一种抗菌肽及其在防治多重耐药菌中的应用

1.本发明属于抗菌肽应用技术领域，具体涉及一种抗菌肽及其在防治多重耐药菌中的应用。


背景技术：

2.抗生素的过度使用和滥用导致了多重耐药(multi-drug resistant，mdr)细菌的出现。据估计目前由于耐抗生素细菌造成感染每年在全球造成约7万人死亡，如果没有新的治疗方法，到2050年，由多重耐药细菌引起的感染每年可能导致全球额外1000万人死亡，超过癌症。因此，抗生素耐药性已成为对全球人类公共健康日益严重的威胁，迫切需要探索和开发新的抗菌策略。
3.为解决这一问题最有潜力的两种策略是使用抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)和联合治疗。amps是一种长度为10到50个氨基酸的短肽，由各种生物包括真菌、植物和动物自然产生，首次由zeya和spitznagel从人类白细胞提取物中分离。amps作为宿主抵御病原体入侵第一道防线的组成部分，对不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(包括mdr细菌)表现出广泛的抑菌活性。尽管氨基酸序列高度不同，大多数amps是两亲性的，具有阳离子型(带正电荷)和疏水性质，这些特性使amps能高效地与阴离子微生物表面相互作用，并进入细胞膜，改变膜的通透性从而损害内部稳态。
4.联合治疗是指传统抗生素与其他抗生素或amps联合使用，与单一药物治疗相比较提高治疗效果。多种常规抗生素联合治疗已成为多重耐药菌感染的常见治疗方法，但amps与抗生素联合使用在很大程度上缺乏广泛的研究。


技术实现要素：

5.本发明首先提供一种抗菌肽及其在防治多重耐药菌中的应用，该多肽具有良好的抗菌效果，同时将抗菌肽与抗生素联合使用来杀灭多重耐药菌。
6.本发明所提供的抗菌肽，其氨基酸序列如下所示：
7.vfilskyrwvmrfvpwckallkrfgkykkhak(seq id no:1)
8.本发明所提供的抗菌肽用于制备抗菌制品；
9.本发明再一个方面还提供一种抗菌制品，所述的制品中包含有上述的抗菌肽和抗生素；
10.所述的抗生素包含有苯唑西林(oxacillin)、万古霉素(vancomycin)、链霉素(streptomycin)和阿奇霉素(azithromycin)等。
11.本发明所提供的抗菌肽对常见的致病菌具有明显的抗菌效果，与抗生素联合使用，能够有效的杀灭多重耐药菌。
具体实施方式
12.下面通过具体实施例对本发明进行详细的描述。
13.实施例1：抗菌肽的筛选及检测
14.从鸡法氏囊中筛选获得了氨基酸序列为vfilskyrwvmrfvpwckallkrfgkykkhak(seq id no:1)的抗菌肽，命名为audap。经过牛津杯实验，发现该抗菌肽audap对不具有耐药性的革兰氏阴性菌大肠杆菌菌株(escherichia coli)、革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌菌株(bacillus subtilis)具有明显的抑菌效果；但对于具有耐药菌的大肠杆菌菌株escherichia coli 577(atcc 577,e.coli 577)和肺炎克雷伯菌菌株klebsiella pneumoniae 2182(atcc 2182,k.pneumonia 2182)的抑菌效果并不显著。
15.audap抗菌肽对上述四种菌株的最低抑菌浓度(mic)结果如表1所示。
16.表1：audap抗菌肽对四种菌株的最低抑菌浓度值mic(μg/ml)
[0017][0018]
因此，本发明所筛选的audap抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抗菌、抑菌效果。
[0019]
实施例2：audap抗菌肽的细胞毒性检测
[0020]
通过mtt比色法测定使用小鼠巨噬细胞细胞在audap抗菌肽作用下的存活率，结果表明audap抗菌肽在浓度为15μg/ml条件下对raw264.7小鼠巨噬细胞未出现明显的毒害损伤作用，表明audap抗菌肽对哺乳动物正常组织细胞不具有显著毒性。
[0021]
测定抗菌肽audap的红细胞溶血性，具体步骤如下：
[0022]
1)将新鲜的小鼠全血，肝素抗凝，4℃3000r/min离心10min，将沉淀用生理盐水洗涤，并按照8％(v/v)重悬；
[0023]
2)将100μl的红细胞悬液与100μl不同浓度的抗菌肽溶液混匀。混合体系放置于37℃恒温箱中孵育1h，取出并在4℃3000r/min离心10min，取上清液，使用酶标仪测570nm处吸光值。
[0024]
结果表明，本发明的audap抗菌肽在75μg/ml的浓度下才出现了溶血现象，表明本发明的抗菌肽对细胞几乎没有细胞毒性，可以开发成抗菌药物
[0025]
实施例3：audap抗菌肽与抗生素联合使用
[0026]
检测的菌株为大肠杆菌escherichia coli 577(atcc 577,e.coli 577)、肺炎克雷伯菌菌株klebsiella pneumoniae 2182(atcc 2182,k.pneumonia 2182)和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌株usa500(s.aureus usa500)。
[0027]
通过生物公司合成audap抗菌肽，合成时对羧基末端进行酰胺化处理，合成产物纯度大于98％。
[0028]
将合成的audap抗菌肽溶解于1％(v/v)的三氟乙醇溶液中，配置为终浓度5mg/ml
的母液，分装后储存与-80℃待用。
[0029]
将待检测的菌株接种于lb液体培养基中扩大化培养，至培养细菌至对数生长期，离心收集菌体后，用pbs溶液反复吹洗细菌沉淀，得到的菌体最后用pbs重悬，使用血球计数板在显微镜下进行计数，并将浓度稀释至约2
×
106cfu/ml待用。
[0030]
为了检测audap抗菌肽与抗生素(oxacillin,vancomycin，streptomycin和azithromycin)之间的协同效应，采用sopirala等人所述的方法进行棋盘微量稀释法。将抗菌肽和抗生素分别用lb作倍比稀释，浓度各不相同的抗菌肽和抗生素交叉组合于96板孔中：使96孔板的每一行中每孔抗菌肽浓度不变，加入10μl抗生素使其浓度依次为2
×
、1
×
、0.5
×
、0.25
×
、0.125
×
、0.0625
×
和0.03125
×
mic；在96孔板每一列中抗生素的浓度不变，加入10μl抗菌肽溶液使其浓度依次为2
×
、1
×
、0.5
×
、0.25
×
、0.125
×
、0.0625
×
和0.03125
×
mic，每孔加浓度为3
×
106cfu/ml菌液10ul和170ul的新鲜lb，设置3个平行样，振摇均匀，放在37℃孵育10h。设置不含抗生素抗菌肽的pbs阴性对照组和仅含lb培养基的空白对照组。无细菌生长的最低浓度为联用时的mic，在multiskan mk3酶标仪下测定600nm处的吸光度，以确定mic。抗菌肽和抗生素之间的协同效应使用分数抑制浓度指数fic index(fici)方法。
[0031]
fica＝药物a合用时的mic/单独使用时的mi、
[0032]
ficb＝药物b合用时的mic/单独使用时的mic、
[0033]
fici＝fica ficb、
[0034]
协同效应:fici≤0.5；相加效应:0.5《fici≤1；没有作用:1《fici≤4；拮抗作用fici》4。
[0035]
结果显示audap抗菌肽与oxacillin处理s.aureus usa500、audap抗菌肽与azithromycin处理k.pneumoniae 2182的fici≤0.4，均表现出协同抑菌作用。audap抗菌肽与vancomycin对s.aureus usa500和audap抗菌肽与streptomycin对e.coli 577的0.5《fici≤0.6，表现为协同抑菌作用。audap抗菌肽与oxacillin联合处理s.aureus usa500时，audap抗菌肽的浓度降低至0.04
×
mic。当audap抗菌肽与vancomycin联合作用时，audap抗菌肽的浓度降低至0.6
×
mic。
[0036]
以上结果说明，audap抗菌肽与常规抗生素(oxacillin、vancomycin、streptomycin和azithromycin)联合作用时对耐药菌株表现出协同抑菌作用。