体外生产哺乳动物神经元的方法

1.本发明涉及一种体外生产哺乳动物神经元的方法。更具体来说，根据本发明的方法能够生产表达tau蛋白的6种亚型(2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r、0n3r)的神经元。本发明具有与神经变性疾病相关，特别是在诊断和细胞疗法领域中的应用，并且也用于鉴定和开发新的治疗方法。


背景技术：

2.tau是一种多功能蛋白，最初作为一种微管相关胞质蛋白而被鉴定。在成人大脑中表达tau的6种亚型，它们从mapt基因的可选剪接产生。在发育期间tau剪接受到调控，使得不同于表达6种亚型的成人大脑，在胎儿大脑中仅表达tau的最短亚型。
3.tau蛋白的病理性细胞内沉积物的积累是大量被称为tau蛋白病的神经变性疾病的标志(sergeant等，2008)。重要的是应该指出，tau的细胞内沉积物的蛋白质组成(存在的tau亚型的身份)、形态和解剖学分布使得区分各种不同的tau蛋白病成为可能。在阿兹海默氏病(ad)中，6种tau亚型被异常磷酸化并聚集。在皮克氏病中，3r tau亚型占主导地位，而聚集的4r tau形式在皮质基底节变性和进行性核上性麻痹中普遍存在。此外，在患有与17号染色体相关的额颞叶痴呆(ftdp-17)的患者中，在mapt基因中已鉴定到超过50个有害突变。所述鉴定到的突变导致tau蛋白与微管或其他配偶体相互作用的能力降低，或导致4r亚型过度产生，从而导致细胞中3r与4r亚型之间的比率发生变化。
4.在过去的十年中，人类诱导多能干细胞(ipsc)技术为人类疾病建模开辟了新的视角。几个研究组已经证明，ipsc衍生的神经元可以成为研究tau蛋白病的宝贵工具。然而，ipsc衍生的神经元的相对不成熟性对tau病理学的体外重演构成了重大挑战。大量研究表明，“野生型”ipsc衍生的皮层神经元主要表达胚胎tau亚型0n3r(biswas等，2016；hallmann等，2017；imamura等，2016；iovino等，2015；sato等，2018；silva等，2016；verheyen等，2018，2015)。尽管大多数这些研究描述了在分化过程中从单一0n3r亚型到3r和4r tau亚型的混合生产的转变，但0n3r tau亚型在很大程度上仍然是主要的亚型。将培养时间延长至长达365天，允许在ipsc衍生的神经元中检测到0n3r、0n4r、1n3r和1n4r tau蛋白亚型(lovino等，2015；sposito等，2015)，但始终以0n3r主。在ipsc衍生的皮层神经元中，在rna水平上也描述了成人tau亚型的存在(ehrlich等，2015)。然而，尚不能检测到相应的蛋白质亚型。在这些ipsc衍生的皮质神经元中只存在胎儿tau亚型0n3r。
5.因此，对成人神经元、也就是说表达tau蛋白的6种亚型的神经元存在着需求，以便能够研究tau蛋白病，特别是与4r tau相关的tau蛋白病。


技术实现要素：

6.在研究神经元分化和tau蛋白的各种不同亚型在成人中的表达时，本发明人发现，通过将干细胞在允许进行3d培养的基于藻酸盐的中空细胞微区室中，在能够进行神经元分化的培养基中培养，可以在体外生产表达6种亚型的神经元。在有利情况下，这个步骤在生
物反应器中进行，在所述生物反应器中所述微区室保持悬浮在所述神经元分化培养基中。本发明人还证实，通过使用包含氯化钠、神经活性无机盐、甘氨酸、l-丙氨酸和l-丝氨酸的特定神经元分化培养基，可以在5至50周之间的相对短的时间内获得包含tau蛋白的6种亚型的有丝分裂后神经元细胞。由此，本发明人开发了用于在仅仅几周后获得此类神经元的培养方法。
7.因此，本发明的一个主题是一种体外生产哺乳动物神经元的方法，所述哺乳动物神经元表达tau蛋白的6种亚型(2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r、0n3r)，所述方法包括神经元分化的步骤，根据所述步骤对细胞微区室进行培养，每个细胞微区室包含围绕有丝分裂后神经元细胞和细胞外基质的中空水凝胶胶囊，所述神经元分化步骤在生物反应器中进行，所述细胞微区室保持悬浮在含有神经元分化培养基的所述生物反应器的壳体中5周至100周之间的一段时间。
8.此外，本发明的一个主题是一种体外生产哺乳动物神经元的方法，所述哺乳动物神经元表达tau蛋白的6种亚型(2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r、0n3r)，所述方法包括神经元分化步骤，根据所述步骤，将各自包含围绕有丝分裂后神经元细胞和细胞外基质的中空水凝胶胶囊的细胞微区室，在包含至少一种神经活性无机盐、甘氨酸、l-丙氨酸和l-丝氨酸的神经元分化培养基中培养5周至100周之间、优选地5至50周之间、更优选地10至50周之间、甚至更优选地25至50周之间、25至40周之间、25至35周之间、25至30周之间、20至50周之间、20至40周之间、20至35周之间、20至30周之间或20至25周之间的一段时间。所述化合物神经活性无机盐、甘氨酸、l-丙氨酸和l-丝氨酸各自以维持神经元细胞的存活和神经功能的浓度存在。
9.此外，本发明的一个主题是一种非天然有丝分裂后神经元细胞，其可以利用根据本发明所述的方法来获得，在所述细胞中tau蛋白的6种亚型被表达。
10.非天然有丝分裂后神经元细胞是指通过能够分化成神经元细胞的细胞例如多能细胞在受控条件下的体外培养而获得的细胞，而不是通过从人类受试者例如成人受试者取样而获得的细胞。因此，本发明的一个主题是细胞培养衍生的有丝分裂后神经元细胞，其可以利用根据本发明所述的方法获得，在所述细胞中tau蛋白的6种亚型2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r和0n3r被表达。
11.有利情况下，此类有丝分裂后神经元细胞具有1/3至3之间、更优选地1/2至2之间、甚至更优选地3/4至4/3之间、理想情况下等摩尔比的10％的3r与4r亚型的表达比率。所述2n、1n和0n亚型在有利情况下分别占总亚型的超过3％、超过17％和少于90％，优选地分别占超过5％、超过26％和少于50％，甚至更优选地分别占超过8％、超过45％和少于45％，理想情况下分别占9％、54％和37％。
附图说明
12.[图1]示出了ipsc、nsc和ipsc衍生的神经元的分子表征。ipsc(a)、nsc(b)和分化到各种不同分化点的神经元(c-f)在15、20和25周(15w、20w、25w)时的rt-pcr分析，使用了多能标志物pou5f1(a)、nsc标志物otx-1(b)、特异性针对皮层上层的神经元的两种标志物calb1(c)和reln(d)、作为星形细胞标志物的gfap(e)和少突胶质细胞特异性标志物cldn11(f)。所述细胞在dmem/f12-neurobasal(d/n)或brainphys培养基中分化15、20或25周(w)。
[0013]
[图2]示出了大脑提取物中mapt mrna的6种成人亚型的检测。(a)所分析的各种不同mapt亚型的示意图。根据覆盖外显子1和11的引物的位置计算每个pcr产物的预期尺寸。(b)每个峰对应于不同mapt亚型。y轴显示了采用任意单位的荧光，x轴指示以bp为单位的尺寸。
[0014]
[图3]示出了在ipsc衍生的神经元中成人mapt蛋白和mrna亚型的表达。(a)示出了在从ipsc诱导的神经元中，在15、20和25周的成熟后，通过rt-qpcr分析检测的6种mapt亚型的相对表达。细胞在dmem/f12 neurobasal(d/n)或brainphys培养基中分化15、20或25周(w)。(b)从维持在brainphys中的25周神经元胶囊提取的蛋白质的western印迹分析。用λ磷酸酶进行的处理揭示出存在四种tau亚型，对应于1n4r、1n3r、0n4r和0n3r。2n亚型无法检测。
[0015]
[图4]示出了mapt mrna的6种成人亚型的相对表达的定量。mapt mrna亚型被单独地(a)或根据包含外显子10(b)或包含外显子2和3(c)分组在一起进行定量。(a)数据表示至少两个独立实验的平均标准偏差(sd)。
[0016]
[图5]示出了mapt mrna的成人亚型的检测和定量。在nsc或ipsc衍生的神经元中通过rt-qpcr进行的0n、1n和2n亚型(a)或3r和4r亚型(b)的相对比例的具体分析。神经元细胞在dmem/f12-neurobasal(d/n)或brainphys培养基中分化15、20或25周(w)。对于每个分析(a，b)来说，呈现了所分析的各种不同mapt mrna亚型的示意图、根据引物的位置计算的pcr产物的预期尺寸和代表性电泳图。y轴显示了采用任意单位的荧光，x轴指示以bp为单位的尺寸。(c)在表格中示出了定量值。数据表示至少两个独立实验的平均标准偏差(sd)。
[0017]
[图6]示出了在排除0n3r转录本后mapt mrna的成人亚型的检测和定量。在大脑提取物或在brainphys中维持25周的神经元胶囊中，通过rt-qpcr进行的1n3r、1n4r、2n3r和2n4r转录本(a)或4r-tau亚型(b)的具体分析。(a)引物ex2和ex11的使用使得单独扩增1n和2n亚型成为可能。(b)引物ex1和ex10的使用允许特异性扩增4r亚型。对于每个分析(a，b)来说，呈现了所分析的各种不同mapt亚型的示意图和根据引物的位置计算的pcr产物的预期尺寸。相应的定量值示出在左侧(a：ex2/ex11扩增，b：ex1/ex10扩增)的表格中。右侧的表格(a，b：ex1/ex11)呈现了当使用ex1-ex11同时扩增6种mapt mrna亚型时获得的数据(图4a)，以及在不包括0n亚型的情况下计算的1n3r、1n4r、2n3r和2n4r亚型的相对表达(a)或在不包括3r亚型的情况下计算的0n4r、1n4r和2n4r亚型的相对表达(b)。
具体实施方式
[0018]
本发明涉及一种培养和生产表达tau蛋白的6种亚型2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r、0n3r的有丝分裂后神经元细胞的方法。这种表达谱是成人神经元的特征，并且特别是在胚胎水平上没有发现。到目前为止，体外生产神经元细胞的方法尚未导致表达这6种亚型的神经元细胞的生产。本发明人的功劳是发现并示出了通过将3d细胞培养与分化培养基相结合，可以以高通量并在合理的时间(约几十周)内在体外生产此类神经元。
[0019]
使用含有包封细胞和细胞外基质的外部中空水凝胶壳的细胞微区室是特别有利的，并在本发明的情形中使得促进细胞分化和神经元的成熟直至成人神经元特有的有丝分裂后阶段成为可能。
[0020]
细胞微区室
[0021]
根据本发明的方法使用含有细胞的细胞微区室。每个细胞微区室包含中空交联水凝胶胶囊，其中容纳有包埋在细胞外基质中的细胞。
[0022]
在一个实施方式中，所述水凝胶胶囊含有单个细胞集合体。单个意味着所述胶囊只含有一团细胞，它们可能或多或少地内聚。具体来说，单个细胞集合体被理解为是一种三维细胞结构，其中所述集合体的每个细胞与所述集合体的至少一个其他细胞物理接触。
[0023]
有利情况下，所述细胞自组织成相对于彼此以特定方式定位的细胞集合体，以便产生细胞相互作用和通讯并形成感兴趣的三维微观结构。因此，每个微区室包含水凝胶外层或水凝胶胶囊，其含有自组织细胞的集合体。所述细胞可以在所述水凝胶胶囊内繁殖、变得有组织和/或分化。
[0024]
在本发明的情形中，“外部水凝胶层”或“水凝胶壳”表示由被液体、优选为水溶胀的聚合物链的基质形成的三维结构。这种外部水凝胶层通过使水凝胶溶液交联来获得。在有利情况下，所述水凝胶溶液的聚合物是在经历刺激例如温度、ph、离子等时可交联的聚合物。在有利情况下，所使用的水凝胶溶液在对细胞无毒的意义上是生物相容的。在有利情况下，所述水凝胶层允许溶解的气体(特别是氧气和/或二氧化碳)、营养物和代谢废物扩散，以允许细胞的存活、增殖、分化、成熟和/或感兴趣的分子或分子集合体的产生和/或感兴趣的细胞行为的重演。所述水凝胶溶液的聚合物可以是天然或合成起源的。例如，所述水凝胶溶液含有基于磺酸盐的聚合物例如聚苯乙烯磺酸钠、基于丙烯酸盐的聚合物例如聚丙烯酸钠、聚二丙烯酸乙二酯、明胶甲基丙烯酸酯化合物、多糖和特别是细菌起源的多糖例如结冷胶或植物起源的多糖例如果胶或藻酸盐中的一种或多种聚合物。在一个实施方式中，所述水凝胶溶液至少包含藻酸盐。优选地，所述水凝胶溶液只包含藻酸盐。在本发明的情形中，术语“藻酸盐”是指由β-d-甘露糖醛酸(m)和α-l-古罗糖醛酸(g)形成的直链多糖及其盐和衍生物。在有利情况下，所述藻酸盐是藻酸钠，其由超过80％的g和少于20％的m组成，平均分子质量为100至400kda(例如slg100)，并且总浓度在以密度计0.5％至5％(重量/体积)之间。
[0025]
优选地，所述细胞微区室是封闭的。外部水凝胶层提供了所述细胞微区室的尺寸和形状。所述微区室可以具有与细胞的包封相容的任何形状。
[0026]
优选地，所述细胞外基质层形成凝胶。所述细胞外基质层包含蛋白质和细胞例如多能细胞的培养所需的细胞外化合物的混合物。优选地，所述细胞外基质包含结构蛋白例如层粘连蛋白521、511或421、entactin、玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白以及生长因子例如tgf-β和/或egf。在一个实施方式中，所述细胞外基质层由和/或组成或含有它们。
[0027]
根据本发明，所述微区室可以含有细胞外基质替代物代替细胞外基质。细胞外基质替代物被理解为是能够通过与膜蛋白和/或细胞外信号转导途径相互作用而促进细胞粘附和/或存活的化合物。例如，这种替代物包含生物聚合物及其片段，特别是蛋白质(层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白)、非硫酸化糖胺聚糖(透明质酸)或硫酸化糖胺聚糖(硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素)以及含有源自生物聚合物或再现其性质的基序(rgd基序)的合成聚合物和模拟与衬底的附着的小分子(rho-a激酶抑制剂例如y-27632或thiazovivin)。
[0028]
用于生产在水凝胶胶囊内部含有细胞外基质和细胞的细胞微区室的任何方法均
可用于执行根据本发明的制备方法。具体来说，可以通过调整在alessandri等，2016(“用于生产用于人类神经元干细胞(hnsc)的培养和分化的功能化水凝胶微胶囊的3d打印的微流体装置”(a 3dprinted microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human neuronal stem cells(hnsc))，lab on a chip,2016,第16卷,第9期,第1593-1604页)中描述的方法和微流体装置来制备微区室。
[0029]
在有利情况下，所述细胞微区室的维度受到控制。在一个实施方式中，根据本发明的细胞微区室具有球形形状。优选地，这种微区室的直径在10μm至1mm之间，更优选地在75至750μm之间，更优选地在100至500μm之间，甚至更优选地在150至300μm之间， /-10％。在另一个实施方式中，根据本发明的细胞微区室具有细长形状。具体来说，所述微区室可以具有卵形或管状形状。在有利情况下，这种卵形或管状微区室的最小维度在10μm至1mm之间，更优选地在75至750μm之间，更优选地在100至500μm之间，甚至更优选地在150至300μm之间， /-10％。“最小维度”是指位于水凝胶层的外表面上的点与微区室的中心之间的最小距离的两倍。
[0030]
在一个特定实施方式中，所述外部水凝胶层的厚度占所述微区室半径的5至40％。所述细胞外基质层的厚度占所述微区室半径的5至80％，并且在有利情况下附着到所述水凝胶壳的内侧面。这个基质层可以填充细胞与水凝胶壳之间的空间。在本发明的情形中，层的“厚度”是所述层相对于所述微区室的中心径向延伸的维度。
[0031]
神经元分化培养基
[0032]
根据本发明，表达6种亚型的有丝分裂后神经元细胞在相对短的生产时间，特别是少于100周、更优选地少于50周内获得。为此，将所述微区室维持在神经元分化培养基中。
[0033]
此类培养基对于本领域技术人员来说是已知的。具体来说，可以使用被称为n2b27的培养基(500ml dmem/f12，500ml neurobasal，5ml n2培养基增补剂，10ml b27培养基增补剂)。在有利情况下，这种培养基在第一阶段(前10至15天，神经诱导阶段)中增补有阻断bmp2相关信号传导途径的分子(例如ldn-193189或noggin蛋白)和阻断tgf-β信号传导途径的分子(例如sb-431542)，和/或在任选的第二阶段增补有激活egf-1和fgf-2相关信号传导途径的分子(神经干细胞阶段扩增)，和/或在终末分化阶段增补有激活神经营养性信号传导途径(例如bdnf转导途径)的分子和阻断notch信号转导途径的分子(例如e化合物或另一种γ-分泌酶抑制剂)。
[0034]
在一个特定实施方式中，将所述含有任选地已分化成有丝分裂后神经元细胞的干细胞的细胞微区室，在包含至少一种神经活性无机盐、甘氨酸、l-丙氨酸和l-丝氨酸的特定神经元分化培养基中培养，所述化合物各自以维持神经元细胞的存活和神经功能的浓度存在。本领域技术人员能够调整所述浓度以便维持所述细胞的存活和功能。
[0035]
在本发明的情形中，术语“神经活性”化合物是指显著影响细胞的神经活性(例如电生理活性)的化合物，例如无机盐。这种神经活性可以与野生型神经元细胞在其天然环境中(体内)的神经活性基本上一致。
[0036]
在一个实施方式中，所述至少一种神经活性无机盐选自氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、氯化钙(cacl2)、硫酸镁(mgso4)、氯化镁(mgcl2)、硝酸铁(feno3)、硫酸锌(znso4)、硫酸铜(cuso4)、硫酸铁(feso4)及其组合。在一个实施方式中，所述神经元分化培养基包含氯
化钠和至少一种其他神经活性无机盐。
[0037]
在某些实施方式中，氯化钠的浓度在20至200mm之间，优选地在70至150mm之间，特别是120mm /-10％。
[0038]
其他神经活性无机盐的浓度优选地在0.000001至10mm、0.000005至8mm、0.00001至6mm、0.00005至4mm、0.00005至2mm、0.0001至1mm、0.0005至0.5mm、0.001至0.05mm、0.01至0.05mm之间。
[0039]
甘氨酸的浓度与l-丙氨酸浓度一样，在有利情况下在0.0001至0.05mm之间。l-丝氨酸的浓度在有利情况下在0.001至0.03mm之间。
[0040]
在一个实施方式中，所述培养基还包含
[0041]
l-天冬氨酸，其浓度优选地在0.00001至0.003mm之间，和/或
[0042]
l-谷氨酸，其浓度优选地在0.00001至0.02mm之间，和/或
[0043]
ph调节剂，例如无机盐。
[0044]
例如，所述调节剂是选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及其组合的无机盐，所述调节剂的浓度在有利情况下在0.001至1mm之间。或者，所述调节剂是碳酸氢钠，其浓度在有利情况下在1至35mm之间。
[0045]
可选地或此外，所述培养基可以包含下述化合物中的至少一者：一种或多种氨基酸，每种氨基酸的浓度在有利情况下在0.001至1mm之间；一种或多种维生素，每种维生素的浓度在有利情况下在0.00001至1mm之间；选自蛋白质、神经营养因子、甾类、激素、脂肪酸、脂类、维生素、无机硫酸盐、有机化学化合物、单糖、核苷酸及其组合的补充剂；能量物质例如糖、丙酮酸钠及其组合，其浓度优选地在0.1至5mm之间；和光敏剂，特别是核黄素(b2)，其浓度在0.0001至0.0006mm之间；和/或hepes，其浓度在1至10mm之间。
[0046]
因此，例如，所述氨基酸在有利情况下选自l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、l-精氨酸盐酸盐、l-天冬酰胺-h2o、半胱氨酸-h2o盐酸盐、l-胱氨酸2hcl、l-组氨酸-h2o盐酸盐、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二钠盐二水合物、l-缬氨酸及其组合，
[0047]
例如，所述维生素选自氯化胆碱、d-泛酸钙(b5)、叶酸(b9)、i-肌醇、烟酰胺(b3)、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、维生素b12(氰钴胺素)、核黄素(b2)及其组合。
[0048]
在一个实施方式中，所述培养基不包含血清。可选地或此外，所述培养基的摩尔渗透压浓度在280至330osm/ml之间。
[0049]
可用于执行根据本发明所述的方法的神经元分化培养基的组成的实例描述在申请wo2014/172580中。由stemcell technologies公司销售的brainphys
tm
神经元培养基特别适合用作本发明的方法中的神经元分化培养基。
[0050]
培养步骤
[0051]
根据本发明，将所述微区室在所述细胞分化培养基中培养5周至100周之间的一段时间。在有利情况下，所述在分化培养基中的培养步骤进行5至50周之间，优选地10至50周之间、20至50周之间、25至50周之间、20至40周之间、25至40周之间、20至30周之间、25至30周之间，更优选地20至25周之间，甚至更优选地大约24周、25周、26周、27周、28周、29周、30周，特别是25周 /-1周的一段时间。这是因为本发明人已发现，在这段时间后所有或某些微区室含有表达tau蛋白的6种亚型(2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r、0n3r)的神经元。
[0052]
根据本发明，所述包含有丝分裂后神经元细胞的微区室，可以在将各自包含围绕单个干细胞团块和细胞外基质的中空水凝胶胶囊的细胞微区室在能够在所述细胞微区室内诱导细胞分化的培养基中预培养的步骤期间获得；在有利情况下，在所述预培养步骤完成后所述细胞在所述水凝胶胶囊内部组织成胞囊的形式。
[0053]
在本发明的情形中，术语胞囊表示在中央腔周围组织的至少一层多能细胞。因此，根据本发明，这种微区室在中央腔周围依次包含所述多能细胞层、细胞外基质层或细胞外基质替代物层和外部水凝胶层。所述腔在胞囊形成时由在细胞外基质层上的层中繁殖和发育的细胞产生。在有利情况下，所述腔含有液体，更具体来说是培养基。
[0054]
所述用于制备微区室的干细胞在有利情况下是哺乳动物多能干细胞，其可以是人类或非人类的。多能干细胞或多能细胞被理解为是具有形成在来源的整个生物体中存在的所有组织的能力，但不能形成整个生物体本身的细胞。具体来说，所述干细胞选自诱导多能干细胞(ips)、胚胎干细胞(es)、转分化细胞及其混合物。所述转分化细胞被理解为是在不经过多能步骤的情况下即可分化成感兴趣的细胞的细胞。所述细胞从它们的初始状态(例如成纤维细胞或外周血单核细胞)通过强制表达终末状态的一组基因转变成成熟神经元终末状态，而不通过多能表型过渡。
[0055]
一种制备胞囊的方法描述在申请wo2018/096277中，有利于细胞在微区室内以胞囊的形式组织的培养基也描述在其中。
[0056]
在另一个实施方式中，将神经祖细胞包封在水凝胶壳中，所述祖细胞在有利情况下能够以胞囊的形式组织。
[0057]
通常，一旦所述细胞微区室主要含有有丝分裂后神经元细胞后，将所述区室置于所述神经元分化培养基中。“主要”是指所述微区室包含以数目计超过50％、优选地超过60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的有丝分裂后神经元细胞。
[0058]
在有利情况下，所述神经元分化步骤在生物反应器中进行，所述细胞微区室保持悬浮在含有分化培养基的所述生物反应器的壳体中。
[0059]
由于细胞受到水凝胶壳的保护以对抗可能存在于所述反应器内的应力，因此通过所述生物反应器的流动可以强烈到所述水凝胶壳可以承受的程度。此外，所述细胞微区室的水凝胶壳保护细胞免于与碰撞相关的机械应力，并防止多细胞元件(聚集体、微载体)融合。所述微区室悬浮在所述生物反应器中，允许接触所述培养基并在均匀的微区室中扩散，并且还允许良好的对流。
[0060]
细胞微区室的使用使得可以在装备有封闭壳体的任何类型的生物反应器中，特别是在采取分批进料模式、补料分批进料模式或连续进料模式(灌注)的生物反应器中培养所述细胞。在采取连续进料模式的培养的情况下，使用这些微区室是特别有利的。这是因为由于细胞受到水凝胶壳保护，因此可以使它们经历连续流动而没有削弱它们的任何风险。
[0061]
在一个实施方式中，所述生物反应器包含可以被气密封闭的壳体。这使得可以控制生物反应器内部的气氛，以及例如在惰性气氛下培养所述微区室。
[0062]
所述生物反应器可以包含壳体，其具有1ml至10 000l之间、优选地5ml至10.000l之间、10ml至10.000l之间、100ml至10.000l之间、200ml至10.000l之间、500ml至10.000l之间的容积。在一个实施方式中，所述壳体具有至少1ml的容积。在一个实施方式中，所述壳体具有至少10ml的容积。在一个实施方式中，所述壳体具有至少100ml的容积。在一个实施方
式中，所述壳体具有至少500ml的容积。在一个实施方式中，所述壳体具有至少1l的容积。在一个实施方式中，所述壳体具有至少10l的容积。在一个实施方式中，所述壳体具有100l或更大的容积。
[0063]
本领域技术人员会知道如何根据需要调整微区室的数目和生物反应器的容积。
[0064]
优选地，所述神经分化步骤在无菌条件下进行，以便避免任何微生物污染。例如，将所述生物反应器的壳体封闭以防止污染，但允许与外部的气体交换。
[0065]
通常，封闭壳体的使用允许精细控制培养环境，而没有被外部环境扰乱的任何风险。此外，它容易获得无菌产物。这也允许更好的容积效率。
[0066]
在所述神经元分化步骤完成后，可以回收所有或一些细胞微区室，以便回收包含在所述微区室中的表达tau蛋白的6种亚型的有丝分裂后神经元。所述细胞可以通过外部水凝胶层的简单水解和/或溶解容易地回收。
[0067]
神经元细胞和应用
[0068]
根据本发明的方法可以获得其中表达tau蛋白的6种亚型2n4r、1n4r、0n4r、2n3r、1n3r、0n3r的有丝分裂后神经元细胞。
[0069]
在有利情况下，所述6种亚型的比例与野生型成人神经元细胞中存在的比例基本上相同。
[0070]
在一个实施方式中，在分化步骤完成后从细胞微区室回收的有丝分裂后神经元细胞表现出1/3至3之间、更优选地1/2至2之间、甚至更优选地3/4至4/3之间、理想情况下等摩尔比的10％的3r与4r亚型的表达比率。在有利情况下，2n、1n和0n亚型分别占总亚型的超过3％、超过17％和少于90％，优选地分别占超过5％、超过26％和少于50％，甚至更优选地分别占超过8％、超过45％和少于45％，理想情况下分别占9％、54％和37％。
[0071]
在一个实施方式中，在分化步骤完成后从细胞微区室回收的有丝分裂后神经元细胞包含相对于6种亚型的总数呈现下述比例的6种亚型：0.1至0.9％之间、特别是0.16％或0.9％的2n4r亚型，0.5至1％之间、特别是0.69％或1％的2n3r亚型，2至18％之间、特别是2.19％或17.6％的1n4r亚型，8至23％之间、特别是9.4％或22.4％的0n4r亚型，8至23％之间、特别是9.4％或27.5％的1n3r亚型，和30至80％之间、特别是78.16％或30.6％的0n3r亚型。
[0072]
此类有丝分裂后神经元细胞可用于研究目的和诊断或治疗两者。这些表现出与野生型成人神经元细胞基本上相同的tau蛋白表达谱的细胞，特别适用于筛选靶向神经变性疾病和/或特别是在人类中改变神经元的生理病理的治疗性分子。
[0073]
实施例
[0074]
材料和方法
[0075]
1.ipsc细胞系和包封
[0076]
bc-1细胞系(wt xy，传代15-25次，mti-globalstem,gaithersburg,md)在没有饲养细胞的情况下维持。将培养板用matrigel基质在37℃包被2小时(corning,ny，在dmem培养基中1/100稀释)。将bc-1集落用relesr(stemcell technologies,vancouver,canada)解离，然后在增补有1％青霉素/链霉素(invitrogen,carlsbad,ca)的mtesr1(stemcell technologies)中培养。所述培养每天补料并每5至7天传代。
[0077]
使用的包封程序描述在alessandri等，2016中。
[0078]
2.成熟皮层神经元的生产
[0079]
神经诱导在增补有b27和n2(thermo fischer scientific inc.,waltham,ma)、1μm ldn-193189(sigma aldrich,st.louis,mo)和10μm sb431542(tocris bioscience,bristol,uk)的dmem/f12和neurobasal的1:1混合物中进行。每天更换培养基共8天。然后使用增补有b27和n2的dmem/f12:neurobasal(1:1)混合物或增补有n2-a和sm1(stemcell technologies)的brainphys
tm
培养基进行神经干细胞的分化。所述两种培养基均增补有10ng/ml的bdnf和gdnf(cell guidance systems ltd.,cambridge,united kingdom)、10nm的化合物e(abcam,cambridge,united kingdom)和10nm的曲古菌素a(abcam)。每天更换一半的培养基直到规定的成熟期为止。
[0080]
3.rna提取
[0081]
将沉降的微区室(球体)在1x pbs(thermo fischer scientific inc.)中清洗一次，然后与gentle细胞解离试剂(stemcell technologies)温育5分钟，以便破碎藻酸盐胶囊。在两次1x pbs清洗后，使用nucleospin rna xs试剂盒(macherey-nagel gmbh and co kg,d
ü
ren,germany)提取细胞的总rna。对从正常成人大脑皮层提取的总rna(biochain institute inc.,newark,ca)进行验证实验。
[0082]
4.通过rt-pcr进行的神经元成熟分析
[0083]
使用retroscript反转录试剂盒(thermo fischer scientific inc.)和oligo(dt)引物，按照制造商关于两步rt-pcr程序的说明将总共250ng rna反转录。pcr反应使用1μl cdna和适合的引物(图7)来进行。将pcr产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离。
[0084]
5.通过荧光rt-pcr进行的成人mapt亚型的分析
[0085]
使用verso cdna试剂盒(thermo fischer scientific inc.)和oligo(dt)引物，对70ng rna进行反转录。在本研究中使用的引物列于下面的表1中。然后使用未标记的正向引物和6-fam标记的反向引物，通过荧光pcr分析mapt亚型的相对比例。将pcr产物在genetic analyzer 3500自动测序仪(applied biosystems)上分析，并使用genemapper软件5分析电泳图。
[0086]
[表1]
[0087][0088]
6.蛋白质提取和去磷酸化
[0089]
将球体在1x pbs(thermo fischer scientific inc.)中清洗，然后与gentle细胞解离试剂(stemcell technologies)温育5分钟，以便破碎藻酸盐胶囊。在1x pbs中清洗两次后，将所述球体在增补有蛋白酶抑制剂混合物(sigma-aldrich)的ripa缓冲液(thermo fisher scientific inc.)中，使用tissuelyserlt(qiagen,hilden,germany)匀浆(快速搅动(50hz，2min)，含有两颗2mm不锈钢球的1.5ml微量管)。然后将样品离心并收集裂解液。在冰上30min并离心(11 300
×
g，20min，4℃)后，收集含有可溶性蛋白的上清液。然后将30μg总蛋白用80个单位的λ蛋白磷酸酶(new england biolabs,ipswich,ma)在50μl的总体积中，在37℃处理3h。
[0090]
7.western印迹
[0091]
如以前所述(pons等，2017)，利用western印迹技术分析蛋白质。简单来说，将已被去磷酸化的样品的蛋白质与1μl含有在体外生产的6种tau蛋白亚型(sigma aldrich)的参比样品平行地在10％sds-page凝胶上通过电泳进行分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。将所述膜与第一抗体多克隆抗人类tau抗体(dako denmark a/s,glostrup,denmark)(1:50 000)温育，然后使用化学发光试剂(ecl clarity,bio-rad laboratories)揭示。
[0092]
结果
[0093]
1.藻酸盐胶囊中的皮层神经元和神经胶质谱系从ipsc开始在基质胶上的发育
[0094]
在本研究中，使用源自于健康供体的ipsc。在解离后，如以前在alessandri等，2016中对于神经干细胞(nsc)所描述的，将所述ipsc细胞包封在衬有基质胶的藻酸盐胶囊中。将所述胶囊首先维持在mtesr培养基中，以便允许集落出现在所述胶囊内部。然后通过smad的双重抑制进行ipsc的神经诱导，直至在胶囊中nsc达到100％合生(feyeux等，2012)。神经诱导效率通过用rt-pcr评估pou5f1和otx-1mrna表达来确认。正如预期，pou5f1多能基因在ipsc中强表达，而在nsc中事实上未检测到(图1a)。此外，与未诱导的ipsc相比，在nsc中nsc标志物otx-1被特异性表达(图1b)。在nsc已达到合生后，将它们分化成皮层神经元。试验了两种细胞培养基：常用培养基(dmem/f12-neurobasal 1:1，d/n)，以及被设计用于促
进ipsc衍生的神经元的成熟和突触功能的brainphys
tm
培养基(bardy等，2015)。由于先前的研究显示来自ipsc的皮层神经发生在体外遵循与哺乳动物的皮层发育相同的时间过程并至少延伸到培养的第90天(espuny-camacho等，2013；kirwan等，2015；shi等，2012)，因此，任意地决定在实验过程中在培养15、20或25周后表征ipsc衍生的人类皮层神经元的身份。评估了calb1(钙结合蛋白1)和reln(颤蛋白)这两种上层的皮层神经元特有的标志物的表达。上层的皮层神经元在皮层神经发生的最后阶段产生。calb1在人类大脑皮层的皮层ii和皮层iii中表达，reln在皮层i中表达。正如在图1c和1d中所示，不论使用何种培养基，从培养的15周起在ipsc衍生的神经元中检测到calb1和reln mrna表达。所述两个基因的表达维持到25周。正如预期，在ipsc和nsc中未以显著的水平检测到calb1和reln。
[0095]
通过分别评估gfap(胶质原纤维酸性蛋白)和cldn11(密封蛋白11)mrna的表达，也研究了培养物中星形胶质细胞和形成髓鞘的少突胶质细胞的存在。在两种实验条件下，从培养的15周起均检测到gfap表达(图1e)。另一方面，尽管从培养的第15周起在brainphys
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培养基中培养的胶囊中很容易检测到cldn11的表达，但在标准培养基中培养的细胞中，即使在分化25周后仍然没有它的表达(图1f)。同样地，正如预期，在ipsc和nsc阶段这些基因都没有表达。总的来说，这些结果表明，在衬有基质胶的藻酸盐胶囊内从ipsc衍生的神经元能够分化成皮层神经元，包括在皮层神经发生的最后阶段产生的上层的皮层神经元。重要的是应该指出，少突胶质细胞特异性存在于维持在brainphys
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中的培养物中，强调了与常用的d/n培养基相比，brainphys
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神经元培养基改善了神经元成熟。
[0096]
2.用于测量6种成人mapt mrna亚型的定量方法的开发：在人类大脑皮层中的验证
[0097]
目前，对成人mapt mrna亚型表达的分析主要仅基于外显子10的包含的定量，以便确定3r/4r比率，或外显子2和3的包含的定量，以便评估0n、1n或2n亚型的比例。在本研究中，开发了一种允许在单个pcr反应中同时分别分析6种成人mapt mrna亚型，以便检查它们在神经元成熟过程中的相对比例的方法。为此，在使用荧光标记的引物扩增mapt转录本的基础上开发了一种新的测试。鉴定到一组覆盖外显子1和11的引物(图2a)，其将允许扩增所述6种mapt亚型。为了验证该测试，对从成人大脑皮层提取的mrna进行了rt-pcr实验。与通过pcr扩增的产物相对应的电泳图的分析揭示出一种分布图，其呈现对应于所述6种成人mapt mrna亚型的预期尺寸的6个峰的形式(图2b)。然后从所述峰的高度计算各种不同亚型的相对比例。0n3r和1n3r亚型表达最多(30.6％和27.5％)，其次是0n4r和1n4r亚型(22.4％和17.6％)，而2n3r和2n4r亚型仅占所有亚型的1％和0.9％。
[0098]
这些数据也使得确定0n(53％)、1n(45.1％)和2n(1.9％)亚型的相对比例以及3r(59.1％)和4r(40.9％)亚型的相对比例成为可能。重要的是应该指出，在外显子2/3的包含和外显子10的包含的独立分析期间获得了相似的定量数据(图5a，b)：0n和1n亚型被证明是表达最多的(分别为52.9％和45％)，而2n亚型仅占2％。对于外显子10的剪接来说，峰的相对定量表明比例略微有利于3r亚型，3r-tau为59.9％，与此相比4r-tau为40.1％。这些数据与以前发表的研究完全一致，因此验证了这种新测试。
[0099]
3.brainphys
tm
促进6种成人mapt mrna亚型在衬有基质胶的藻酸盐胶囊内部培养的ipsc衍生的神经元中的表达
[0100]
在成人脑提取物上验证了所述测试后，将所述方法用于评估在25周的成熟期内，成人mapt亚型在维持在d/n或brainphys
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培养基中的ipsc衍生的神经元培养物中的表达。
根据先前的研究，nsc分析揭示出一个单峰，其对应于mapt的0n3r亚型的预测尺寸(图3a和图4a)。从成熟15周起检测到含有外显子2的亚型(1n3r和1n4r亚型)和含有外显子10的亚型(0n4r和1n4r亚型)。有趣的是应该指出，与d/n培养物相比，维持在brainphys
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中的培养物表现出更高水平的1n3r、0n4r和1n4r亚型的表达。在成熟20周后，观察到这些种类的量显着增加，并且在所述两种实验条件下出现2n3r亚型的低水平表达。在研究的最后时间点(25周)，这些成人mapt mrna亚型的表达水平继续增加。甚至更重要的是，此时可以在维持在brainphys
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中的培养物中检测到2n4r亚型。在使用brainphys
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维持25周的培养物中mapt mrna亚型的相对比例的定量分析显示，0n4r和1n3r亚型各自占存在的所有亚型的9.4％，而1n4r亚型占2.19％。2n3r和2n4r亚型分别对应于0.69％和0.16％。因此，4r-tau亚型占mapt转录本的11.75％(图4b)，而1n和2n亚型分别占11.63％和0.85％(图4c)。与使用大脑提取物一样，这些结果通过外显子10或外显子2/3的剪接的独立评估得以验证(图5c)。
[0101]
所述实验程序允许表达6种成人mapt mrna转录本的神经元发育，但在成熟25周后仍主要表达0n3r亚型(～78％)。为了排除0n3r亚型可以“捕获”引物并因此与表达较差的转录本相比降低pcr效率的可能性，独立于0n3r转录本对mapt亚型的表达进行了分析。为此，产生了两组引物(图6)：第一组覆盖外显子2和11以便准确分析1n3r、1n4r、2n3r和2n4r转录，第二组覆盖外显子1和10以便特异性扩增4r-tau亚型。对大脑提取物以及在brainphys
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中维持25周的培养物的分析证实了各种不同mapt亚型的相对比例，从而验证了所述测试。
[0102]
总的来说，这些结果显示，在成熟25周后，在brainphys
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中维持的神经元表达包括2n3r和2n4r亚型在内的6种成人mapt转录本。重要的是应该指出，当ipsc衍生的培养物保存在d/n培养基中时，只有5种亚型表达。检测不到2n4r亚型。此外，在每个研究时点，每种亚型的mrna水平都系统性地低于使用brainphys
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培养基观察到的水平。这些数据完全符合brainphys
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培养基对神经元成熟状态的有益作用。有趣的是注意到，与在人类大脑发育期间所显示的(hefti等，2018)一致，首先检测到外显子2和外显子10的表达变化。外显子3的包含在晚些时候发生。
[0103]
为了验证实验模型中成人mapt转录本的翻译效率，随后通过western印迹评估了在brainphys
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中维持25周的球体中tau蛋白亚型的产生。将所述蛋白质任选地使用λ磷酸酶去磷酸化，并在含有6种亚型的重组tau蛋白标志物旁通过电泳进行分离。如图3b中所示，作为(i)多种亚型的存在和(ii)所述蛋白质的磷酸化状态的结果，tau蛋白以40至60kda之间的多个条带的形式迁移。磷酸酶处理导致tau蛋白向较低分子量转变。与mrna分析相一致，注意到在25周的胶囊中主要检测到0n3r-tau亚型。然而，也检测到显著量的0n4r、1n3r和1n4r亚型。另一方面，无法观测到2n tau亚型。由于这些亚型占在mrna中存在的所有tau物质的不到1％，因此它们的浓度可能低于所述分析中的检测极限。
[0104]
结论
[0105]
这些结果显示，在衬有基质胶的藻酸盐胶囊内部培养的ipsc衍生的神经元表现出成熟皮层细胞培养物的技术指标。甚至更重要的是，利用允许对所有成人mapt mrna亚型单个地进行定性和定量分析的新测试，证实了在brainphys
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中维持的神经元在成熟25周后表达6种成人mapt mrna转录本，使得这种模型非常适合于tau病理学的建模和治疗目的。