Hedgehog信号通路基因、调节剂在调节气道上皮细胞生理功能中的应用

hedgehog信号通路基因、调节剂在调节气道上皮细胞生理功能中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体属于基因功能及小分子功能鉴定领域，具体涉及hedgehog信号通路基因、调节剂在调节气道上皮细胞生理功能中的应用。


背景技术：

2.气道上皮是肺部疾病的主要目标，它为环境和肺叶之间的气体交换提供了通道。气道上皮生成和粘液分泌异常涉及肺部多种疾病，例如哮喘和慢性阻塞性肺病，这两种肺部疾病常常伴随气道上皮中分泌粘液的杯状细胞的过多分化以及粘液的高分泌。然而目前人们对于气道上皮细胞生成和粘液分泌的细胞和分子机制知之甚少。
3.动物体内，hedgehog(hh)信号可以调节组织形成模式和细胞分化。在哺乳动物中，存在三种hh配体，即dhh、ihh和shh。在肢体形成、内胚层器官发育和神经管中的细胞分化过程中，人们已经深入研究了hh信号传导。在肺脏中，hedgehog(hh)信号在协调肺上皮细胞和间充质细胞之间的通信发挥着重要作用，它可以调节间质细胞的增殖、分化。然而hh信号通路中的基因，以及该信号通路的抑制剂或激活剂在气道上皮再生和粘液分泌中的作用还未知。


技术实现要素：

4.本发明旨在探究hedgehog信号通路基因、调节剂在调节气道上皮细胞生理功能中的应用，为肺部疾病的诊疗提供新的方向。
5.基于上述目的，本发明请求保护的技术方案如下：
6.第一方面，本发明请求保护hedgehog信号通路基因在调节气道上皮细胞生理功能中的应用。
7.进一步地，基于上述应用，所述hedgehog信号通路基因包括hedgehog信号通路的配体基因和信号转导基因。
8.进一步地，基于上述应用，所述hedgehog信号通路的配体基因为shh基因；所述hedgehog信号通路的信号转导基因为smo基因。
9.进一步地，基于上述应用，shh基因或smo基因功能丧失，抑制气道上皮细胞和club细胞生成。
10.进一步地，基于上述应用，shh基因或smo基因功能丧失，抑制气道上皮中的纤毛细胞分化和分泌细胞成熟。
11.第二方面，本发明请求保护cyclopamine、gant 58作为hedgehog信号通路抑制剂的应用。
12.第三方面，本发明请求保护h-shh重组蛋白作为hedgehog信号通路激活剂的应用。
13.第四方面，本发明请求保护hedgehog信号通路调节剂在调节气道上皮细胞生理功能中的应用。
14.进一步地，基于上述应用，所述hedgehog信号通路调节剂包括hedgehog 信号通路抑制剂和激活剂；所述hedgehog信号通路抑制剂包括cyclopamine、 gant 58；所述hedgehog信号通路激活剂包括h-shh重组蛋白。
15.进一步地，基于上述应用，所述hedgehog信号通路抑制剂抑制气道上皮纤毛细胞和杯状细胞生成障碍，粘液分泌减少；所述hedgehog信号通路激活剂促使气道上皮纤毛细胞和杯状细胞过度生成，粘液分泌增加。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
17.本发明首次证实了hedgehog信号通路基因shh或smo基因失活导致气道上皮细胞生成障碍，并进一步证实了cyclopamine或gant 58可以作为 hedgehog信号通路抑制剂，抑制道上皮纤毛细胞和杯状细胞生成，粘液分泌减少；h-shh重组蛋白能够作为hedgehog信号通路激活剂，促使气道上皮纤毛细胞和杯状细胞过度生成，粘液分泌增加，这对于肺部疾病的诊疗具有重要意义。
附图说明
18.图1为hh信号通路的配体基因shh调控小鼠气道上皮细胞分化效果图；
19.图2为hh信号通路的信号转导基因smo调控小鼠气道上皮细胞分化效果图；
20.图3为hh信号通路调节剂调节人气道上皮细胞的分化、muc5ac、muc5b 的粘液分泌效果图；
21.图4为hh信号通路抑制剂抑制人支气管上皮细胞的生成和粘液分泌效果图。
具体实施方式
22.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
23.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中的抗体来源及稀释倍数如下：goat anti-scgb1a1(1:200,santa cruz,t-18)；mouse anti-foxj1(1:400, thermo fisher scientific,14-9965-82)；rabbit anti-muc5ac(1:400,santa cruz, h-160)；rabbit anti-muc5b(1:400,novus biologicals,nbp1-92151)；mouseanti-acetyl-alpha tubulin(1:2000,sigma,mabt868)；rabbit anti-nkx2.1(1:400, santa cruz,h-190)。
24.实施例1
25.本实施例拟探究hedgehog信号通路配体基因shh在调控小鼠气道上皮细胞分化的作用，具体试验方法如下：
26.分别以nkx2.1cre；shhflox/ 小鼠(简称e18.5对照)和气道上皮特异性敲除 shh小鼠(nkx2.1cre；shhflox/flox，简称shhcko)进行小鼠气道组织冷冻切片染色，具体方法如下：
27.在pbs中解剖e18.5对照和shhcko小鼠的气管和肺，于4℃下使用4％多聚甲醛中固定过夜，10％蔗糖和30％蔗糖中孵育24小时，组织包埋在oct 包埋剂中，使用冰冻切片机做10μm的组织切片。抗体免疫染色过程中，切片在4％多聚甲醛中于4℃下固定10分钟，然后在
透化溶液(0.3％tritonx-100/pbs)中室温孵育15分钟，封闭液(5％fbs/pbs)中孵育，室温下封闭 1小时，在4℃下分别在一抗(rabbit anti-nkx2.1,mouse anti-foxj1,mouseanti-acetylated-α-tubulin，goat anti-scgb1a1)中孵育过夜，pbst洗涤三次，再分别于二抗(其中一抗rabbit anti-nkx2.1的二抗为donkey anti-rabbit igg (h l)，alexa fluor 488；mouse anti-foxj1的二抗为donkey anti-mouse igg (h l)，alexa fluor 568；mouse anti-acetylated-α-tubulin的二抗为donkeyanti-mouse igg(h l)；goat anti-scgb1a1的二抗为donkey anti-goat igg (h l)，alexa fluor 568)中室温下孵育2小时，pbst洗涤三次，dapi细胞核染色，pbst洗涤三次，封片观察并成像，结果如图1(a)、(b)、(d)、(e)、 (f)、(g)所示。
28.使用mirneasy mini kit(qiagen)提取e18.5对照和shhcko小鼠气管的总rna。利用maxima first strand cdna synthesis kit(thermofisher scientific) 合成cdna。使用eco实时pcr系统(illumina)和maxima sybr green/ fluorescein qpcr master mix试剂(thermofisher scientific)进行实时定量pcr 的检测。反应程序如下：步骤一，55℃，2分钟；步骤二，95℃，10分钟；步骤三95℃，10秒；步骤四，60℃，30秒；从步骤三到步骤四循环40次；步骤五，95℃，15秒；步骤六，55℃，15秒，步骤七，95℃，15秒，结果如图1(c) 所示。
29.图1中，图1(a)为e18.5对照(即nkx2.1cre；shhflox/ 小鼠，图1中统称为e18.5对照)和气道上皮特异性敲除shh(即nkx2.1cre；shhflox/flox，图1中统称为shhcko)小鼠气道中foxj1(红色)、nkx2.1(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫荧光染色。图1(b)为e18.5对照和shhcko小鼠气道上皮中foxj1阳性纤毛细胞相对数量的量化，其中e18.5对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，shhcko组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。图1(c)为e18.5对照和shhcko小鼠气道中foxj1，tubb4b， scgb1a1和foxp1 mrna水平的rt-qpcr分析，其中对照组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到，shhcko组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到。图1(d)为e18.5对照和shhcko小鼠气道中的乙酰化α-微管蛋白(红色)和dapi染色(蓝色)的免疫染色图。图1(e) 为e18.5对照和shhcko小鼠气道上皮中乙酰化α-微管蛋白阳性纤毛细胞的相对数量的量化，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到， shhcko组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。图1(f)为e18.5 对照和shhcko气道纵向切片的scgb1a1(红色)、nkx2.1(绿色)和dapi 染色(蓝色)的免疫荧光染色。图1(g)为e18.5对照和shhcko小鼠气管上皮中scgb1a1阳性club细胞相对数量的量化，其中e18.5对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，shhcko组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。
30.图1结果表明，气道上皮细胞来源的hedgehog通路的配体基因shh的功能丧失会阻碍气管上皮中的纤毛细胞分化和分泌细胞成熟。
31.实施例2
32.本实施例拟探究hedgehog信号通路信号转导基因smo在调控小鼠气道上皮细胞分化的作用，具体试验方法如下：
33.分别以nkx2.1cre；smoflox/ 小鼠(简称e18.5对照)和气道上皮特异性敲除smo小鼠(nkx2.1cre；smoflox/flox，简称smocko)进行小鼠气道组织冷冻切片染色，具体方法如下：
34.在pbs中解剖e18.5对照和smocko小鼠的气管和肺，于4℃下使用4％多聚甲醛中固定过夜，10％蔗糖和30％蔗糖中孵育24小时，组织包埋在oct 包埋剂中，使用冰冻切片机做10μm的组织切片。抗体免疫染色过程中，切片在4％多聚甲醛中于4℃下固定10分钟，然后在透化溶液(0.3％tritonx-100/pbs)中室温孵育15分钟，封闭液(5％fbs/pbs)中孵育，室温下封闭 1小时，在4℃下分别在一抗(rabbit anti-nkx2.1,mouse anti-foxj1,mouseanti-acetylated-α-tubulin，goat anti-scgb1a1)中孵育过夜，pbst洗涤三次，再分别于二抗(其中一抗rabbit anti-nkx2.1的二抗为donkey anti-rabbit igg (h l)，alexa fluor 488；mouse anti-foxj1的二抗为donkey anti-mouse igg (h l)，alexa fluor 568；mouse anti-acetylated-α-tubulin的二抗为donkeyanti-mouse igg(h l)；goat anti-scgb1a1的二抗为donkey anti-goat igg (h l)，alexa fluor 568)中室温下孵育2小时，pbst洗涤三次，dapi细胞核染色，pbst洗涤三次，封片观察并成像，结果如图2(a)、(b)、(d)、(e)、 (f)、(g)所示。
35.使用mirneasy mini kit(qiagen)提取e18.5对照和smocko小鼠气管的总rna。利用maxima first strand cdna synthesis kit(thermofisher scientific) 合成cdna。使用eco实时pcr系统(illumina)和maxima sybr green/ fluorescein qpcr master mix试剂(thermofisher scientific)进行实时定量pcr 的检测。反应程序如下：步骤一，55℃，2分钟；步骤二，95℃，10分钟；步骤三95℃，10秒；步骤四，60℃，30秒；从步骤三到步骤四循环40次；步骤五，95℃，15秒；步骤六，55℃，15秒，步骤七，95℃，15秒，结果如图2(c) 所示。
36.图2中，图2(a)为e18.5对照(即nkx2.1cre；smoflox/ ，图二中统称为 e18.5对照)和气道上皮特异性敲除smo(即nkx2.1cre；smoflox/flox，图二中统称为smocko)小鼠气道中foxj1(红色)、nkx2.1(绿色)和dapi染色 (蓝色)的免疫荧光染色。图2(b)为e18.5对照和smocko小鼠气道上皮中foxj1阳性纤毛细胞相对数量的量化，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，smocko组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。图2(c)为e18.5对照和smocko小鼠气道中foxj1，tubb4b和scgb1a1 mrna水平的rt-qpcr分析，其中e18.5对照组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到，smocko组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到。图2(d)为e18.5对照和smocko小鼠气道中乙酰化α-微管蛋白(红色)、nkx2.1(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫荧光染色。图 2(e)为e18.5对照和smocko小鼠气道上皮中乙酰化α-微管蛋白阳性细胞的相对数量的量化，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到， smocko组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。图2(f)为e18.5 对照和smocko小鼠气道中scgb1a1(红色)、nkx2.1(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫荧光染色。图2(g)为e18.5对照和smocko小鼠气道上皮中 scgb1a1阳性club细胞相对数量的量化，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，smocko组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。
37.图2结果表明，气道上皮细胞来源的hedgehog通路的信号转导基因smo 的功能丧失同样会阻碍气管上皮中的纤毛细胞分化和分泌细胞成熟，其效果略弱于shh功能缺失的样本。
38.实施例3
39.本实施例拟探究cyclopamine作为hedgehog信号通路抑制剂及其在调节气道上皮
细胞分化、muc5ac和muc5b的粘液分泌中的作用，同时探究人shh 重组蛋白(h-shh重组蛋白)作为hedgehog信号通路激活剂及其在调节气道上皮细胞分化、粘液分泌中的作用，具体试验方法如下：
40.(1)人气道上皮细胞气液分化培养
41.在37℃、含5％co2的细胞培养箱中，使用补充有激素和生长因子的气道上皮细胞生长培养基(aegm；promocell)，将人气道上皮原代细胞(hbe) 在t75培养瓶中培养扩增，扩增到密度80％之后，细胞用0.05％胰蛋白酶-edta (gibco)消化分离并接种在小牛皮肤胶原蛋白(sigma-aldrich)包被的aegm膜支持物上(12毫米transwell，0.4μm孔径，costar)。hbe细胞培养两天直到细胞间隙闭合。去除顶端培养基，将dmem(sigma)培养基和补充60ng/ml视黄酸(sigma)的aegm培养基1:1混合，加入transwell的基底过滤室。每周更换3 次基底过滤室中的培养基，将hbe细胞维持在气液界面条件下。将cyclopamine (tocris)稀释成5mm的储备溶，培养基稀释至10μm使用。将gant 58 (tocris)稀释成10mm的储备溶，培养基液稀释至10μm使用。将重组人shh (h-shh)(r&d systems)稀释成200μg/μl储备溶液，培养基稀释至100ng/ml 使用。从hbe细胞分化的第5天到第14天，将含cyclopamine、gant 58或 h-shh的培养基加入人气道上皮细胞中于37℃下在5％co2培养箱中培养。每 24小时更换一次培养基，第14天收集细胞样本进行分析。
42.(2)人气道上皮细胞抗体免疫荧光染色
43.人气道上皮细胞在4％多聚甲醛中于室温下固定2小时，pbs洗涤三次，然后在透化溶液(0.3％triton x-100/pbs)中室温孵育15分钟，封闭液中(5％ fbs/pbs)中孵育/3％bsa)室温下封闭1小时，在4℃下在一抗(rabbitanti-muc5ac,mouse anti-foxj1,mouse anti-acetylated-α-tubulin，rabbitanti-muc5b)中孵育过夜，pbst洗涤三次，二抗(其中rabbit anti-muc5ac 和rabbit anti-muc5b的二抗为donkey anti-rabbit igg(h l)，alexa fluor 488； mouse anti-foxj1；mouse anti-acetylated-α-tubulin的二抗为donkey anti-mouseigg(h l)，alexa fluor 568)中室温下孵育2小时，pbst洗涤三次，dapi细胞核染色，pbst洗涤三次，封片观察并成像。
44.(3)荧光实时定量pcr
45.使用mirneasy mini kit(qiagen)提取气管的总rna。利用maxima firststrand cdna synthesis kit(thermofisher scientific)合成cdna。使用eco实时 pcr系统(illumina)和maxima sybr green/fluorescein qpcr master mix试剂(thermofisher scientific)进行实时定量pcr的检测。反应程序如下：步骤一，55℃，2分钟；步骤二，95℃，10分钟；步骤三95℃，10秒；步骤四，60℃， 30秒；从步骤三到步骤四循环40次；步骤五，95℃，15秒；步骤六，55℃， 15秒，步骤七，95℃，15秒。
46.在上述试验过程中，以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1(红色)、 muc5ac(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫荧光染色如图3(a)所示；以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1阳性细胞的相对数量的量化如图3(b)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮中 muc5ac阳性的
杯状细胞的相对数量的量化，如图3(c)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1、 muc5ac、muc5b和spdef mrna水平的rt-qpcr分析，结果如图3(d) 所示，其中对照组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到，加药组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到。以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中乙酰化α-微管蛋白(红色)、muc5b(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫荧光染色如图3(e)所示。以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中乙酰化α-微管蛋白阳性纤毛细胞的相对数量的量化如图(f)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。以乙醇作为对照组，以10μm cyclopamine 处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中muc5b 细胞的相对数量的量化图3(g)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。
47.以ddh2o作为对照组，以100ng/ml人shh重组蛋白处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1(红色)、muc5ac(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫染色如图3(h)所示。以ddh2o作为对照组，以100ng/ml人shh重组蛋白处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1 纤毛细胞的相对数量的量化如图3(i)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。以ddh2o作为对照组，以100ng/ml 人shh重组蛋白处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中muc5ac阳性的杯状细胞的相对数量的量化如图3(j)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。以ddh2o作为对照组，以100ng/ml人shh 重组蛋白处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中 foxj1、muc5ac mrna水平的rt-qpcr分析如图3(k)所示，其中对照组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到，加药组数值为每组基因表达量除以各组基因表达量的平均值得到。
48.图3结果表明，cyclopamine作为hedgehog信号通路的抑制剂，可以降低人气道上皮中纤毛细胞的分化并抑制粘液的生成；h-shh重组蛋白作为 hedgehog信号通路的激活剂，可以增加人气道上皮中纤毛细胞的分化并促进粘液的生成。
49.实施例4
50.本实施例拟探究gant 58作为hedgehog信号通路抑制剂及其在调节气道上皮细胞分化、muc5ac的粘液分泌中的作用，具体试验方法如下：
51.参照实施例3所述方法，本实施例以ddh2o作为对照组，以10μm gant 58 处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1(红色)、muc5ac(绿色)和dapi染色(蓝色)的免疫荧光染色如图4(a)所示。以ddh2o作为对照组，以10μm gant 58处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中foxj1 纤毛细胞的相对数量的量化图4 (b)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药
组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。以ddh2o作为对照组，以10μm gant 58处理作为加药组，处理9天后，气液界面培养的人支气管上皮细胞中muc5ac阳性杯状细胞的相对数量的量化如图4(c)所示，其中对照组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到，加药组数值为每组细胞数量除以各组细胞数量平均值得到。本实施例中的实验方法为实施例3中所述人气道上皮细胞气液分化培养。
52.图4结果表明，gant 58作为hedgehog信号通路的抑制剂，同样可以降低人气道上皮中纤毛细胞的分化并抑制粘液的生成。
53.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。