一种SARS-Cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法

技术特征：
1.一种sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，其特征在于包括下列步骤：1)室温平衡，将sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测试剂、enab中和抗体定量检测参比品及待检血清样品取出，置于室温平衡30-60分钟；2)预稀释，将待检血清样品、enab中和抗体定量检测参比品进行1∶100倍的预稀释，得预稀释液；3)加样至酶标板31)将步骤2)的待检血清样品的预稀释液进行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据样品预估值而定；取预估值终点往前的8个稀释度进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量加入到酶标板对应的样品孔中，各加1孔，共8孔；32)将步骤2)的enab中和抗体定量检测参比品的预稀释液进行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据参比品标化值而定，取标化值终点往前的8个稀释度进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量加入酶标板的样品孔中，各加1孔，共8孔；33)在酶标板上：设抗体阴性对照及抗体阳性对照各2-3孔，100μl/孔，设稀释液对照1孔，加入稀释液100μl/孔，另设空白孔1孔；4)孵育，将步骤3)的加样酶标板置于湿盒中，于37
±
0.5℃孵育0.5-2小时，用洗液洗板4～5次，并用吸水纸拍干洗液；5)加酶，在步骤4)的酶标板样品孔中，除空白孔外的所有样品孔中均加入抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶，100μl/孔；6)孵育，将步骤5)的酶标板置于湿盒中，于37
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0.5℃孵育30分钟，用洗液洗板4～5次，并用吸水纸拍干洗液；7)显色：在步骤6)的酶标板的全部孔中，均加入tmb显色液，100μl/孔，置于湿盒中，于37
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0.5℃或室温避光显色5～10分钟；8)终止：在步骤7)的酶标板的全部孔中，均加入终止液，50μl/孔，混匀，终止反应；9)od值测定：用步骤8)的酶标板的空白孔调零，以450nm为测量波长、630nm为校正波长，上酶标仪测定od值；10)结果判定及计算：101)阳性对照平均od值p—阴性对照平均od值n≥0.4，检测成立；102)计算cutoff值：cutoff值＝阴性对照平均od值
×
2.1；当阴性对照平均od值小于0.05则按0.05计算；103)定性检测结果判定：当待检血清样品的实测od值≥cutoff值，判断为阳性；当待检血清样品的实测od值<cutoff值，判断为阴性；11)通过enab中和抗体定量检测参比品，定量计算获得的待检血清样品的enab效价：111)定量检测结果判定：计算每个稀释度实测的od值的对数值，以对数值作为计算值，其中：a)待检血清样品的阳性孔≥3孔时，按以下公式计算待检血清样品的中和抗体效价：或者采用4参数法计算待检血清样品的中和抗体效价：
式中：i＝lg2＝0.301；v＝0.2
×
(t1 t2 t3 t4 t
5-s
1-s
2-s
3-s
4-s5)；w＝0.1
×
(t
5-t1 s
5-s1) 0.05
×
(t
4-t2 s
4-s2)；d＝t5对应稀释度/s5对应稀释度，其中：t1～t5为待检血清样品最高阳性孔往前的五个不同稀释度实测的od值的对数值；s1～s5为enab中和抗体定量检测参比品最高阳性孔往前的五个不同稀释度实测的od值的对数值；b)待检血清样品的阳性孔<3孔时，按以下四参数法公式计算待检血清样品的中和抗体效价：y＝(a-d)/(1 (x/c)
b
) d式中：a：曲线上渐近线估值，b：曲线斜率，c：曲线拐点，d：曲线下渐近线估值，x：待检样品含量，y：待测样品检测od值；此效价与sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体效价高度相关，据此判定待检血清样品中的中和抗体水平。2.如权利要求1所述的sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，其特征在于所述待检血清样品是被sars-cov-2感染的血清样品或者接种sars-cov-2疫苗免疫后的血清样品。3.如权利要求1所述的sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，其特征在于所述enab中和抗体定量检测参比品的制备如下：a)将采集到的接种了sars-cov-2灭活疫苗免疫后的人血清，分别进行sars-cov-2活病毒细胞内中和抗体检测及elisa抗体检测，取该两种检测结果均呈阳性的血清进行合并、分装，得待标定的enab参比品；b)将步骤a)的待标定的enab参比品进行下列标定赋值：b1)在p3实验室内，将待标定的enab参比品于56℃灭活30分钟，自1:4开始进行12个稀释度的稀释，按50μl/孔的量，将已稀释好的12个稀释度的参比品分别加入到微孔板对应的样品孔中，每个稀释度加1孔(单孔)，共12个样品孔；或者每个稀释度加2孔(双复孔)，共24个样品孔，在12个或者24个样品孔中分别加入sars-cov-2指示病毒液，50μl/孔；b2)在微孔板上另设：细胞对照至少2孔，每孔加稀释液100μl；阴性血清对照1:4至少2孔，每孔加稀释液50μl；病毒对照至少2孔，每孔加稀释液50μl；在每个阴性血清对照孔和病毒对照孔中分别加入sars-cov-2指示病毒液，50μl/孔；b3)将b1)、b2)步骤的微孔板放于37
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0.5℃培养箱内中和2小时；b4)在b3)步骤的微孔板的每个孔内，加入vero细胞悬液100μl/孔，然后将微孔板放于37
±
0.5℃、5％co2培养箱内培养5～7天，得待标定的enab中和抗体定量检测参比品；b5)病毒回滴滴度计算，以sars-cov-2指示病毒液作为原倍病毒液，进行10倍系列稀释，获得10-1
、10-2
、10-3
稀释度的sars-cov-2指示病毒液；取原倍、10-1
、10-2
、10-3
四个稀释度的sars-cov-2指示病毒液，按每个稀释度4～8孔、100μl/孔的量，加入到b4)步骤的微孔板中对应的空样品孔内，将该微孔板于37
±
0.5℃、5％co2培养箱中培养7天，通过karber法计算sars-cov-2指示病毒回滴滴度；b6)结果观察
b61)试验成立需满足下列条件：步骤b2)的细胞对照维持良好的单层，细胞状况良好，不产生cpe；步骤b2)的阴性血清对照应为阴性，不产生cpe；步骤b2)的病毒对照应为阳性，产生cpe；步骤b5)的指示病毒回滴滴度结果应符合要求；b62)中和抗体效价计算：若某一稀释度检测双复孔中的一孔病变、另一孔未病变，则将该稀释度作为参比品的中和抗体效价；若某一稀释度检测孔未病变，高于该稀释度的检测孔均病变，则将该未病变的稀释度与下一个病变的稀释度相加后除以2，作为该参比品的中和抗体效价；b7)enab中和抗体定量检测参比品的elisa抗体效价标定：b71)将sars-cov-2 s抗体检测试剂、b4)步骤的待标定的enab中和抗体定量检测参比品取出，置室温平衡30-60分钟；b72)取出步骤b71)待标定的enab中和抗体定量检测参比品，先用样品稀释液进行1∶100预稀释，然后按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600........系列稀释，稀释终点根据参比品标化值而定，取终点稀释度往前的8个稀释度的参比品进行加样，每个稀释度按100μl/孔的量，加入到酶标板的样品孔中，各加1孔，共8孔；将酶标板的其余样品孔设置为：阳性对照2～3孔，加入sars-cov-2 igg抗体阳性对照样品，100μl/孔；阴性对照2～3孔，加入sars-cov-2 igg抗体阴性对照样品,100μl/孔；稀释液对照1～2孔，加入稀释液,100μl/孔；另设空白孔1孔；b73)将步骤b72)的酶标板置于湿盒内，于37℃
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0.5℃孵育1小时，用洗液洗板4～5次，并在吸水纸上拍干洗液；b74)在步骤b73)的酶标板上，除空白孔外的所有孔中均加入sars-cov-2 s抗体检测用酶，100μl/孔，置于湿盒中37℃
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0.5℃孵育30分钟，用洗液洗板4～5次，并在吸水纸上拍干洗液；b75)在步骤b74)的全部孔中加入tmb显色液，100μl/孔，置于湿盒中，于37℃或者室温下，避光显色5～10分钟；b76)在步骤b75)的全部孔中加入终止液50μl/孔，混匀，终止反应；b77)用空白孔调零，以450nm为测量波长、630nm为校正波长，上酶标仪测定od值；b78)结果判定根据步骤b77)的检测结果计算cutoff值，得待标定的enab中和抗体定量检测参比品的elisa抗体效价。4.如权利要求1所述的sars-cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，其特征在于所述抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体(sars-cov-2 s抗体)检测试剂中检测用酶标板通过以下方法制备：按50～200μl/孔的量，将sars-cov-2 s蛋白包被于96孔的聚苯乙烯微孔检测板上，经过常规封闭、洗板后，制备成抗sars-cov-2 s蛋白igg抗体检测用酶标板。

技术总结
本发明提供一种SARS-Cov-2非细胞培养中和抗体效价定量检测方法，包括将SARS-Cov-2 S蛋白IgG抗体检测试剂、ENAb中和抗体定量检测参比品及待检血清样品进行室温平衡、预稀释、加样至酶标板、孵育、加酶、再孵育、显色、终止、OD值测定、结果判定及计算，获得待检血清样品的ENAb效价，此ENAb效价与真病毒中和抗体效价有高度的关联性，从而可以据此对疫苗的免疫效果进行评价，本发明只需在普通实验室就可进行批量操作，无需在认证的P3实验室进行活病毒操作，非常适合高致病性及高传染性的流行病病原体的疫苗效果评价。体的疫苗效果评价。


技术研发人员：谢忠平 龙润乡 谢天宏 岳磊 杨婷 李华 王杰 向虹
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/5/25