希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法

1.本发明属于基因工程和生物代谢技术领域，更具体的说是设计重组质粒以改造希瓦氏菌的代谢通路，使其以木糖底物为唯一碳源进行生长代谢。


背景技术：

2.基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和dna重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
3.希瓦氏菌属是一种兼性厌氧菌，遗传背景清楚，且易于操作。模式产电微生物-奥达奈希瓦氏菌(shewanella oneidensis mr-1，简称mr-1，atcc编号：700550)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将氧化还原反应过程中产生的电子转移到微生物燃料电池(microbial fuel cell，简称mfc)中的阳极，成为研究微生物如何在mfc中产生电流的模式生物之一。希瓦氏菌一般以乳酸为底物进行生长代谢，不能利用木糖、葡萄糖等储量更为丰富、分布更为广泛的糖类，这限制了希瓦氏菌的底物利用范围和胞外电子传递效率。
4.木糖(xylose)(化学式c5h
10
o5)，别称：五碳醛糖。是木聚糖的一个组分，木聚糖广泛存在于植物中，一般可由木屑、稻草、玉米芯等富含半纤维素的植物经水解而得的一种五碳糖，储量丰，也存在于动物肝素、软骨素和糖蛋白中，它是某些糖蛋白中糖链与丝氨酸(或苏氨酸)的连接单位。白色细小结晶或粉末，易溶于热乙醇和嘧啶，可溶于水。木糖与葡萄糖的化学性质相似，可以还原为相应的醇，主要用于制取木糖醇，作为底物发酵生产生物乙醇，在食品加工、制药工业也有广泛应用，可用于染色和制革，由于人体无法消化，不能利用，也被用作无热量甜味剂。能够利用木糖的微生物体内一般包含4种木糖代谢路径：木糖氧化还原酶路径、木糖异构酶路径、weimberg路径和dahms路径等，此外，还有两条近期在大肠杆菌中建立的木糖-1-磷酸酯(xylulose-1-phosphate，x-1-p)及核糖-1-磷酸酯(ribulose-1-phosphate，r-1-p)途径。
5.其中，作为原核和真核生物中代谢利用木糖能力比较强的菌株escherichia coli(简称，e.coli)和schefersomyces stipites(简称，s.stipites)，分别利用木糖异构酶路径和木糖氧化还原酶路径代谢木糖。在大肠杆菌的木糖异构酶路径中，木糖首先被基因xyla编码的木糖异构酶(xylose isomerase，xi)转化为木酮糖，随后被基因xylb编码的木酮糖激酶(xylulokinase，xk)磷酸化，产生5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖路径进一步代谢。类似于木糖异构酶路径，在s.stipites的木糖氧化还原酶路径中，木糖先被基因xyl1编码的nad(p)h-依赖的木糖还原酶(xylose reductase，xr)转化为木糖醇，进一步在xyl2编码的木糖醇脱氢酶作用下转化为木酮糖，随后木酮糖在基因xks1编码的木酮糖激酶的催化下生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖路径代谢。木糖氧化还原路径及异构酶路径在生物乙醇的制备具有非常高的应用价值，是发酵工程利用木糖或木糖-葡萄糖混糖制备生物乙醇的重
要研究方法之一。
6.来自于新月丙杆菌(caulobacter crescentus，简称cc)的weimberg木糖代谢路径(见图2)中d-木糖在五个酶促步骤中被氧化成三羧酸(tca)循环中间体α-酮戊二酸。首先，d-木糖在xylb(来自cc)基因编码的d-木糖脱氢酶(d-xylose dehydrogenase，xdh)的作用下被氧化生成d-木糖-γ-内酯，然后在xlyc(来自cc)基因编码的d-木糖-γ-内酯内酯酶(xylonolactonase，xla)的催化下进一步转化为中间体d-木糖酸盐，d-木糖酸盐通过d-木糖酸脱水酶(d-xylonate dehydratase，xad，由xyld(来自cc)编码)和2-酮-3-脱氧-d-木糖酸脱水酶(kdx dehydratase，kdxd，由xylx(来自cc)编码)进行两次脱水反应，产生2-酮-3-脱氧-d-木糖酸(2-keto-3-deoxy-d-xylonate，kdx)，然后产生α-酮戊二酸半醛(α-ketoglutarate semialdehyde，kgsa)。在最后一步，半醛被α-酮戊二酸半醛脱氢酶(kgsa dehydrogenase，kgsadh，由xyla(来自cc)编码)以nad(p) 依赖的方式被氧化成α-酮戊二酸进入三羧酸循环，参与代谢。
7.相比于前两种路径，weimberg木糖代谢路径反应步骤的放热过程具有较大的热力学吉布斯自由能差值，使得反应更容易自发进行，同时终产物α-酮戊二酸可以直接进入三羧酸循环，可以绕开磷酸戊糖途径，代谢流程相对较短，代谢过程不产生二氧化碳，没有碳损失。因此，本发明选择木糖weimberg代谢路径作为重组希瓦氏工程菌株木糖代谢利用模块的路径。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术的问题，本发明提出如下技术方案：
9.一种希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，采用biobrick的构建策略，利用同尾酶spei与xbai，处理后产生相同的粘性末端，在t4连接酶的作用将木糖转运蛋白基因和木糖weimberg代谢路径相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过转化、接合转移的方式导入到两种宿主菌shewanella oneidensis mr-1和s114中获得重组希瓦氏工程菌株s129和s135的构建方法。
10.所述重组工程菌株构建方法，利用同尾酶spei酶切位点为ctag。
11.所述重组工程菌株构建方法xbai酶切位点为ctag。
12.所述重组工程菌株构建方法，t4连接酶的作用下将分别来自中间假丝酵母的木糖转运蛋白的基因gxf1(seq id no.5)和来自新月丙杆菌的木糖weimberg代谢路径相关基因xylb(seq id no.6)，xylc(seq id no.7)，xyld(seq id no.8)，xylx(seq id no.9)，xyla(seq id no.10)，经过密码子优化后，按照如下顺序：gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla逐个连接到基础质粒pyydt(seq id no.1)上,然后通过pyydt上tac启动子(seq id no.2)和t1终止子(seq id no.3)表达，得到重组质粒(seq id no.11)。
13.所述重组工程菌株构建方法，重组质粒扩增菌株为escherichia coli dap营养缺陷型菌株。
14.所述重组工程菌株构建方法，重组质粒导入扩增菌株e.coli wm3064的转化方法采用常规的物理转化法，然后通过将携带重组质粒的e.coli wm3064与宿主菌mr-1和s114进行接合转移，最终将合成后的重组质粒转移到mr-1和s114中，分别得到目标工程菌s129和s135。
15.利用摇床摇瓶培养，分光光度计，高效液相色谱仪(hplc)，典型双室微生物燃料电池，电化学工作站进行实验验证构建菌株利用木糖代谢利用生长情况及mfc产电效果。
16.本发明为了克服天然野生希瓦氏菌mr-1不能够利用木糖生长和产电的限制，采用biobrick的构建策略，通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将木糖转运蛋白基因和weimberg代谢路径关键基因引入mr-1中构建重组希瓦氏工程菌，获得的重组希瓦氏工程菌株s129和s135；能利用含有木糖唯一碳源的改良后m9液体培养基进行生长代谢并产电，从而达到拓宽希瓦氏菌的底物利用谱目的，同时开辟了木糖资源化利用的新用途。
17.本发明构建1种重组质粒(seq id no.11)，以mr-1和s114(在mr-1基因组水平敲除转录抑制因子基因nagr seq id no.4)为底盘宿主菌，将重组质粒分别导入mr-1及s114中，重构希瓦氏菌的代谢通路，克服野生型希瓦氏菌不能利用木糖生长代谢的限制，使其能够以木糖为唯一碳源进行生长代谢并产电，从而拓宽希瓦氏的底物利用谱，提高木糖的资源化利用效率及应用范围。
18.以pyydt(seq id no.1，见图1)为基础质粒构建1种重组质粒(seq id no.11)，在基础质粒上包括tac启动子(seq id no.2)、t1终止子(seq id no.3)，通过酶切连接方式依次将目的基因连接到包含tac启动子和t1终止子的基础质粒pyydt(见图3)，分别包括：重组质粒：pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(seq id no.11)，获得2种工程菌株为：
19.s129：pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(in mr-1)
20.s135：pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(in s114)
21.木糖转运蛋白基因及weimberg代谢路径关键基因：
22.nagr:来自枯草芽孢杆菌的转录抑制因子基因(gene id：64305260，seq id no.4)
23.gxf1：来自中间假丝酵母的木糖转运蛋白的基因(genbank id：aj937350.1，seq id no.5)
24.xylb：来自新月丙杆菌的d-木糖脱氢酶基因(genbank id：mg681087.1，seq id no.6)
25.xylc：来自新月丙杆菌的d-木糖-γ-内酯内酯酶基因(genbank id：mg681088.1，seq id no.7)
26.xyld：来自新月丙杆菌的d-木糖酸脱水酶基因(genbank id：mg681089.1，seq id no.8)
27.xylx：来自新月丙杆菌的2-酮-3-脱氧-d-木糖酸脱水酶基因(genbank id：mg681090.1，seq id no.9)
28.xyla：来自新月丙杆菌的α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因(genbank id：mg681091.1，seq id no.10)
29.具体说明如下：
30.步骤一：重组质粒的设计与合成：基础质粒为pyydt(seq id no.1)，其上包含tac启动子(seq id no.2)和t1终止子(seq id no.3)，将本发明所述目的基因gxf1、xylb、xylc、xyld、xylx、xyla经密码子优化后，通过tac启动子和t1终止子表达，采用biobrick的构建策略，将使用snapgene设计好的重组质粒，送公司进行核苷酸序列合成，利用同尾酶spei(酶切位点：ctag)与xbai(酶切位点：ctag)，处理后留下相同的粘性末端，在t4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，并且保证已连接的外源基因不受后
续内切酶的影响。在这两个启动子之间连接不同的基因，由此构建重组质粒，从而发挥不同的功能，合成重组质粒(seq id no.11)；
31.步骤二：重组大肠杆菌e.coli wm3064和重组希瓦氏菌株的构建：选取escherichia coli dap营养缺陷型菌株(简称e.coli wm3064，ntcc编号：690048)为重组质粒扩增的工程菌用于质粒复制或连接实验，dap：2，6-二氨基庚二酸)；选取mr-1及s114为最终宿主菌，将重组质粒(seq id no.11)转化进入e.coli wm3064菌株的转化方法采用本领域常规的物理转化法；然后，利用接合转移技术将e.coli wm3064菌株携带的重组质粒(seq id no.11)转移到mr-1和s114中，得到构建的目的工程菌。导入基础质粒(pyydt，seq id no.1)的野生型菌株命名为wt作为空白对照，导入重组质粒到mr-1和s114两种宿主菌的工程菌株分别命名为：s129和s135。
32.步骤三：进行菌落pcr验证实验：琼脂糖凝胶电泳结果表明，阳性克隆存在，证明目的基因在宿主菌中成功扩增，工程菌株中重组质粒的成功导入和扩增(见图6)；
33.步骤四：有氧摇瓶培养发酵及残糖测定实验验证：四株重组希瓦氏工程菌wt，s114，s129，s135在含有浓度为150mm木糖溶液的改良后m9培养液中摇瓶发酵，每隔6h(后期每隔12h)在超净工作台中取发酵液利用紫外分光光度计测定各菌株的od
600
并记录用于绘制工程菌株生长曲线，高效液相液相色谱仪(hplc)测定每个时间点样品中木糖含量用于绘制木糖消耗曲线，数据表明：生长发酵60h后到达生长平台期，s135生物量(od
600
＝2.103)是wt(od
600
＝0.100)的21.03倍，培养基中的木糖在48h后消耗约47.69％；s129生物量(od
600
＝1.294)是wt(od
600
＝0.100)的12.94倍，发酵96h后培养基中木糖消耗了约45.03％(见图4)；
34.步骤四：工程菌mfc产电实验验证，四株重组希瓦氏工程菌wt，s114，s129，s135在含有浓度为150mm木糖溶液作为唯一碳源的改良后m9培养液上电池验证其产电能力，数据表明：电压稳定后，输出电压和功率密度最高的菌株为s135：输出电压(25.59mv)是wt(10.84mv)的2.36倍，功率密度(34.0137mw/m2)是wt功率密度(3.8263mw/m2)的8.89倍；菌株s129：输出电压(24.18mv)是wt(10.84mv)的2.23倍，功率密度(20.1615mw/m2)是wt功率密度(3.8263mw/m2)的5.27倍(见图5)。
35.应用领域：在上述构建方法中，本发明通过该重组质粒表达所实现的技术效果构建成功的重组希瓦氏工程菌s129和s135，能够克服野生型mr-1不能够利用木糖生长代谢并产电的限制，希瓦氏菌株能够以木糖唯一碳源进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏的底物利用谱，同时提高木糖的资源化利用率并扩展了其应用范围,也可以应用于生产或生活过程中，以纤维素为原料的水解液中木糖成分的利用和产电相关领域。
附图说明
36.图1所示为pyydt质粒图谱,包括质粒表达载体中启动子、终止子等关键组件及名称；
37.图2所示为本发明构建的工程希瓦氏菌木糖设计原理图；
38.图3所示为本发明重组质粒构建示意图；
39.图4所示为本发明工程菌株在有氧条件下，以加入150mm木糖为唯一碳源的改良后m9液体培养基中生长曲线及糖消耗曲线：生长曲线为深色，糖耗曲线为浅色,表明改造后的工程菌株都可利用木糖作为唯一碳源生长，且s135木糖利用能力更强，生长效果更佳，而转
入基础质粒pyydt的对照组菌株则不能利用木糖为唯一碳源生长；
40.图5所示为本发明工程菌株工程菌株以加入150mm木糖为唯一碳源的改良后m9液体培养基mfc产电效果：左图为微生物燃料电池输出电压效果图，右图为微生物燃料电池功率密度和电流密度效果图颜色由深至浅依次表示：wt，s114，s129，s135，结果表明工程菌株s129和s135均具有利用木糖为唯一碳源产电能力，且s135产电效果更为优异，而导入基础质粒pyydt的对照组菌株则没有表现出利用木糖作为碳源产电的优势；
41.图6所示为工程菌菌落pcr验证图：m为maker，泳道1，2，3，4为wt，基础质粒验证标志基因为laci(1083bp)；5和6为s129，7和8为s135，重组质粒验证标志目的基因选择xylx(1155bp)。
具体实施方式
42.本发明中设计的质粒是本实验室设计，菌株可市售获得。在全合成的本发明所需要的各外源基因过程中，需要将其连接到质粒载体上表达和保存。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
43.实施例1：重组质粒的构建(seq id no.11)
44.步骤一：合成tac启动子序列(seq id no.2)，合成并优化上述能够促进希瓦氏摄取木糖代谢利用的的基因序列gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(gxf1基因来自中间假丝酵母，其余基因均来源于新月丙杆菌的木糖weimberg代谢路径)。
45.步骤二：在这些目的基因的5’端添加xbai酶切位点(ctag)，3’端添加sbfi酶切位点(tgca)。然后分别将这六个基因通过xbai和sbfi酶切后，连入添加有spei酶(酶切位点：ctag)的pyydt质粒中，得到过渡质粒：pyydt-gxf1质粒、pyydt-xylb质粒、pyydt-xylc质粒、pyydt-xyld质粒、pyydt-xylx质粒、pyydt-xyla质粒。
46.步骤三：分别将pyydt-xylb质粒、pyydt-xylc质粒、pyydt-xyld质粒、pyydt-xylx质粒、pyydt-xyla质粒通过xbai和sbfi酶切后，获得目的基因：xylb(seq id no.6)，xylc(seq id no.7)，xyld(seq id no.8)，xylx(seq id no.9)，xyla(seq id no.10)。
47.步骤四：先将xylb基因与进行spei酶和sbfi酶切的pyydt-gxf1质粒用t4连接酶连接，获得对应的pyydt-gxf1-xylb质粒，然后再将xylc基因与进行spei酶和sbfi酶切的pyydt-gxf1-xylb质粒用t4连接酶连接获得pyydt-gxf1-xylb-xylc质粒，随后再将xyld基因与进行spei酶和sbfi酶切的pyydt-gxf1-xylb-xylc质粒用t4连接酶连接获得pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld，之后再将xylx基因与进行spei酶和sbfi酶切的pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld质粒用t4连接酶连接获得pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx质粒，最后再将xyla基因与进行spei酶和sbfi酶切的pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx质粒用t4连接酶连接获得pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(seq id no.11)。
48.上述构建的质粒转化入大肠杆菌感受态e.coli wm3064中，菌落pcr筛选，提质粒进行单双酶切验证以及测序验证，以保证目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
49.实施例2：重组大肠杆菌e.coli wm3064和重组希瓦氏菌株的构建
50.步骤一：转化：将上述得到的重组质粒通过物理转化法导入e.coli wm3064中，转化后采用lb dap kana平板(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl、0.059g/l 2，6-二氨基庚二酸、50μg/l卡那霉素、15g/l琼脂粉)进行筛选，在平板上挑出单菌落后，接种到
lb dap k液体培养基(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/lnacl、0.059g/l 2，6-二氨基庚二酸、50μg/l卡那霉素)进行培养，甘油管保菌(500μl菌液，500μl甘油)
51.步骤二：接合转移：将转化后的各重组大肠杆菌e.coli wm3064分别接种到3ml液体培养基lb dap kana(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl、0.059g/l 2，6-二氨基庚二酸、50μg/l卡那霉素)中培养，37℃，220rpm 10-12h；将mr-1或s114宿主菌株接种到3ml液体lb培养基(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl)中培养，30℃，200rpm 10-12h。
52.步骤三：将得到的重组大肠杆菌e.coli wm3064各种子液和mr-1、s114等宿主菌株种子液各取500μl混合到一个1.5ml无菌ep管中，5000rpm下离心10min，倒掉上清液。用1ml lb dap(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl、0.059g/l 2，6-二氨基庚二酸)重悬，在30℃下静置2h。静置完成后5000rpm离心10min，倒掉上清液，用500μl lb液体(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl)重悬，取50μl接种于lb kana固体平板上(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl、0.059g/l 2，6-二氨基庚二酸、15g/l琼脂粉)30℃培养箱中培养12小时以上，得到重组希瓦氏工程菌。
53.步骤四：菌落pcr进行验证：接合转移涂板的菌长出明显单菌落(直径大约0.5-1mm)后，准备菌落pcr，需要准备lb kana平板，并画好格子做好标记。配制pcr体系，分装入96孔pcr板，可以比实际需要的多配2-5个体系，防止因枪头沾有溶液造成损失。准备足量的灭菌牙签。在超净台，一根牙签挑取一个单菌落，放入一个体系的孔中；挑完后，每根牙签在新平板-对应的格中划线接种，丢弃牙签。全部划完后，96孔pcr板用封板垫严密封口，放入pcr仪，设定参数，开始运行。平板放入30℃恒温培养箱(生长不少于10h，具体看菌落长势，长到一定程度可以用保鲜膜包好放4℃)。
54.引物设计并合成：
55.xylx引物：
56.上游引物：5
’‑
atgggtgtttctgaattcttacc-3’57.下游引物：5
’‑
ttataataaaccacgaccagct-3’58.laci引物：
59.上游引物：5
’‑
gtgaaaccagtaacgttatacg-3’60.下游引物：5
’‑
tcactgcccgctttcca-3’61.pcr反应体系配置(trans fast taq)：ddh20 8μl；上、下游引物各1μl；taq酶mix:10μl；一个反应体系共20μl。
62.pcr条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸x s(1kb需30s，只能时间富裕不能不足)，30cycles，最后72℃再延伸7min，4℃保温。
63.然后配好琼脂糖凝胶(1％)，等待凝固后用于dna电泳鉴定。
64.大胶(100ml)：1xtae缓冲液100ml，琼脂糖1.0g，适当冷却后加核酸染料8μl，摇匀倒入放好透明垫和梳子的槽。中胶50ml，小胶25ml，按比例加。
65.pcr结束后，加dna loading buffer，点样，每孔各10μl，电泳10-15min。
66.观察有无目的条带并记录对应编号(见图6)。
67.将验证成功的重组希瓦氏工程菌保菌备用。
68.导入基础质粒(pyydt，seq id no.1)的野生型菌株命名为wt，向mr-1和s114两种
0.1mcacl2、1ml 4m naoh、iptg(1:2000)、kana(1:1000)，用ddh2o补齐至1l。
85.4.阴极液(1l):16.45g k[fe(cn)3]、6.8g kh2po3、11.4g k2hpo3[0086]
5.1m hcl溶液(1l)：83ml 37％hcl溶液定容至1l，室温储存。(放置于通风橱中)
[0087]
6.1m乳酸钠溶液(100ml)：18.68g 60％乳酸钠溶液，ddh20定容至100ml，灭菌后降至室温，至于4℃冰箱存储。
[0088]
7.1m mgso4溶液(100ml)：24.65g mgso4·
7h2o，ddh20定容至100ml，灭菌后降至室温，至于4℃冰箱存储。
[0089]
8、0.1m cacl2溶液(100ml)：1.109g cacl2，ddh20定容至100ml，灭菌后降至室温，至于4℃冰箱存储。
[0090]
9.5
×
m9母液(1l)：2.5g nacl、5g nh4cl、15g kh2po4、30g na2hpo4，灭菌。
[0091]
10.4m naoh溶液(100ml)：16g naoh固体溶解，并定容至100ml，0.22μm滤膜除菌。
[0092]
11.卡那霉素母液(50mg/ml)：0.5g kana粉末，ddh2o定容至10ml，用0.22μm滤膜除菌，分装为1ml/管，-20℃保存。
[0093]
12.iptg母液(1m)：1.9064g iptg、ddh2o定容至8ml，用0.22μm滤膜除菌，分装为100μl/管和200μl/管，-20℃保存。
[0094]
上述实验中，配制300mm的木糖溶液足量，在高温高压灭菌锅中115℃，灭菌15min，4℃保存待用；配制5
×
m9溶液足量，经过高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，冷却后4℃保存待用。
[0095]
步骤四：微生物电池组装完毕后，放入辰华chi1000c电化学工作站的30℃培养箱中运行，连接好数据采集卡进行电压数据采集。等待电池启动，待电压稳定后进行lsv曲线扫描，获得数据从而计算电池功率密度(见图5)。
[0096]
本发明的有益效果是：
[0097]
利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建1种重组质粒(seq id no.11)，将木糖摄取进入细胞并利代谢的关键基因:gxf1(seq id no.5)，xylb(seq id no.6)，xylc(seq id no.7)，xyld(seq id no.8)，xylx(seq id no.9)，xyla(seq id no.10)引入mr-1及s114中，重构mr-1的代谢通路，使工程希瓦氏能够在以木糖为唯一碳源的改良后m9液体培养基中进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌底物利用谱。将改造菌株进行有氧发酵，并分别测定其在150mm木糖为唯一碳源的改良m9液体培养基中的生长曲线及残糖量。数据显示，有氧发酵过程中，导入基础质粒pyydt(seq id no.1)的对照菌株wt及s114几乎不摄取代谢木糖；构建的2株工程菌株：
①
s129，
②
s135均能摄取一定量的木糖，其中菌株s135：pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(in s114)在150mm木糖为唯一碳源的改良m9液体培养基中的有氧发酵生物量相对较高，且摄取利用的木糖量最多。s135有氧发酵60h后到达生长平台期，生物量(od
600
＝2.103)是wt(od
600
＝0.100)的21.03倍，是s114(od
600
＝0.132)的15.93倍，培养基中的木糖在48h后消耗约47.69％(培养基中起始木糖浓度为150mm，即22.5195g/l，发酵48h后剩余木糖浓度为11.78g/l)；s129:pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(in mr-1)有氧发酵60h后到达生长平台期，生物量(od
600
＝1.294)是wt(od
600
＝0.100)的12.94倍，是s114(od
600
＝0.132)的9.80倍，发酵96h后培养基中木糖消耗了约45.03％(见图4)。
[0098]
重组工程菌株产电池数据表明：电压稳定后，输出电压和功率密度最高的菌株为
s135：输出电压(25.59mv)，是wt(10.84mv)的2.36倍，是s114(11.7mv)的2.19倍，功率密度(34.0137mw/m2)是wt功率密度(3.8263mw/m2)的8.89倍，是s114功率密度(4.9676mw/m2)的6.85倍；菌株s129：输出电压(24.18mv)是wt(10.84mv)的2.23倍，是s114(11.7mv)的2.07倍，功率密度(20.1615mw/m2)是wt功率密度(3.8263mw/m2)的5.27倍，是s114功率密度(4.9676mw/m2)的4.06倍(见图5)。可见：
[0099]
1、本发明利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建重组质粒(seq id no.11)，将木糖代谢的关键基因引入mr-1及s114中，得到能较好摄取利用木糖代谢的工程菌株:
[0100]
s129:pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(in mr-1)
[0101]
s135:pyydt-gxf1-xylb-xylc-xyld-xylx-xyla(in s114)
[0102]
从而拓宽希瓦氏菌的底物利用谱。
[0103]
2、本发明拓宽了产电微生物mr-1的底物利用谱，木糖作为木质纤维的水解产物，同时提高了木糖的资源化利用率及应用范围，为微生物燃料电池底物共利用的设计提供了现实依据，有利于提高菌株的胞外电子传递效率。
[0104]
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。