university of south florida，usf)动物设施中繁殖，并在12个月龄开始前行为测试(pre-behavior test，也称为“pre”)。将小鼠单独关在笼中，并在控温室内进行12/12小
时的光/暗循环。食物和水可以根据小鼠需要的量和频次提供。治疗开始时，小鼠10个月大。
[0103]
研究开始时有43只小鼠，研究结束时有27只小鼠(18只tg和19只ntg)。图1a-1c列出了每只小鼠的重量和tmi制剂注射体积。“对照”在本文中也称为“ctr”。小鼠各项试验的详细信息列于如下：收集血浆(pre：ntg ctr n＝11，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10；1.5个月后：ntg ctr n＝7，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝6，tg tmi n＝10；3个月后：ntg ctr n＝11，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10)；脑部可溶和不可溶aβ(ntg ctr n＝11，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10。流式细胞术1.5个月后：ntg ctr n＝9，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝10；3个月后：ntg ctr n＝10，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝9)；长期rawm1-15天的行为测试(前行为测试：组合集合1-4(ntg ctr n＝8，ntg tmi n＝7，tg ctr n＝8，tg tmi n＝7)；后行为测试：组合集合1-5(ntg ctr n＝9，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝9)。
[0104]
血液收集和处理：使用edta管通过下颌静脉穿刺(mandibular vein punctuation)采集血液，并使用10μl进行流式细胞术分析。血液结果在1000rcf下离心以收集血浆，然后血浆在-80℃下冷冻以备将来使用。
[0105]
放射状臂水迷宫(rawm)：放射状臂水迷宫测试用于检测接种(vaccination)前后小鼠的认知功能。其包括从开放中央区域辐射的六条游泳路径(臂)，其中，隐藏的逃生平台位于一条臂的末端处。游泳池被多个额外迷宫线索围绕，以允许进行空间导航。在每次试验中，允许小鼠游泳至多60秒以找到逃生平台。在每次试验中，平台位于相同臂中。在第一天，小鼠接受了15次试验，在可见平台(高于水面)和隐藏平台(低于水面)之间交替进行。在第二天，小鼠接受了15次额外试验，所有试验都使用隐藏平台。每次试验的起始臂都不同，因此，小鼠依靠空间线索来完成任务，而不是学习运动规则。每只老鼠的目标臂是不同的，以避免气味线索使目标臂暴露。进入不正确的臂(臂内的所有四个分支)被视为失误。未能在15秒内进入臂也被视为失误。将三次连续试验的区组(block)的失误取平均值用于数据分析。第二天结束时平均出现1次或更少失误的小鼠被认为达到了学习标准。第三天，进行颠倒试验，将目标平台放置在与原始位置成180
°
的臂上。小鼠接受了15次试验，所有试验都使用隐藏平台。记录了发现并登上平台的延迟时间(最多60秒)。
[0106]
脑组织制备：在rawm试验后，用somnasol(亨利
·
沙因动物健康公司(henry schein animal health)，cat号024352)对小鼠进行麻醉，并用50毫升盐水进行心内灌注。小心取出脑部，然后将右半球冷冻在-80℃。在最终脑组织制备的当天，经冷冻的组织在含有蛋白酶抑制剂(100mm tris[46]，150mm nacl，0.5％doc，1％np-40，0.2％sds，1mm na3vo4，10mm naf，1mm pmsf，20mm亮肽素)的rapi缓冲液中用组织匀浆机(pellet pestle motor)解冻并均质，并进行10秒超声处理，然后在4℃下以21000g离心20分钟。粗蛋白浓度通过bio-rad dc蛋白质分析(伯乐公司(bio-rad)，cat：5000112)测定，并将所有样品调整至相同水平。从该方案获得的上清液储存在-80℃下。将左半球转移至4％多聚甲醛溶液中，以备将来用于免疫组织化学测试。
[0107]
血浆和脑部aβ1-40/1-42水平检测：通过aβ1-40和1-42特异性夹心elisa试剂盒(美国佛罗里达州的超级纳米生物技术(mega nano biotech))测量aβ40/42的浓度。简言之，96孔板的每个孔用稀释至1xpbs 10μg/ml的50μl g1-42(山羊抗人aβ1-42)抗体(佛罗里达州的超级纳米生物技术(megananobiotech,fl)，ab-001)包被并在4℃下培养过夜。板洗
涤5次，并通过在37℃下添加200μl封闭缓冲液1小时来封闭。在对板进行洗涤后，50μl稀释的检测抗体与50μl稀释的肽标准溶液(aβ1-40(佛罗里达州的超级纳米生物技术，ab40 std)或1-42(佛罗里达州的超级纳米生物技术，ab42-std))或稀释的样品在制备板中混合，然后添加到测定板的各孔中。然后，板在4℃孵育过夜。洗涤后，将100μl稀释的二抗添加到各孔中，并在室温下在定轨振荡器(orbital shaker)上孵育45分钟。板洗涤4次，并将tmb过氧物酶底物(塞摩迪克斯公司(surmodics)，cat:tmbs-1000)添加至各孔，并在室温下孵育10分钟。通过100μl/孔的0.4m h2so4来停止反应。用biotek synergy h4酶标仪(microplate reader)读取450nm处的吸光度。根据肽标准物来计算浓度。
[0108]
统计学分析：使用graphpad prism 6软件分析数据。结果的统计学评估最初使用涉及所有组的单向anova进行。然后，其通过组间差异事后成对分析进行，然后使用fisher lsd测试。使用皮尔逊相关性分析相关性。统计学显著性水平设定在α＝0.05。结果表示为平均值
±
标准误差(mean
±
sem)。
[0109]
实施例2：在治疗前，tg小鼠在记忆力测试中受损
[0110]
小鼠的记忆力使用rawm测试，其结果显示tg小鼠存在记忆障碍。根据治疗前行为结果和血液β淀粉样蛋白水平对小鼠进行分组。图2a-2b是ntg和tg小鼠的治疗前行为结果。图2a是描述小鼠在rawm游泳池中发生失误的图，图2b是描述小鼠在rawm游泳池中找到平台的延迟结果的图。t1和t5分别表示试验1和试验5。与试验1相比，试验5中的ntg小鼠显著改善，但在tg小鼠中则没有差异。因此，图2a-2b显示tg小鼠存在记忆障碍。图3a-3b描述了基于血浆aβ水平和治疗前行为结果的分组结果。图3a显示出tg ctr组和tg tmi组之间没有差异。图3b是前行为分组结果，表明ntg ctr和tg ctr之间存在显著差异；ntg tmi和tg tmi组之间也存在显著差异，但ntg ctr和ntg tmi组之间以及tg ctr和tg tmi组之间没有差异。图3a-3b显示出小鼠正确分组到各研究组。
[0111]
实施例3：tmi治疗可以减缓tg小鼠的记忆衰退
[0112]
在tmi治疗3个月后进行了记忆测试，证明tmi可以减少tg和ntg小鼠的失误。图4a-4b显示出治疗后通过rawm的行为测试结果。图4a显示了t1与t5的失误测试结果的图。在图4a中，在ntg ctr(第一个图)、ntg tmi(第二个图)和tg tmi(第四个图)组中，试验1和试验5之间存在显著差异，但在tg ctr(第三个图)组中没有差异。图4b是描绘多个组延迟差异的一系列图。在图4b中，第一个图是ntg ctr，第二个图是ntg tmi，第三个图是tg ctr，第四个图是tg tmi。图4b显示出在对试验1和试验5进行比较时，所有组的延迟均无变化。(ntg ctr n＝9，ntg tmi n＝9，tg ctr n＝10，tg tmi n＝9)。
[0113]
这些结果显示，在三个月的每天治疗后，记忆力显著改善。血浆淀粉样蛋白和脑部淀粉样蛋白水平与记忆相关任务的表现高度相关。
[0114]
实施例4：血液和脑部淀粉样蛋白负荷量与行为结果相关
[0115]
图5a-5b所示的表格显示了多个区组和试验中aβ水平与行为测试之间的相关性分析结果。图5a描绘了失误次数，图5b描绘了延迟。例如，相关性表格显示出，在区组4试验5中，失误和延迟越高的小鼠具有较高的aβ水平。
[0116]
在app/ps1小鼠模型上治疗三个月后，观察到tmi纳米乳剂可以减缓rawm测试的记忆损伤。还显示出，血液和脑部aβ水平与行为表现相关，并且aβ水平越高，失误和延迟越高。
[0117]
实施例5：免疫作用
[0118]
监测外周血液中的免疫细胞，并且观察到tmi制剂可以调节免疫系统。图6a为1.5个月后行为测试的免疫细胞群变化的表格。图6b为3个月后行为测试的免疫细胞群变化的表格。图8a是显示在1.5个月后行为测试的细胞毒性t细胞群测量中所用的ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi组中小鼠的数量和性别的表格。图8b显示在1.5个月后行为测试的细胞毒性t细胞群测量中所用的ntg ctr、ntg tmi、tg ctr和tg tmi组中小鼠的属性。图7a-7d显示了鼻内给予后纳米乳剂的免疫调节作用的柱形图。图7a-7b是1.5个月治疗后树突细胞(图7a)和cd8 t细胞(图7b)的流式细胞术结果柱形图。与ntg-ctr和tg-ctr组相比，ntg-tmi组的树突细胞和cd8 t细胞均显著增加，但在1.5个月治疗后，当tg-ctr组与tg-tmi组相比时没有差异。图7c-7d是3个月治疗后树突细胞(图7c)和cd8 t细胞(图7d)的流式细胞术结果柱形图。与ntg-ctr和tg-ctr组相比，ntg-tmi治疗组显著增加，但ntg-tmi和tg-tmi组之间没有差异。然而，3个月治疗后，各组间的cd8 t细胞群没有差异。这些结果表明，tmi通过使树突细胞群和cd8 t细胞群增加而具有免疫调节作用。
[0119]
本文引用的所有出版物的公开内容均通过引用各自以其全文明确纳入本文，其程度与各出版物单独引用纳入的程度相同。
[0120]
虽然已经描述并说明了治疗阿尔茨海默病的方法的具体实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是可以在不背离本发明广泛精神和原理的情况下进行变化和修改。也应理解本发明的权利要求旨在覆盖本文所述的本发明所有一般特征和特定特征以及本发明范围的所有表述，就语言而言，其可称为落入其间。