一种花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因AhNRT2.7的克隆及应用的制作方法

一种花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的克隆及应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，它涉及一种花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的克隆及应用。


背景技术：

2.花生(arachis hypogaea l.)是重要的油料作物和经济作物。氮素作为重要的生命元素，与花生生长发育和产量密切相关。花生属于豆科植物，除了根瘤菌固氮外，根系吸收土壤中的氮素也是氮素利用的一种重要方式，占需氮量的50％～60％。农业生产中，合理施用氮肥不仅可以提高花生产量和品质，而且能够更有效地发挥根瘤的固氮作用。然而，目前投入的氮肥仅约30％可以被吸收并转化为农业生产力，过量施用氮肥不仅导致了花生固氮能力下降，同时还造成了一系列的环境污染问题，如土壤酸化和板结、水体污染等。因此，选育氮素利用率(nitrogen use efficiency，nue)高的低氮耐受型花生新品种，在稳产增产的前提下减少氮肥施用量，减轻环境污染，有助于实现花生节氮、高效目标，有利于发展绿色生态农业。
3.氮素利用率是一个涉及遗传因素和环境因素的复杂性状，主要受到氮吸收、同化和再利用率三个因素的影响。通常，提高氮素利用率主要从综合配套使用氮肥、培育氮素利用效率高的品种以及合理密植等方式来实现。随着氮素利用相关分子机制研究的逐渐深入，发现影响nue的主要瓶颈是作物本身，即不同作物品种之间的总吸氮量、不同时期的氮的吸收以及氮转化和同化有明显的差异。花生中氮素的吸收、转运和储存主要由硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter，nrt)来完成。其中，高亲和硝酸盐转运蛋白基因(nrt2)可在植物响应低氮胁迫时被激活并发挥主导作用。因此，nrt2家族基因适合作为筛选低氮耐受型花生新品种的目标基因。通过遗传改良选育低氮耐受型作物新品种，从根本上提高作物氮素利用效率，充分发挥土壤自身的供氮能力，能够有效减少氮肥施用量和降低环境污染程度。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7，其基因序列为seq id 1。
5.进一步地，所述花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的cdna序列为seq id 2。
6.进一步地，所述花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7编码的蛋白序列为seq id 3。
7.本发明的第二个目的在于提供一种筛选花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的方法，所述方法通过全基因组关联分析(gwas)和遗传图谱定位连锁分析(qtl mapping)联合分析以及与已验证功能的同源序列比对的方式实现。
8.进一步地，所述筛选花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的方法可应用于花
qtl联合分析以及与验证功能的同源序列对比的反向遗传学方式，有效发掘出与花生重要产量性状相关的新基因。本发明的方法目的性更加明确，所需要筛选的基因更具有指向性，并且不需要大量的筛选突变体的重复工作，提高了花生重要功能基因挖掘的效率与准确性。
24.gwas-qtl联合分析法筛选候选基因作用的物种并无限制，不仅仅限于花生，其他作物如小麦、水稻、大豆、玉米等均可用该方法进行功能基因的筛选，具有广泛的适用性。该方法所涉及的基因组测序范围较小，成本较低，特别适用于对物种基因组上的功能基因进行广泛性的定位。
25.实施例二、花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的扩增
26.根据参考基因组序列设计特异引物，特异引物序列为：
27.ahnrt2.7-f：5
’‑
cgcggatccatgcaacctgagcattac-3’；
28.ahnrt2.7-r：5
’‑
cggggtaccttattccaaaagactgtaattttc-3’。
29.扩增该花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因的pcr扩增体系为：ddh2o 30.5μl，含mg
2
的5
×
hf buffer 10μl；浓度为2.5mm的dntp 2μl；浓度均为5μm的ahnrt2.7-f和ahnrt2.7-r各2μl；dmso 0.6μl；phusion酶1μl；cdna模板2μl。扩增该花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的pcr反应条件为：98℃预变性50s；98℃变性10s，59℃退火10s，72℃1min，32个循环；72℃后延伸7min。
30.如图1所示，(a)为ahnrt2.7基因结构图；(b)为蛋白跨膜区预测；(c)为亚细胞定位。花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7的基因序列为seq id 1，其cdna序列为seq id 2，其编码的蛋白序列为seq id 3。
31.实施例三、构建过表达载体及异源表达植株
32.3.1花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7表达模式分析
33.图2是花生正常氮(normal n)和低氮胁迫(low n：1/20的正常供氮浓度)条件下培养后(a)植株根、茎、叶比较；(b)ahnrt2.7基因不同时期各个组织的表达模式分析对比；(c)地下、地下部干重；(d)叶绿素含量比较；(e)根长，根面积以及根体积比较。
34.如图2a所示，与正常氮浓度培养相比，低氮条件下的花生表现出叶色较浅、根发白、变短等差异。取不同时期花生植株测定地上、地下部干重以及叶绿素含量，图2c表明以上参数低氮条件下数值较小且随时间增速较缓；图2d表明根长、根面积以及根体积对比结果与上述趋势一致。以上结果说明氮元素对花生植株的生长影响显著。
35.取花生不同生长时期的正常氮和低氮胁迫条件下的叶、根、茎、花、果针等，分别提取其rna并反转录合成cdna，设计特异引物进行实时定量qrt-pcr检测，分析ahnrt2.7基因在花生的不同组织器官、发育时期的表达情况，结果如图2b所示，在低氮胁迫下其在花生茎和叶中表达量较高。
36.3.2构建过表达载体及异源表达植株
37.根据ahnrt2.7基因的完整cdna序列确认扩增产物经过测序正确后，通过双酶切连入过表达载体sn1301，构建过表达载体ahnrt2.7-psn1301，载体图谱见图6。将花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7连接到改造过的过表达载体sn1301上，使用农杆菌介导转化野生型拟南芥，经过连续三代鉴定和潮霉素培养基筛选，获得花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因ahnrt2.7异源表达拟南芥株系。图3是异源表达ahnrt2.7对拟南芥生长情况的影响(a)
低氮胁迫下拟南芥萌发情况比对；(b)不同氮含量条件下拟南芥生长情况比对；(c)不同株系拟南芥中叶绿素含量比对(wt为野生型拟南芥；1、2、6为异源表达拟南芥株系)。
38.在缺氮(1/20)平板上分别种植异源表达拟南芥株系以及野生型拟南芥，垂直培养一周，如图3a所示，野生型拟南芥根伸长明显受到抑制，而三个异源表达的拟南芥株系根伸长量明显高于野生型，说明异源表达拟南芥可以对低氮胁迫耐受。
39.以蛭石为培养基种植异源表达拟南芥和野生型拟南芥，并分别使用正常氮含量和1/20氮含量的培养液培养4周，结果如图3b所示，异源表达株系的生长情况明显优于野生型。如图3c所示，低氮条件下野生型拟南芥叶绿素含量出现显著性降低，而异源表达拟南芥的叶绿素含量差异不显著。以上结果说明异源表达拟南芥能够耐受低氮胁迫，基因ahnrt2.7与叶绿素在植株内的合成正相关。
40.将在相同生长条件下培养的异源表达拟南芥与野生型拟南芥中的氮、钾、磷等元素积累量以及谷氨酰胺合成酶(gs)、谷氨酸合成酶(gogat)、硝酸还原酶(nr)、谷氨酸脱氢酶(gdh)的活性进行测定。结果见图4和图5，发现异源表达ahnrt2.7拟南芥中硝酸还原酶(nr)活性、氮元素积累量与野生型拟南芥相比均有显著升高。该结果说明ahnrt2.7参与了植物体内的氮代谢过程，可提高氮元素在植株内的转化率，进而可减少氮肥施用量，实现绿色可持续农业。
41.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。