一种SARS-Cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法

一种sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种新型冠状病毒sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎(即新冠肺炎covid-19)全球流行至今已有近2年的时间，感染的总人数超过2.4亿、死亡超过490万。而引起本次全球肺炎大流行的病原体是新型冠状病毒，世界卫生组织(who)将其命名为sars-cov-2。冠状病毒是自然界广泛存在的一类病毒，属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，具有囊膜，是基因组为线性单股正链的rna病毒，分为α、β、γ、δ四个属。目前已经被发现的冠状病毒大约有15种，分为可感染人型和非感染人型，迄今为止人类已经发现了6种可感染人类的冠状病毒。新型冠状病毒sars-cov-2属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60～140nm，具有5个基因，分别针对核蛋白(n)、病毒包膜(e)、基质蛋白(m)和刺突蛋白(s)四种结构蛋白及rna依赖性的rna聚合酶(rdrp)，核蛋白(n)包裹rna基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜(e)，病毒包膜包埋有基质蛋白(m)和刺突蛋白(s)等蛋白；刺突蛋白通过结合血管紧张素转化酶2(ace-2)进入细胞。体外分离培养时，新型冠状病毒在96个小时左右，即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在vero e6和huh-7细胞系中分离培养需要4～6天(即96-144小时)；新型冠状病毒对紫外线和热敏感，在56℃、30分钟可用乙醚、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂进行有效灭活，但用氯己定不能灭活。新型冠状病毒对全年龄段的人都容易感染，感染后潜伏期1～14天，多为3～7天，发病症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者会快速进展为急性呼吸窘迫综合症、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍、多器官功能衰竭等。自新冠肺炎covid-19出现以来，sars-cov-2的变异一直是人们担忧的问题，who根据该病毒的传播能力、临床严重程度以及对治疗和预防措施可能产生的影响，将其分为“关切变异株(vocs)”和“关注变异株(vois)”两种，vocs是具有更强的传染性变异株，会导致更严重的高住院率或高死亡率，而且曾经感染或接种疫苗产生的抗体对该关切变异株(vocs)明显减弱，治疗或疫苗的有效性更低、检测诊断的失败率更高。目前发现的变异株主要有：英国的alpha株、南非的beta株、巴西的gamma株、印度的delta株，除此之外，还有尼日利亚的eta变异株、美国的iota变异株、印度的kappa变异株、秘鲁的lambda变异株，且新的变异株还在不断出现，但从目前的情况看，印度的delta株是在全球流行的主要变异株。
3.接种疫苗是预防及控制传染性疾病快速、高效、经济的措施，而疫苗的目的是让人体形成特异性的记忆b细胞和记忆t细胞，在免疫记忆形成后，若人体遭到此病原体袭击，获得性免疫能够迅速应答，在病原体大规模感染其他细胞前，将病原体和已被感染的细胞杀灭。用于新冠肺炎covid-19的疫苗生产技术平台可概括为11种类型，但目前使用的新型冠状病毒疫苗，除灭活疫苗外，其余的mrna疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗的免疫蛋白，均为sars-cov-2刺突蛋白—即s蛋白。对疫苗接种效果的评价，有流行病学效果评价及免疫
学效果评价，其中：1)流行病学效果评价指临床研究及疫苗大规模使用后保护率水平，这是对疫苗有效性评价最直接、最有说服力的金标准；2)免疫学效果评价包括疫苗接种后的细胞免疫水平评价、以及体液免疫水平评价，在体液免疫水平的评价中，最有指导意义的是中和抗体(neutralizing antibody，nab)效价检测。
4.通常新型冠状病毒疫苗的中和抗体效价检测，必须在p3级实验室内完成，因此给检测工作带来了极大的困难，且受此检测条件的限制，人们利用基因工程技术研发出：基于假病毒颗粒的中和抗体效价检测方法，但该检测结果不稳定、无法标准化，且不同实验室之间的检测结果也无法进行比对，从而失去指导意义。现有的sars-cov-2igm/igg抗体检测有：胶体金法、化学发光法、elisa法等商品化抗体诊断试剂盒。但无论是何种检测，仍存在下列问题：
5.(1)均为非中和性抗体定量检测，其检测值对活病毒中和抗体效价而言，不具有指导意义；
6.(2)在病毒变异时，已有的检测方法的灵敏度可能会改变，需要重新评估其检测效能，特别是当检测结果与临床和流行病学预期不匹配时，更需要重新评估其检测效能。
7.因此，大规模接种疫苗免疫后的血清免疫学水平评价，需要一种在普通实验室就能进行、非活病毒、细胞外进行、操作快速、与活病毒中和抗体效价检测结果相近、具有指导意义的检测方法，从而对疫苗保护效果进行评价，并对疫苗加强针的注射给予及时指导。


技术实现要素：

8.本发明正是为解决以上需求，提供一种sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，以便获得与活病毒细胞内中和抗体高度相关的enab中和抗体效价，同时本发明是在普通实验室、并且是细胞外就能进行检测，无需在专门的p3实验室并且是细胞内活病毒检测，因此，具有极高的推广应用价值。
9.本发明通过下列技术方案完成：一种sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，其特征在于包括下列步骤：
10.1)室温平衡，将sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测试剂、enab中和抗体定量检测参比品及待检血清样品取出，置于室温平衡30-60分钟；
11.2)预稀释，将待检血清样品、enab中和抗体定量检测参比品进行1∶100倍的预稀释，得预稀释液；
12.3)加样至酶标板
13.31)将步骤2)的待检血清样品的预稀释液进行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据样品预估值而定；取预估值终点往前的8个稀释度进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量加入到酶标板对应的样品孔中，各加1孔，共8孔；
14.32)将步骤2)的enab中和抗体定量检测参比品的预稀释液进行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据参比品标化值而定，取标化值终点往前的8个稀释度进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量加入酶标板的样品孔中，各加1孔，共8孔；
15.33)在酶标板上：设抗体阴性对照及抗体阳性对照各2-3孔，100μl/孔，设稀释液对照1孔，加入稀释液100μl/孔，另设空白孔1孔；
16.4)孵育，将步骤3)的加样酶标板置于湿盒中，于37
±
0.5℃孵育0.5-2小时，用洗液
洗板4～5次，并用吸水纸拍干洗液；
17.5)加酶，在步骤4)的酶标板样品孔中，除空白孔外的所有样品孔中均加入抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶，100μl/孔；
18.6)孵育，将步骤5)的酶标板置于湿盒中，于37
±
0.5℃孵育30分钟，用洗液洗板4～5次，并用吸水纸拍干洗液；
19.7)显色：在步骤6)的酶标板的全部孔中，均加入tmb显色液，100μl/孔，置于湿盒中，于37
±
0.5℃或室温避光显色5～10分钟；
20.8)终止：在步骤7)的酶标板的全部孔中，均加入终止液，50μl/孔，混匀，终止反应；
21.9)od值测定：用步骤8)的酶标板的空白孔调零，以450nm为测量波长、630nm为校正波长，上酶标仪测定od值；
22.10)结果判定及计算：
23.101)阳性对照平均od值p-阴性对照平均od值n≥0.4，检测成立；
24.102)计算cutoff值：cutoff值＝阴性对照平均od值
×
2.1；当阴性对照平均od值小于0.05则按0.05计算；
25.103)定性检测结果判定：当待检血清样品的实测od值≥cutoff值，判断为阳性；当待检血清样品的实测od值＜cutoff值，判断为阴性；
26.11)通过enab中和抗体定量检测参比品，定量计算获得的待检血清样品的enab效价：
27.111)定量检测结果判定：计算每个稀释度实测的od值的对数值，以对数值作为计算值，其中：
28.a)待检血清样品的阳性孔≥3孔时，按以下公式计算待检血清样品的中和抗体效价：或者采用4参数法计算待检血清样品的中和抗体效价：
[0029][0030]
式中：
[0031]
i＝lg2＝0.301；
[0032]
v＝0.2
×
(t1 t2 t3 t4 t
5-s
1-s
2-s
3-s
4-s5)；
[0033]
w＝0.1
×
(t
5-t1 s
5-s1) 0.05
×
(t
4-t2 s
4-s2)；
[0034]
d＝t5对应稀释度/s5对应稀释度，其中：
[0035]
t1～t5为待检血清样品最高阳性孔往前的五个不同稀释度实测的od值的对数值；
[0036]
s1～s5为enab中和抗体定量检测参比品最高阳性孔往前的五个不同稀释度实测的od值的对数值；
[0037]
b)待检血清样品的阳性孔＜3孔时，按以下四参数法公式计算待检血清样品的中和抗体效价：y＝(a-d)/(1 (x/c)b) d
[0038]
式中：a：曲线上渐近线估值，b：曲线斜率，c：曲线拐点，d：曲线下渐近线估值，x：待检样品含量，y：待测样品检测od值；
[0039]
此效价与sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体效价高度相关，据此判定待检血清样品中的中和抗体水平。
[0040]
所述待检血清样品是被sars-cov-2感染的血清样品或者接种sars-cov-2疫苗免
疫后的血清样品。
[0041]
所述enab中和抗体定量检测参比品的制备如下：
[0042]
a)将采集到的接种了sars-cov-2灭活疫苗免疫后的人血清，分别进行sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体检测及elisa抗体检测，取该两种检测结果均呈阳性的血清进行合并、分装，得待标定的enab参比品；
[0043]
b)将步骤a)的待标定的enab参比品进行下列标定赋值：
[0044]
b1)在p3实验室内，将待标定的enab参比品于56℃灭活30分钟，自1∶4开始进行12个稀释度的稀释，按50μl/孔的量，将已稀释好的12个稀释度的参比品分别加入到微孔板对应的样品孔中，每个稀释度加1孔(单孔)，共12个样品孔；或者每个稀释度加2孔(双复孔)，共24个样品孔，在12个或者24个样品孔中分别加入sars-cov-2指示病毒液，50μl/孔；
[0045]
b2)在微孔板上另设：细胞对照至少2孔，每孔加稀释液100μl；阴性血清对照1:4至少2孔，每孔加稀释液50μl；病毒对照至少2孔，每孔加稀释液50μl；在每个阴性血清对照孔和病毒对照孔中分别加入sars-cov-2指示病毒液，50μl/孔；
[0046]
b3)将b1)、b2)步骤的微孔板放于37
±
0.5℃培养箱内中和2小时；
[0047]
b4)在b3)步骤的微孔板的每个孔内，加入vero细胞悬液100μl/孔，然后将微孔板放于37
±
0.5℃、5％co2培养箱内培养5～7天，得待标定的enab中和抗体定量检测参比品；
[0048]
b5)病毒回滴滴度计算，以sars-cov-2指示病毒液作为原倍病毒液，进行10倍系列稀释，获得10-1
、10-2
、10-3
稀释度的sars-cov-2指示病毒液；取原倍、10-1
、10-2
、10-3
四个稀释度的sars-cov-2指示病毒液，按每个稀释度4～8孔、100μl/孔的量，加入到b4)步骤的微孔板中对应的空样品孔内，将该微孔板于37
±
0.5℃、5％co2培养箱中培养7天，通过karber法计算sars-cov-2指示病毒回滴滴度；
[0049]
b6)结果观察
[0050]
b61)试验成立需满足下列条件：
[0051]
步骤b2)的细胞对照维持良好的单层，细胞状况良好，不产生cpe；
[0052]
步骤b2)的阴性血清对照应为阴性，不产生cpe；
[0053]
步骤b2)的病毒对照应为阳性，产生cpe；
[0054]
步骤b5)的指示病毒回滴滴度结果应符合要求；
[0055]
b62)中和抗体效价计算：
[0056]
若某一稀释度检测双复孔中的一孔病变、另一孔未病变，则将该稀释度作为参比品的中和抗体效价；
[0057]
若某一稀释度检测孔未病变，高于该稀释度的检测孔均病变，则将该未病变的稀释度与下一个病变的稀释度相加后除以2，作为该参比品的中和抗体效价；
[0058]
b7)enab中和抗体定量检测参比品的elisa抗体效价标定：
[0059]
b71)将sars-cov-2 s抗体检测试剂、b4)步骤的待标定的enab中和抗体定量检测参比品取出，置室温平衡30-60分钟；
[0060]
b72)取出步骤b71)待标定的enab中和抗体定量检测参比品，先用样品稀释液进行1∶100预稀释，然后按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据参比品标化值而定，取终点稀释度往前的8个稀释度的参比品进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量，加入到酶标板的样品孔中，各加1孔，共8孔；
[0061]
将酶标板的其余样品孔设置为：阳性对照2～3孔，加入sars-cov-2 igg抗体阳性对照样品，100μl/孔；阴性对照2～3孔，加入sars-cov-2 igg抗体阴性对照样品,100μl/孔；稀释液对照1～2孔，加入稀释液,100μl/孔；另设空白孔1孔；
[0062]
b73)将步骤b72)的酶标板置于湿盒内，于37℃
±
0.5℃孵育1小时，用洗液洗板4～5次，并在吸水纸上拍干洗液；
[0063]
b74)在步骤b73)的酶标板上，除空白孔外的所有孔中均加入sars-cov-2 s抗体检测用酶，100μl/孔，置于湿盒中37℃
±
0.5℃孵育30分钟，用洗液洗板4～5次，并在吸水纸上拍干洗液；
[0064]
b75)在步骤b74)的全部孔中加入tmb显色液，100μl/孔，置于湿盒中，于37℃或者室温下，避光显色5～10分钟；
[0065]
b76)在步骤b75)的全部孔中加入终止液50μl/孔，混匀，终止反应；
[0066]
b77)用空白孔调零，以450nm为测量波长、630nm为校正波长，上酶标仪测定od值；
[0067]
b78)结果判定
[0068]
根据步骤b77)的检测结果计算cutoff值，得待标定的enab中和抗体定量检测参比品的elisa抗体效价。
[0069]
所述抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测试剂中检测用酶标板通过以下方法制备：按50～200μl/孔的量，将sars-cov-2 s蛋白包被于96孔的聚苯乙烯微孔检测板上，经过常规封闭、洗板后，制备成抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶标板。
[0070]
本发明依据免疫应答抗体产生的基本原理，利用酶联免疫elisa(enzyme-linked immunosorbent assay)技术、结合活病毒细胞内中和抗体检测技术，首先制备出：活病毒细胞中和抗体效价定量检测参比品，再通过活病毒细胞内中和抗体检测和elisa-igg抗体检测，对所述参比品赋值，之后通过统计计算，将待检血清样品的酶标检测结果转化为与活病毒细胞内中和抗体检测结果高度关联的enab中和抗体，也即：本发明方法检测的中和抗体效价能够与活病毒细胞内中和抗体效价高度相关。为了与“活病毒中和抗体效价”相区分，将本发明的中和抗体命名为：enab(elisato neutralizing antibody)。
[0071]
本发明检测体系的基本原理如下：
[0072]
病毒感染人体后或者人体接种了疫苗免疫后，人的机体会产生相应的多克隆抗体(总抗体)，这些抗体按结合功能分为以下二类：一类是只有结合作用的抗体，此类抗体没有中和特性，被称为非中和抗体，只在流行病学调查方面有指导作用；另一类是具有中和作用的抗体，即中和抗体，此中和抗体除在体外对相应抗原的结合有特性外，更为重要的是可以在体内结合病毒后阻断病毒的感染，因此，中和抗体是疫苗免疫后血清学评价最为重要、最受关注的指标之一。从机体免疫应答的机理分析，病毒感染后或者接种疫苗免疫后，人的机体内所产生的中和抗体及非中和抗体的数量多少、比例如何，主要是病原体或疫苗本身，两者的比例总体上是一个相对稳定的正相关状态。因此，可通过检测到的总抗体水平来推断其中和抗体的水平。
[0073]
目前使用的新型冠状病毒疫苗，除灭活疫苗外，其余的mrna疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗的免疫蛋白，均为s蛋白，其产生的抗体能够与新型冠状病毒sars-cov-2的rbd结合，从而阻断新型冠状病毒sars-cov-2的rbd与血管紧张素转化酶2(ace-2)受体的结合，进而阻断型冠状病毒sars-cov-2进入细胞，即：能够预防新型冠状病毒sars-cov-2感
染。
[0074]
因此对于新型冠状病毒sars-cov-2抗体的检测，虽有针对核蛋白(n)和针对刺突蛋白(s)这二种结构蛋白的抗体检测，但只有针对刺突蛋白s的抗体检测，才能与中和抗体效价有关联，并且由于检测系统的差异，各类抗体检测结果关联度存在较大差异，尤其是如何将需要在p3生物实验室中操作检测的金标准(中和抗体结果)与在普通实验室中的检测结果关联起来，并有较高的一致性，则是本发明所要解决的技术难题。
[0075]
在聚苯乙烯微孔板上包被重组的待检血清样品中的sara cov-2 s蛋白(因s蛋白可以捕获待检血清样品中的抗sara-cov-2 s蛋白igg抗体)后，再与相应的辣根过氧化物酶(hrp)标记的人igg抗体(以下称为酶结合物)结合，之后洗弃未结合的酶结合物，加入tmb显色液后，通过显色反应，可以判定待检血清样品中是否含有抗sara-cov-2 s蛋白的igg抗体，即：当显色时，判定为阳性，表明待检血清样品中含有抗sara-cov-2 s蛋白的igg抗体，且颜色的深浅与抗sara-cov-2 s蛋白的igg抗体含量呈正相关；当不显色时，判定为阴性，表明待检血清样品中不含抗sara-cov-2 s蛋白的igg抗体；如此完成抗sara-cov-2 s蛋白的igg抗体的定性检测。
[0076]
除上述定性检测外，还能进行半定量检测，即：将待检血清样品进行2倍系列稀释后，进行抗体效价的半定量检测，检测od值用cutoff值进行下列判定：当样品阳性终点稀释度为最高稀释度时，该最高稀释度即为样品的抗体效价，如：1∶1600稀释度为阳性的最高稀释度，则抗sara-cov-2 s蛋白igg抗体效价为1∶1600。
[0077]
在检测待检血清样品的同时，带入定量检测参比品enab进行同步检测，根据两者检测到的od值，通过相应的计算公式计算后，即可完成待检血清样品的定量检测。
[0078]
本发明通过酶联免疫技术及enab中和抗体定量检测参比品的联合使用，进行非细胞培养的中和抗体(enab)效价检测，其优势在于enab中和抗体定量检测参比品与活病毒细胞内中和抗体结果有高度关联性，并且在常规实验室内就能完成大规模检测，具有极高的推广应用价值。
[0079]
本发明具有下列优点和效果：采用上述技术方案，尤其是利用本发明制备及标化的enab参比品，通过抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测试剂(elisa检测法)，对包括灭活疫苗、基因工程疫苗在内的sars-cov2疫苗免疫后的血清进行检测，通过计算，可以将elisa抗体效价转化为酶标中和抗体enab效价，此酶标中和抗体enab效价与金标准的真病毒中和抗体效价有高度的关联性，据此可对疫苗的免疫效果进行评价，本发明只需在普通实验室就能进行批量操作，无需在认证的p3实验室进行活病毒操作，非常适合高致病性及高传染性的流行病病原体的疫苗效果评价。
具体实施方式
[0080]
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
[0081]
本发明检测体系是常规的，包含：
[0082]
1、抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测试剂，该试剂包含：
[0083]
1.1抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶标板；
[0084]
1.2抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶；
[0085]
1.3 tmb显色液；
[0086]
1.4终止液；
[0087]
1.5洗液；
[0088]
1.6样品稀释液；
[0089]
1.7抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体阳性对照；
[0090]
1.8抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体阴性对照。
[0091]
2、enab中和抗体定量检测参比品。
[0092]
实施例1
[0093]
(该实施例1是制备enab中和抗体定量检测参比品的实例，需要在相关步骤给出相关数据，或者在本实施例的最后给出数据列表)
[0094]
enab中和抗体定量检测参比品的制备如下：
[0095]
a)将采集到的接种了sars-cov-2灭活疫苗免疫后的人血清，分别按常规进行sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体检测及elisa抗体检测，该两种检测结果均呈阳性，故将该两种呈阳性的血清进行合并、分装，得待标定的enab参比品；
[0096]
b)将a)步骤的待标定的enab参比品进行下列标定、赋值：
[0097]
b1)在p3实验室内，将待标定的enab参比品于56℃灭活30分钟，自1:4开始进行12个稀释度的稀释，按50μl/孔的量，将已稀释好的12个稀释度的参比品分别加入到微孔板对应的样品孔中，每个稀释度加2孔，共24个样品孔；在24个样品孔中分别加入sars-cov-2指示病毒液，50μl/孔；
[0098]
b2)在b1)步骤的微孔板上另设：细胞对照2孔，每孔加稀释液100μl；阴性血清对照2孔，每孔加稀释液50μl；病毒对照2孔，每孔加稀释液50μl，在每个阴性血清对照孔和病毒对照孔中分别加入sars-cov-2指示病毒液，50μl/孔；
[0099]
b3)将b2)步骤的微孔板放于37
±
0.5℃培养箱内中和2小时；
[0100]
b4)在b3)步骤的微孔板的每个孔内，加入vero细胞悬液100μl/孔，然后将微孔板放于37
±
0.5℃、5％co2培养箱内培养5天，得待标定的enab中和抗体定量检测参比品；
[0101]
b5)病毒回滴滴度计算，以sars-cov-2指示病毒液作为原倍病毒液，进行10倍系列稀释，获得10-1
、10-2
、10-3
稀释度的sars-cov-2指示病毒液；取原倍、10-1
、10-2
、10-3
四个稀释度的sars-cov-2指示病毒液，按每个稀释度4～8孔、100μl/孔的量，加入到b4)步骤的微孔板中对应的空样品孔内，将该微孔板于37
±
0.5℃、5％co2培养箱中培养7天，通过karber法计算sars-cov-2指示病毒回滴滴度；
[0102]
b6)结果观察
[0103]
b61)试验成立需满足下列条件：
[0104]
步骤b2)的细胞对照维持良好的单层，细胞状况良好，不产生cpe；
[0105]
步骤b2)的阴性血清对照为阴性，不产生cpe；
[0106]
步骤b2)的病毒对照为阳性，产生cpe；
[0107]
步骤b5)的sars-cov-2指示病毒回滴滴度结果符合要求；
[0108]
b62)中和抗体效价计算：
[0109]
若某一稀释度检测双复孔中的一孔病变、另一孔未病变，则将该稀释度作为样品的中和抗体效价；
[0110]
若某一稀释度检测孔未病变，高于该稀释度的检测孔均病变，则将该未病变的稀
释度与下一个病变的稀释度相加后除以2，作为该样品的中和抗体效价；
[0111]
b7)sars-cov-2 enab中和抗体定量检测参比品的elisa抗体效价标定：
[0112]
b71)将sars-cov-2 s抗体检测试剂、步骤b4)的待标定的enab中和抗体定量检测参比品取出，置室温平衡40分钟；
[0113]
b72)取出步骤b71)待标定的enab中和抗体定量检测参比品，先用样品稀释液进行1：100预稀释，再按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据参考品预估标化值而定，取终点稀释度往前的8个稀释度的参比品进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量加入到酶标板的样品孔中，各加1孔，共8孔；
[0114]
将酶标板的其余样品孔设置为：阳性对照2孔，加入抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体阳性对照，100μl/孔；阴性对照2孔，加入抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体阴性对照,100μl/孔；稀释液对照1孔，加入稀释液,100μl/孔；另设空白孔1孔；
[0115]
b73)将步骤b72)的酶标板置于湿盒内，于37℃孵育1小时，用洗液洗板4次，并在吸水纸上拍干洗液；
[0116]
b74)在步骤b73)的酶标板上，除空白孔外的所有孔中均加入抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶，100μl/孔，置于湿盒中37℃孵育30分钟，用洗液洗板4次，并在吸水纸上拍干洗液；
[0117]
b75)在步骤b74)的全部孔中加入tmb显色液，100μl/孔，置于湿盒中，于37℃避光显色5分钟；
[0118]
b76)在步骤b75)的全部孔中加入终止液50μl/孔，混匀，终止反应；
[0119]
b77)用空白孔调零，以450nm为测量波长、630nm为校正波长，上酶标仪测定od值；
[0120]
b78)结果判定
[0121]
根据步骤b77)的检测结果计算cutoff值，得待标定的enab中和抗体定量检测参比品的elisa抗体效价为1:6400，enab中和抗体效价为65.3，结果见表1
[0122]
表1 sara-cov-2 enab中和抗体定量检测参比品标定结果
[0123][0124]
enab参比品标定值elisa-抗体效价1:6400；enab中和抗体效价65.3，用于enab中和抗体含量计算。
[0125]
实施例2
[0126]
本例对1#～10#共10份接种了sars-cov-2灭活疫苗免疫后的人血清样品进行enab中和抗体检测，显然单个样品检测只需要检测单份样品即可，具体如下：
[0127]
一种sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，包括下列步骤：
[0128]
1)将sars-cov-2 s抗体检测试剂、实施例1的enab中和抗体定量检测参比品、以及待检10份血清取出，置室温平衡30-60分钟；
[0129]
2)将步骤1)的10份待检血清样品进行1:100倍的预稀释，之后再做1:200、1:400、1:800......系列稀释；将步骤1)的enab中和抗体定量检测参比品进行同步、同法稀释；
[0130]
3)加样至酶标板
[0131]
31)取步骤2)的3#、4#、5#、6#、8#、9#、10#样品的1:400～1:5120，1#样品的1:6400～1:819200，2#样品的1:100～12800，7#样品的1:1600～1:204800，每个样品均取8个稀释度的稀释液，共80个，按100μl/孔的量，分别加入到sars-cov-2 s抗体检测用酶标板对应的80个样品孔中，详见表2布板图1-10列；
[0132]
32)将步骤2)的enab中和抗体定量检测参比品，取1:400、1:800、1:1600......1:5120，共8个稀释度的稀释液，每个稀释度按100μl/孔的量加入到步骤31)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板对应的8个样品孔中，详见表2布板图中11列；
[0133]
33)在步骤31)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板上：设抗体阳性对照2个孔，每孔加入sars-cov-2 s抗体阳性对照，100μl/孔；设抗体阴性对照2个孔，每孔加入sars-cov-2 s抗体阴性对照,100μl/孔；设稀释液对照1个孔，加入稀释液100μl/孔；设空白对照1个孔，不加任何样品，详见表2布板图中12列；
[0134]
4)将步骤3)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板置于湿盒中，于37
±
0.5℃孵育1小时，用洗液洗板4次，并用吸水纸拍干洗液；
[0135]
5)在步骤4)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板的样品孔中，除空白孔不加，在其余的所有样品孔中均加入sars-cov-2 s抗体检测用酶，100μl/孔；
[0136]
6)将步骤5)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板置于湿盒中，于37
±
0.5℃孵育30分钟，用洗液洗板4次，并用吸水纸拍干洗液；
[0137]
7)在步骤6)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板的全部孔中均加入tmb显色液，100μl/孔，置于湿盒中，于37
±
0.5℃避光显色8分钟；
[0138]
8)在步骤7)的sars-cov-2 s抗体检测用酶标板的全部孔中均加入终止液，50μl/孔，混匀，终止反应；
[0139]
9)用步骤8)的酶标板的空白孔调零，以450nm为测量波长、630nm为校正波长，上酶标仪测定od值；结果见表3；
[0140]
表2 10个样品elisa检测布板图
[0141][0142]
表3 10个样品elisa检测od值
[0143] 123456789101112a3.6380.6361.4863.9061.6832.243.2053.3241.1723.6283.4961.398b2.0230.2520.6872.4730.7241.0361.4281.6050.4681.6111.8431.367c0.8090.1160.2721.0220.30.4480.5890.6680.2150.7980.7270.049d0.3530.0540.1240.4350.1460.2050.2630.3060.1060.3930.3110.047e0.1640.0240.0580.2060.0680.0970.130.1370.050.1550.1390.002f0.0810.0120.0280.0930.0350.0490.0610.0670.0240.0710.0690.003g0.0420.0070.0140.0490.0180.0230.0290.0340.0120.0390.0340.000h0.0210.0030.0070.0220.0090.0120.0150.0190.0060.0190.0190.000
[0144]
10)结果判定及计算：
[0145]
101)阳性对照平均值p＝(1.398 1.367)
÷
2＝1.382；
[0146]
102)阴性对照平均值n＝(0.049 0.047)
÷
2＝0.048；
[0147]
因阴性对照平均值《0.05按0.05计，则阳性对照平均od值p—阴性对照平均od值n≥0.4，本次试验成立；
[0148]
103)定性检测结果判定：cutoff＝0.05
×
2.1＝0.105，实测的od≥0.105的判定为阳性、《0.105的判定为阴性，结果见表3；
[0149]
11)通过enab中和抗体定量检测参比品，定量计算获得的待检血清样品的enab效价：
[0150]
111)将实施例1的enab中和抗体定量检测参比品、以及步骤10)的10份待检血清样品，分别取稀释度1—5的5个检测值，计算每个稀释度实测od值的对数值(lg od值)，以对数作为计算值，待检血清样品的阳性孔≥3孔时，按以下公式计算待检血清样品抗体效价：
[0151][0152]
上述公式中：
[0153]
i＝lg2＝0.301
[0154]
v＝0.2
×
(t1 t2 t3 t4 t
5-s
1-s
2-s
3-s
4-s5)
[0155]
w＝0.1
×
(t
5-t1 s
5-s1) 0.05
×
(t
4-t2 s
4-s2)
[0156]
d＝t5对应稀释度/s5对应稀释度，其中：
[0157]
t1～t5为待检血清样品e～a孔实测的od值的对数值；
[0158]
s1～s5为enab中和抗体定量检测参比品e～a孔实测的od值的对数值；
[0159]
同时对10个样品按常规用金标准“活病毒细胞内中和抗体检测法”进行检测，活病毒细胞内中和抗体检测值、enab中和抗体及elisa效价检测结果见表3，结果显示：enab中和抗体检测值与活病毒细胞内中和抗体检测值多数非常接近，相关性较高，见表4：
[0160]
表4.10份sars-coy-2疫苗免后血清样品酶标抗体效价、enab中和抗体检测值及活病毒细胞内中和抗体检测值比较
[0161][0162]
[0163]
据此判定本实施例2的待检血清样品的中和抗体与sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体具有较好的一致性，证明本发明方法行之有效。
[0164]
此外，本发明对3774份sars-cov-2疫苗免后血清进行了活病毒细胞内中和抗体检测与elisa抗体检测结果进行比较，检测步骤与实施列1.2相同，结果见表5、6。
[0165]
从3774份sars-cov-2疫苗免后血清样品检测结果表明：
[0166]
sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体与elisa抗体有较好的一致性；sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体效价与elisa-igg抗体效价有较高的相关性。
[0167][0168][0169][0170]
再者，本发明对100份sars-cov-2疫苗免后血清，应用enab参比品同时检测活病毒细胞内中和抗体效价(nab)和elisa-igg抗体效价(enab)，并对两种抗体检测结果相关性进行了统计评估，发现当nab≥4、enab≥6为抗体阳性判定标准时，两者一致性为91.00％，灵敏度为91.53％，特异度为90.24％，enab效价与nab效价相关系数为0.83,高度关联，见表7，表8：
[0171]
[0172][0173]
本发明提供的sars-cov-2 enab中和抗体定量检测参比品的用途延伸：将enab中和抗体定量检测参比品用sars-cov-2变异株活病毒进行中和抗体效价检测、标化，并给予该参比品不同变异株中和抗体效价赋值，即可用该检测体系对疫苗免疫后血清对变异株的中和抗体效价进行测定，从而对疫苗针对变异株的保护水平进行评价。
[0174]
应用本发明实施例1的方法重新制备新的enab中和抗体定量检测参比品，并将其定义为enab参比品2，以对目前流行的主要变异株进行活病毒细胞内中和抗体效价检测，这样即可大致推断早期流行株的抗体及疫苗免疫后血清对变异株的中和效力，从而评估早期流行株制备的疫苗对变异株的保护率，相比原流行株，变异株的中和抗体效价明显降低，这对分析现在的疫苗免疫后的抗体及抗体水平对于流行株的保护效果，具有显著的社会意义和流行病学意义。结果见表9：
[0175]
表9.sars-cov-2 enab参比品2对不同病毒株的活病毒中和抗体效价检测结果
[0176][0177]
sars-cov-2 enab参比品中和抗体与活病毒细胞内中和抗体检测结果比较及方法学优势，见表10：
[0178]
表10 sars-cov-2 enab中和抗体检测结果与活病毒中和抗体检测结果比较
[0179][0180][0181]
由于活病毒中和抗体的结果判断是在显微镜下根据细胞病变的情况进行判定，需要操作人员有较高的工作经验，并且不同人员判定会有少许出入，细胞生长状况也对检测结果有较大影响。
[0182]
而本发明采用elisa检测值计算enab中和抗体的含量，改善了人工判定结果的偏差，使检测结果更加精准，检测灵敏度更高，同时本发明还能快速对变异株的enab进行检测，及时确认目前疫苗免疫后的抗体对变异株的中和保护效果，为疫情控制提供参考数据。