一个大孢子母细胞特异诱导表达系统的制作方法

1.本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个大孢子母细胞特异诱导表达系统。


背景技术：

2.高等植物雌配子体发育一般包括大孢子发生和雌配子体发生两个阶段。大孢子发生一般是从胚珠原基顶端的1个亚表皮细胞分化形成大孢子母细胞开始的，而大孢子母细胞经过一次减数分裂形成4个单倍体大孢子，随着发育进行，处在珠孔端的3个大孢子退化，仅剩合点端的一个大孢子即功能大孢子幸存并参与雌配子体发生；雌配子体发生是从功能大孢子的形成开始，其经过三次连续核有丝分裂形成合胞体，再经过细胞化，最终形成“七胞八核”的雌配子体（也称之为胚囊）的过程。
3.高等植物雌配子发育的过程起始于mmc，在研究mmc的精准调控的过程中，需要对特定的基因进行功能分析。传统的功能分析中需要进行基因的超表达。过去的超表达系统包括两类：1）以35s等为代表的的组成性启动子驱动目的基因表达的超表达系统；2）以mmc特异表达基因启动子驱动的细胞特异表达系统。第一类系统对目标基因的表达是组成型的表达，第二类系统尽管是在mmc中表达，但是其表达不能受到人为的控制。本研究发明了一种新的适合在mmc中诱导性表达的系统，其目标基因能够在mmc中特异表达，而且，这种特异表达受到人为的控制，即人工诱导后表达。本系统可以用于在mmc中可诱导地表达目标基因。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供可以用于在mmc中可诱导地表达目标基因的系统: ipknu
‑
venus，其特征是该系统只有在诱导剂（methoxyfenozide）诱导作用之后才表达，为研究大孢子母细胞的分化发育提供了一种新方法。具体流程：载体构建，转化农杆菌，侵染拟南芥，筛选与鉴定阳性植株，诱导表达，荧光观察。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
6.一个大孢子母细胞特异性诱导表达的系统ipknu
‑
venus，构建含有pknu：：vge
‑5×
gal4 dna：：venus表达盒的载体，转化至拟南芥中，获得阳性苗。
7.所述载体构建方法包括以下步骤：（1）提取at5g14010基因的全基因组序列，根据序列设计扩增片段的引物，从拟南芥基因组dna扩增启动子片段，并回收；引物序列为：forward primer：ctaggcgatcgctggtagatttgttctgtgcatcctatc；reversed primer: gatccgtcgacggcatttttgagaggttcttaagctacag；（2）载体序列为gl3载体，用限制性内切酶sfaai与sgrdi分别酶切启动子片段与载体质粒，37℃水浴锅中酶切反应2h，电泳检测并切胶回收；gl3载体序列如seq id no.1所示；（3）酶切后的启动子片段与gl3载体按照浓度3：1的比例，用t4
‑
dna连接酶进行连
接反应，放入16℃连接仪中反应1h；转化大肠杆菌db3.1，挑选阳性克隆，提取质粒，pknu
‑
gl3载体；（4）pknu
‑
gl3载体与penter
‑
venus载体lr交换反应，转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆，提取质粒，得到pknu：：vge
‑5×
gal4 dna：：venus。
8.所述penter
‑
venus载体的构建方法包括以下步骤：（1）人工合成cacc
‑
vennus序列，如seq id no.2所示；（2）采用pentr
™ꢀ
directional topo
®ꢀ
cloning kits（catalog numbers k2400
‑
20）进行连接；（3）转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆并提取质粒，得到penter
‑
venus载体入门载体。
9.一种诱导方法，利用权利要求1所述的诱导表达系统ipknu
‑
venus，在昆虫蜕皮激素（methoxyfenozide）存在的条件下进行诱导。
10.所述诱导方法具体包括以下步骤：（1）将权利要求1所述载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取t1代植株dna，进行pcr鉴定，取阳性苗植株诱导；（2）诱导前对目标植株停止浇水三天，让栽培基质适当干燥；（3）配置浓度为200 ul/l 昆虫蜕皮激素（methoxyfenozide）作为诱导剂，将目标植株地上部分放在诱导液中浸泡60s，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时后用诱导液对植株的花序进行喷雾至叶片上水珠饱和；（4）诱导后，24小时取胚珠观察荧光情况。
11.荧光诱导表达观察：使用leica tcs sp8x dls激光扫描共聚焦显微镜对诱导后植株的胚珠进行荧光观察，如图1所示，在mmc中特异发现绿色荧光信号，说明vennus在mmc中被特异诱导表达。
12.此系统的vennus可以替换成目标目标蛋白基因，实现目标蛋白在mmc中受诱导的特异性的表达。
13.本发明的优点在于：（1）实现mmc诱导性显示的marker。
14.（2）实现诱导性的mmc细胞特异性的蛋白表达。
15.（3）诱导性表达系统中，目标基因已经转入基因组中，但是处于静默状态，只有当诱导剂存在的情况下才启动表达。此系统能够克服组成型表达和细胞特异性表达导致致死无法得到后代的情况，也可以通过诱导表达致死基因，人工控制雌性败育。具有农业生产中的潜在应用价值。
附图说明
16.图1是诱导后不同时期的胚珠中vennus信号情况；其中（a）mmc时期；（b）fm时期；（c）fg2时期；（d）fg4时期；（e）fg7时期。
具体实施方式
17.实施例1 载体构建
载体构建：构建pknu：：vge
‑5×
gal4 dna：：venus建构实施例2 诱导方法：（1） 构建好的载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取t1代植株dna，进行pcr鉴定，取阳性苗植株诱导；（2）诱导前，对目标植株进行适当干燥处理；（3）配置浓度为200 ul/l 昆虫蜕皮激素（methoxyfenozide）作为诱导剂，将目标植株地上部分放在诱导液中浸泡60s，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时后用诱导液对植株的花序进行喷雾至叶片上水珠饱和；（4）诱导后，24小时取胚珠观察荧光情况，结果如图1所示。
18.荧光诱导表达观察：使用leica tcs sp8x dls激光扫描共聚焦显微镜对诱导后植株的胚珠进行荧光观察，如图1所示，在mmc中特异发现绿色荧光信号，说明vennus在mmc中被特异诱导表达。
19.此系统的vennus可以替换成目标目标蛋白基因，实现目标蛋白在mmc中受诱导的特异性的表达。
20.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。


技术特征：
1.一个大孢子母细胞特异性诱导表达的系统ipknu
‑
venus，其特征在于，构建含有pknu：：vge
‑5×
gal4 dna：：venus表达盒的载体，转化至拟南芥中，获得阳性苗。2.根据权利要求1所述的大孢子母细胞特异性诱导表达的系统ipknu
‑
venus，其特征在于，所述载体构建方法包括以下步骤：（1）提取at5g14010基因的全基因组序列，根据序列设计扩增片段的引物，从拟南芥基因组dna扩增启动子片段，并回收；引物序列为：forward primer：ctaggcgatcgctggtagatttgttctgtgcatcctatc；reversed primer: gatccgtcgacggcatttttgagaggttcttaagctacag；（2）载体序列为gl3载体，用限制性内切酶sfaai与sgrdi分别酶切启动子片段与载体质粒，37℃水浴锅中酶切反应2h，电泳检测并切胶回收；（3）酶切后的启动子片段与gl3载体按照浓度3：1的比例，用t4
‑
dna连接酶进行连接反应，放入16℃连接仪中反应1 h；转化大肠杆菌db3.1，挑选阳性克隆，提取质粒，得到pknu
‑
gl3载体；（4）pknu
‑
gl3载体与penter
‑
venus载体lr交换反应，转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆，提取质粒，得到pknu：：vge
‑5×
gal4 dna：：venus。3.一种诱导方法，其特征在于，利用权利要求1所述的诱导表达系统ipknu
‑
venus，在昆虫蜕皮激素存在的条件下进行诱导。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导方法具体包括以下步骤：（1）将权利要求1所述载体导入农杆菌并转化拟南芥，提取t1代植株dna，进行pcr鉴定，取阳性苗植株诱导；（2）诱导前对目标植株停止浇水三天，让栽培基质适当干燥；（3）配置浓度为200 ul/l 昆虫蜕皮激素作为诱导剂，将目标植株地上部分放在诱导液中浸泡60s，然后用诱导液浇灌栽培基质致其吸水饱和，2小时后用诱导液对植株的花序进行喷雾至叶片上水珠饱和；（4）诱导后，24小时取胚珠观察荧光情况。

技术总结
本发明构建了一个大孢子母细胞特异性诱导表达的系统:ipKNU


技术研发人员：程焱 秦源 林志斌 刘金典 熊俊杰 杨攀
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2021.10.11
技术公布日：2022/1/4