一种利用AFAP蛋白制备贴壁细胞的方法

一种利用afap蛋白制备贴壁细胞的方法
技术领域
1.本发明属于细胞培养技术领域，尤其是指一种利用afap蛋白制备贴壁细胞的方法。


背景技术：

2.细胞培养具有悬浮细胞培养和贴壁细胞培养两种方式。与悬浮细胞相比，贴壁细胞具有易转染、易病毒感染、易染色观察、可用于病毒蚀斑试验等优点，在科研、教学和生物制品生产等方面具有不可替代的作用。目前将悬浮细胞制备成贴壁细胞的方法较少，多采用将悬浮细胞培养在包被有基质蛋白培养器皿上，以增强悬浮细胞或黏附性不强的细胞的贴壁性能。
3.悬浮细胞不具有贴壁培养的特性，在培养过程中呈现悬浮状态。为增强悬浮细胞的贴壁性能，一般可通过在培养介质表面包被基质蛋白成分，如胶原蛋白、多聚赖氨酸等物质介导悬浮细胞的贴壁生长。但这种制备贴壁生长细胞的方法具有耗时、成本高、仅限于单次和小规模使用的不足之处。这些不足决定这种制备方法仅能适用于科研和教学场景的使用，无法应用于生物制品生产上。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用afap蛋白制备贴壁细胞的方法。本发明适用于需要将悬浮细胞或半贴壁细胞转变成贴壁细胞，或需要悬浮生长和贴壁生长两种细胞培养状态间互相转变的场景，一次制备，无限期使用，并且无需使用基质蛋白或多聚赖氨酸等物质包被培养器皿。
5.一种利用afap蛋白制备贴壁细胞的方法，包括以下步骤：
6.(1)将编码afap蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体，构建成表达afap重组质粒；
7.(2)将步骤(1)中所得表达afap重组质粒转染或转导入细胞中，即得贴壁细胞。
8.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述编码afap蛋白的核苷酸序列见seq id no.1。
9.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述afap蛋白的氨基酸序列见seq id no.2。
10.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述表达载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。
11.在本发明的一个实施例中，所述组成型表达载体包括各种商品化或非商品化的组成型表达载体。
12.在本发明的一个实施例中，所述组成型表达载体包括pires系列载体、pcdna系列载体、pcmv系列载体、pbapo系列载体、pbi-cmv系列载体(pbi-cmv1-5)。
13.在本发明的一个实施例中，所述pires系列载体包括pires或pirespuro3等。
14.在本发明的一个实施例中，所述pcdna系列载体包括pcdna3.1或pcdna3.4等。
15.在本发明的一个实施例中，所述pcmv系列载体包括pcmv-myc或pcmv-ha等。
16.在本发明的一个实施例中，所述pbapo系列载体包括pbapo-cmv或pbapo-ef1alpha等。
17.在本发明的一个实施例中，所述pbi-cmv系列载体包括pbi-cmv1-5。
18.在本发明的一个实施例中，所述诱导型表达载体包括各种商品化或非商品化的诱导型表达载体。
19.在本发明的一个实施例中，所述诱导型表达载体为ptetone和ptre3g系列载体、pt-rex-dest系列载体或pgene等。
20.在本发明的一个实施例中，所述ptre3g系列载体为ptre3g-mcherry。
21.在本发明的一个实施例中，所述pt-rex-dest系列载体为pt-rex-dest30或pt-rex-dest31。
22.在本发明的一个实施例中，所述细胞包括悬浮细胞或半贴壁细胞。
23.在本发明的一个实施例中，所述悬浮细胞包括所有的呈悬浮状态培养的细胞，如hl-60、thp-1、nb4、jurkat、j774、cem、nb-4、u-937、k-562、hut-78、rpmi-1788、molt-3、bv-173等。
24.在本发明的一个实施例中，所述半贴壁细胞为hek293、raw264.7、sf9、s2、b95-8、rpmi-8226、colo 201、lim2405、rts11、k562或42ta等。
25.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
26.本发明是一种利用具有增强细胞黏附能力的afap蛋白制备贴壁细胞的方法，适用于将悬浮或半贴壁生长的细胞转变成贴壁生长的细胞。本发明不需要利用基质蛋白包被培养器皿，具有一次制备无限次数使用的特点，适用于科研、教学和生物制品生产等场景。
27.1，简化科研和教学场景中制备贴壁生长细胞的频次和步骤。一次制备，无限期使用，并且无需使用基质蛋白或多聚赖氨酸等物质包被培养器皿。
28.2，适合于生物制品生产中的应用。如前所述，基质蛋白包被法，无法应用于大规模的生物制品生产场景，但利用本发明所述方法易于大规模制备贴壁生长的细胞，适用于生物制品生产。
29.3，适合于需要悬浮生长和贴壁生长两种细胞培养状态间互相转变的场景，例如在贴壁生长状态下的转染或病毒感染，然后在悬浮生长状态生产生物制品。通过将afap编码基因克隆入诱导型表达系统，筛选出可诱导表达的细胞株。在诱导状态下，afap蛋白表达，细胞呈现贴壁生长状态；在非诱导状态，afap蛋白不表达，细胞呈现悬浮生长状态。本发明适用于需要悬浮生长和贴壁生长两种细胞培养状态间互相转变的场景。
附图说明
30.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
31.图1是本发明afap重组表达质粒的构建。
32.图2是本发明反置细胞离心法测量细胞的贴壁能力结果图。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
34.一种利用afap蛋白制备贴壁细胞的方法，包括以下步骤：
35.(1)将编码afap蛋白的核苷酸序列克隆入表达载体，构建成表达afap重组质粒；
36.(2)将步骤(1)中所得表达afap重组质粒转染或转导入细胞中，即得贴壁细胞。
37.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述编码afap蛋白的核苷酸序列见seq id no.1，所述afap蛋白的氨基酸序列见seq id no.2。
38.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述表达载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。
39.在本发明的一个实施例中，所述组成型表达载体包括各种商品化或非商品化的组成型表达载体。
40.在本发明的一个实施例中，所述组成型表达载体包括pires系列载体、pcdna系列载体、pcmv系列载体、pbapo系列载体、pbi-cmv系列载体(pbi-cmv1-5)。
41.在本发明的一个实施例中，所述pires系列载体包括pires或pirespuro3等。
42.在本发明的一个实施例中，所述pcdna系列载体包括pcdna3.1或pcdna3.4等。
43.在本发明的一个实施例中，所述pcmv系列载体包括pcmv-myc或pcmv-ha等。
44.在本发明的一个实施例中，所述pbapo系列载体包括pbapo-cmv或pbapo-ef1alpha等。
45.在本发明的一个实施例中，所述pbi-cmv系列载体包括pbi-cmv1-5。
46.在本发明的一个实施例中，所述诱导型表达载体包括各种商品化或非商品化的诱导型表达载体。
47.在本发明的一个实施例中，所述诱导型表达载体为ptetone和ptre3g系列载体、pt-rex-dest系列载体或pgene等。
48.在本发明的一个实施例中，所述ptre3g系列载体为ptre3g-mcherry。
49.在本发明的一个实施例中，所述pt-rex-dest系列载体为pt-rex-dest30或pt-rex-dest31。
50.在本发明的一个实施例中，所述细胞包括悬浮细胞或半贴壁细胞。
51.在本发明的一个实施例中，所述悬浮细胞包括所有的呈悬浮状态培养的细胞，如hl-60、thp-1、nb4、jurkat、j774、cem、nb-4、u-937、k-562、hut-78、rpmi-1788、molt-3、bv-173等。
52.在本发明的一个实施例中，所述半贴壁细胞为hek293、raw264.7、sf9、s2、b95-8、rpmi-8226、colo 201、lim2405、rts11、k562或42ta等。
53.实施例1利用apap蛋白制备hek293贴壁细胞
54.选取hek293细胞，hek293细胞为半贴壁细胞，贴壁不牢，易从培养器皿中培养支持面脱离。
55.本实施例将描述制备紧密贴壁的hek293细胞，具体步骤如下：
56.1.参照afap核苷酸序列，使用基因合成方法或pcr方法，获得5'-端携带nhei酶切位点、3'-端携带ecori酶切位点的编码afap的dna片段，将此dna片段使用nhei和ecori双酶
切和经过nhei和ecori双酶切的pirespuro3载体相连，得到pirespuro3-afap重组表达质粒(质粒构建结果具体见图1)。
57.2.在6孔板中，培养数量为0.5x106个hek293细胞。使用lipofectamine 3000化学转染试剂盒，将2.5μg的pirespuro3-afap重组表达质粒与转染试剂盒中的5μl lipofectamine 3000和5μlp3000混合，形成dna-脂质复合物，然后加入到hek293细胞中，进行转染。
58.3.在转染72小时后，吸弃6孔板中的培养基，然后加入含有浓度为0.5μg/ml嘌呤霉素的培养基进行培养。每培养3天，更换新鲜的含0.5μg/ml嘌呤霉素的培养基进行培养，直至稳转细胞株出现。筛选周期约为2周时间。
59.4.利用有限稀释法，将稳转细胞株，使用胰酶进行消化，对细胞进行计数，使用含0.5μg/ml嘌呤霉素的培养基稀释细胞至0.5个细胞/100μl，滴加至96孔板(100μl/孔)，进行培养获得稳定表达afap的hek293稳转细胞克隆株。
60.5.将96孔板中的hek293稳转细胞克隆株转移至细胞培养瓶中进行扩大培养，即获得贴壁细胞。可通过使用移液枪吹打或利用手掌拍打细胞培养瓶，观察细胞贴壁能力。定量检测hek293稳转细胞克隆株的贴壁能力可通过反置细胞离心法等方法进行(具体见图2)。
61.反置细胞离心法是一种定量检测细胞黏附能力的方法。此方法是通过将培养在孔板中的细胞，反置在甩板机上进行离心，比较离心前后孔板中细胞数量的变化，测量细胞的贴壁能力。本实施例通过培养稳定表达afap的hek293细胞(hek293稳转细胞)和hek293对照细胞的孔板，反置于甩板机上，进行离心，比较离心前后孔板中细胞的数量，测量细胞的贴壁能力。hek293稳转细胞数目在离心后，与离心前相比，没有变化，96％的细胞离心后仍贴于培养板孔中；而hek293对照细胞数目在离心后大幅减少，只有8％的细胞离心后仍贴于培养板孔中。
62.序列情况：
63.1，编码afap蛋白的核苷酸序列：
64.5'-atggctagaagaggaacatgtactataacttccgggaagaaaactccgaaggtacaagaagaagtagtcgggcgttttaacatcggacatgaggtagatcgtgagtttaaggaaaaaccgatctcattttcggaacgtacgacttcggttagggcaaggattgccaaaatggcgcaatcagcggcccaaggtgttgctaaggtacctgaacgtgcatcaaaagcagcaacatctgtaggtgatggtattgggaaagctgcaaggacaactaaggatggtgtaactcgagcagcgagatccgtatctcaaggtattaatgctaaagtggtagaacctgtatcaaaagcagcaacatctgtaggtgatggtattgggaaagctgcaaggacaactaaggatggtgtaactcgagcagcgagatccgtatctcaaggtattaatgctaaagtggtagaacctgtatcaaaagcagcaacatctgtaggtgatggtattgggagagctgcaagggcaactaaagatggtgtaactaaggcatccagatctgcagggaaaggtattgataaagttccagcacgtgcatcaaaagcagcaacatctgtaggtgatggtattgggaaagctgcaagggcaactaaagatggtgtaactaaggcatccagatccgcaggtagaggtattgctaaagtccctgagcatgttacagaagcagtgcaaaaaacactattcccatcctcagttggaaccggtgttctgcataccactaaagagctctctgcaacgcatttgaaatactctccattgcacggattagagtctaatgctgttaagctggtaagtgtgacaaagaaaggtgctgaaagcctaagtaatgagttatatgctactggtaatacagcaagcagacatacccaaagattgtctgcacaacaagagagtgcttcaaagaaagtagggcgtgctaaa-3'。
65.2，afap蛋白的氨基酸序列：
66.marrgtctitsgkktpkvqeevvgrfnighevdrefkekpisfserttsvrariakmaqsaaqgvakv
peraskaatsvgdgigkaarttkdgvtraarsvsqginakvvepvskaatsvgdgigkaarttkdgvtraarsvsqginakvvepvskaatsvgdgigraaratkdgvtkasrsagkgidkvparaskaatsvgdgigkaaratkdgvtkasrsagrgiakvpehvteavqktlfpssvgtgvlhttkelsathlkysplhglesnavklvsvtkkgaeslsnelyatgntasrhtqrlsaqqesaskkvgrak。
67.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。