一种L型纤维超分子及其制备方法与应用与流程

一种l型纤维超分子及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，涉及新型止血功能材料，具体涉及一种l型纤维超分子及其制备的止血功能材料与应用。


背景技术：

2.在口腔临床实践中，拔牙后出血是术中及术后最常见的症状，如处理不及时可导致血流不止，给患者带来巨大的心理恐惧及严重的并发症。牙齿拔除后采用快速有效的止血方式，对拔牙伤口愈合减少并发症的发生至关重要。填塞法是最常见的拔牙窝出血处理方式，合理使用局部止血材料充填拔牙窝是治疗及预防拔牙后出血的重要措施。目前，多数拔牙止血通过填充多孔材料进行压迫止血，止血材料可分为可吸收型和不可吸收型。不可吸收型材料，比如，碘仿纱条，需二次手术取出，延迟拔牙窝愈合，已逐渐被可吸收类止血材料取代。常用的止血材料包括明胶海绵、纤维蛋白胶和医用胶原蛋白。
3.明胶海绵为动物皮肤、骨、筋膜等结缔组织中提取的非晶体物质，经多程序处理及制备呈多孔海绵样结构。明胶海绵其止血原理是多孔结构可迅速吸收大量血液，促进血小板吸附、凝集达到止血效果。在实际应用中，明胶海绵主要发挥止血作用，且存在材料与组织粘连情况，对牙槽窝愈合无作用，多数材料不兼具快速止血和促牙槽窝新骨形成功效，难以满足加速牙槽窝愈合需求，并且部分不可降解的止血材料需二次手术取出，减缓拔牙伤口愈合。
4.纤维蛋白胶由人或哺乳动物血浆制备而来，主要成分是黏蛋白和凝血酶浓缩物。纤维蛋白胶止血原理是通过高浓度的纤维蛋白原及凝血因子模拟机体凝血过程形成纤维蛋白膜达到止血作用，而在促骨再生功能方面尚不清楚。由于纤维蛋白胶材料本身具有凝血作用，因此可用于凝血功能障碍的患者，需要注意的是，血液制品存在诱发免疫反应风险。
5.医用胶原蛋白是由医用胶原蛋白制作的胶原塞，其原理是在吸收水分或血液后可膨胀，能粘附于组织表面，达到止血效果。较临床上其他常用的拔牙窝止血材料而言，止血效果好，在出血量较大的情况下，胶原塞也不易软化。同样，胶原蛋白为主的拔牙充填材料的降解过程及促骨再生作用不清楚。
6.近年来，研究利用自组装多肽水凝胶在大组织器官损伤止血方面取得一些成效，如肝外伤止血，因其不用缝合且具有良好生物相容性和安全性，作为止血材料具有独特地优势。自组装多肽水凝胶是通过多肽在疏水作用、静电作用和氢键结合等非共价弱相互作用的驱动下，多肽可以在出血部位自组装进而凝胶化，显著减少失血。这种由弱相互作用驱动的自我组装成特定的网络纳米结构实现止血功能，但微弱的闭合体间相互作用使得它们较脆弱。
7.现有临床上常用拔牙窝止血材料，如明胶海绵和医用胶原蛋白，大都通过机械压迫方式借助材料吸血膨胀，粘附，凝血，达到止血效果。尽管上述材料都具有一定的止血功效，但是部分止血材料对大量出血或凝血功能障碍无效，且止血材料本身缺少与机体相互
作用机制，不能达到快速止血效果。而现有的自组装多肽水凝胶，多肽由于其特殊的分子结构，容易被蛋白酶识别和水解，难以兼顾稳定性与功效性。


技术实现要素：

8.本发明目的在于解决现有的明胶海绵、纤维蛋白胶、医用胶原蛋白、自组装多肽水凝胶等止血材料存在的止血速度缓慢、止血效果不佳、功能相对单一、难以兼顾稳定性与功效性等问题。
9.基于上述目的，本发明提供了一种l型纤维超分子来解决本领域内的这种需要。
10.一方面，本发明涉及一种l型纤维超分子，其结构式如式(ⅰ)所示：
[0011][0012]
另一方面，本发明提供了一种l型纤维超分子的制备方法，其包括：
[0013]
树脂的活化：dmf浸泡溶胀树脂30min，抽滤后采用dmf和dcm交替洗涤3～4次；
[0014]
氨基酸的耦联：依照式(ⅰ)所示的多肽序列，将l型氨基酸经hbtu/hobt、diea活化后加入树脂，进行顺序反应得到含多肽的树脂；
[0015]
多肽的切除和沉淀：将所述含多肽的树脂置于切割液中2～3h，经冰乙醚沉淀，50％乙腈水重悬，得到冻干的粗品多肽；所述切割液以1ml去离子水计，包含1ml去离子水、17.6mltfa、0.4mltips和0.7g苯酚；
[0016]
多肽的分离纯化：将所述冻干的粗品多肽溶于6m盐酸胍水溶液中，使用制备反相c18液相色谱(hplc)分离，收集主要峰产物。
[0017]
另一方面，本发明涉及一种凝胶，其包含l型纤维超分子和钙离子溶液。
[0018]
进一步地，在本发明提供的一种凝胶中，每100l的1g/l钙离子溶液与0.5～50g所述l型纤维超分子混合。
[0019]
本发明对多肽进行修饰和改造得到l型纤维超分子，其为钙离子结合肽，在钙离子的作用下，多肽序列自组装为纳米线，兼顾了稳定性与功效性。本发明提供的由l型纤维超分子制备的凝胶经试验证明其展现出良好的止血及生物相容性，体内应用不引起局部及全身炎症反应，且机体内降解时间短，已到达促进止血以及伤口愈合和骨再生的功效。由此，本发明进一步请求保护由本发明提供的l型纤维超分子制备的凝胶在制备止血材料中的应用和在制备促进骨再生材料中的应用。基于上述应用，本发明进一步请求保护基于本发明在无创造性活动下可得到的一种止血材料、一种止血组合物和一种促进骨再生的组合物。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果或优点：
[0021]
本发明提供的由l型纤维超分子制备的凝胶经试验证明其展现出良好的止血及生物相容性，体内应用不引起局部及全身炎症反应，且机体内降解时间短，兼具促进止血、伤口愈合和骨再生的功效。
resolution：15，高质量分辨率hm resolution：15，离子能量lon energy：0.3，细管电压capilary(kv)：3.5，锥孔电压cone(v)：30，脱溶剂气温度desolvation temp(℃)：350；m/z范围400～1600，电离模式es ，运行时间1min。将装有样品的玻璃瓶放入样品盘中，在样品表界面(sample list)命名样品，设置上样量为5μl以及样品的位置，在液相方法中加载方法，开启液相的泵，保存文件，运行样品列表。待程序结束后，在样品表中点击chromatogram，导出质谱数据，质谱数据结果如图2所示。对照质谱图中的质荷比m/z数据，计算(mw z)/z是否与图谱中相应的质荷比接近，确定应用该方法制备的多肽分子量为mw：2759.04da与如式(ⅰ)所示化合物一致。
[0038]
实施例2
[0039]
本实施例提供了由l型纤维超分子制备的凝胶试验。
[0040]
称量0.5mg、10mg l型纤维超分子粉末，溶于100ml的1mg/ml的cacl2水溶液中，超声溶解，即可制备成0.5％、10％(w/v)的l型纤维超分子凝胶。
[0041]
各取30μl配置好的体积分数为0.5％和10％的l型纤维超分子凝胶，稀释100倍，于280nm检测其吸光度值，其试验结果如表1所示。2种多肽的消光系数均为1790，其性能无较大差异。
[0042]
表1，0.5％和10％的l型纤维超分子凝胶吸光效果
[0043]
多肽体积分数280nm吸光度摩尔浓度(mol/l)l0.5％1.5388.59l10％1.94110.84
[0044]
实施例3
[0045]
本实施例提供了l型纤维超分子凝胶的交联度表征与稳定性验证试验。
[0046]
依照实施例2，制备0.5％(w/v)和10％(w/v)的l型纤维超分子凝胶。超声溶解，制备sem(扫描电镜)样品，进行表征，试验结果如图3a所示。同时，静置凝胶溶液不同时间长度(0、1、3、5天)，验证凝胶的稳定性，试验结果如图3b所示。
[0047]
如图3a结果所示，在sem表征结果中，随着ca
2
浓度的增加，l型纤维超分子的纤维呈现增粗交联更致密的趋势。如图3b结果所示，随着时间的延长(0～5天)，l型纤维超分子凝胶溶液没有明显变化，证明了l型纤维超分子凝胶的稳定性优异。
[0048]
实施例4
[0049]
本实施例提供了l型纤维超分子凝胶体外凝血效果评价试验。
[0050]
实验使用6～8周龄雄性大鼠，体重180～220g。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，腹腔静脉取血。配制3.2％枸橼酸钠溶液，按全血:枸橼酸钠＝9:1的比例混合，制备成抗凝血液。实验分为空白对照组、明胶海绵组、l型纤维超分子凝胶组。0.5％和10％的l型纤维超分子凝胶的体外凝血效果无显著差异，示例性的本实施例中l型纤维超分子凝胶组选择所用手性止血多肽凝胶的体积分数为10％。抗凝血液复钙后(抗凝血液:0.2m氯化钙＝9:1)缓慢滴在37℃中预热后的水凝胶的表面。将装有血样的培养皿在37℃下分别孵育0.5min、1.5min、2.5min、3.5min、4.5min、5min、5.5min和6min。在相应的时间点，轻轻加入1ml去离子水，在不干扰凝块的情况下释放游离血液，测试结果如图4a所示。在542nm波长下测定上清液的吸光度，测定结果如图4b所示。
[0051]
由图4可知，体外凝血实验中，与自然凝血对照组和明胶海绵组相比，结果表明l型
纤维超分子凝胶能在0.5min内迅速使血液凝集，发挥止血作用。
[0052]
实施例5
[0053]
本实施例提供了l型纤维超分子凝胶体内炎症反应评价试验。
[0054]
实验使用6～8周龄雄性大鼠，体重180～220g。大鼠随机分成明胶海绵组和l型纤维超分子凝胶组，每组3只。0.5％和10％的l型纤维超分子凝胶的体内炎症反应效果无显著差异，示例性的本实施例中l型纤维超分子凝胶组选择所用手性止血多肽凝胶的体积分数为10％。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，背部皮下填充25mm3的明胶海绵或注入50μl l型纤维超分子凝胶，于1day后收集全血与血清，进行血常规及血液生化检测，检测结果如图5～8所示；然后分别于1day、3day、7day后取皮肤组织进行he染色，he染色试验结果如图9所示。
[0055]
大鼠皮下植入明胶海绵或注入l型纤维超分子凝胶1天后，取各组大鼠血液进行血常规检测。由图5可知，通过分析血常规结果，与明胶海绵组相比，l型纤维超分子凝胶进入机体不会引起血细胞成分异常，不会引起炎症反应。分离各组大鼠血清后，检测l型纤维超分子凝胶对大鼠肝功能、肾功能和心肌酶谱的影响，结果表明，和明胶海绵组相比，l型纤维超分子凝胶不会引起肝脏(如图6所示)、肾脏(如图7所示)及心脏(如图8所示)损伤。
[0056]
大鼠皮下植入明胶海绵或注入l型纤维超分子凝胶1day、3day、7day后，取大鼠皮肤组织进行he染色。由图9可知，明胶海绵会引起皮下植入部位的炎性细胞浸润，且随着时间的延长，局部炎性细胞增。另外，进一步分析图9可以发现，明胶海绵在7天内的降解程度有限。综合分析图9结果，l型纤维超分子凝胶在前三天炎性细胞浸润加重，3天后炎性细胞浸润明显减少，l型纤维超分子凝胶体积减小，通过和明胶海绵组对比发现，l型纤维超分子凝胶组局部炎性细胞明显减少。
[0057]
实施例6
[0058]
本实施例提供了l型纤维超分子凝胶体内止血及促进骨愈合再生评价试验。
[0059]
实验使用6～8周龄雄性大鼠，体重180～220g。大鼠随机分成空白对照组、明胶海绵组和l型纤维超分子凝胶组，经戊巴比妥钠麻醉后，拔除上颌右侧切牙，明胶海绵组在拔牙窝填充10mm3的明胶海绵，l型纤维超分子凝胶组迅速注入50μl l型止血凝胶，空白对照组不做处理。0.5％和10％的l型纤维超分子凝胶的体内止血及促进骨愈合再生效果无显著差异，示例性的本实施例中l型纤维超分子凝胶组选择所用手性止血多肽凝胶的体积分数为10％。待完全止血后，记录出血时间，记录结果如图10所示。一个月后，取大鼠上颌组织，经固定后，进行micro ct扫描，观察拔牙窝愈合情况，观察结果如图11所示。
[0060]
由图10可知，和对照组相比，l型纤维超分子凝胶能显著降低拔牙后出血时间。大鼠拔牙1个月后，取大鼠上颌拔牙窝组织进行micro ct扫描，扫描结果见由图11a。由图11b～图11e可知，与明胶海绵组相比，l型纤维超分子凝胶能促进牙槽窝新生骨再生，新生小骨厚度和数量增加，新生小骨间隙减小。
[0061]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。