莠去津半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用

1.本发明涉及莠去津免疫分析技术领域，尤其涉及莠去津半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用。


背景技术：

2.莠去津英文名称为atrazine，化学名称为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，别名为阿特拉津、草脱净、亚脱净，cas登记号为1912-24-9，分子式为c8h
14cl
n5，相对分子量为215.68，化学结构如下所示：
3.。
4.莠去津(atz)是使用最广泛的三嗪类除草剂之一，其杀草谱较广，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草。此外，由于具有高流动性、高持久性和低降解率，atz已成为环境资源中最常被检测到的除草剂之一。因此，需要对莠去津的残留水平进行监测。
5.目前已经建立了许多检测环境样品、食品和农产品中atz残留的方法。仪器分析方法具有足够的准确性和高度的敏感性，如液相色谱法(lc)、lc-串联质谱法(lc-ms/ms)、气相色谱法(gc)和gc-串联质谱法(gc-ms/ms)均是常用的检测方法。然而，这些仪器分析方法通常需要训练有素的人员、昂贵的仪器、复杂的样品预处理和耗时的分析过程，不适合现场atz的残留检测。免疫分析方法由于其对抗原和抗体的特异性识别作用，具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且能大幅度降低检测成本。因此，制备高灵敏度和特异性的莠去津抗体具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种莠去津半抗原、完全抗原、抗体及制备方法和应用。本发明提供的莠去津半抗原能够充分暴露莠去津结构的活性部位，经与载体蛋白偶联得到莠去津完全抗原，利用该莠去津完全抗原制备的抗莠去津抗体特异性好，灵敏度高。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了一种莠去津半抗原，具有式i所示结构：
[0009][0010]
所述r1为能够与载体蛋白偶联的连接基团。
[0011]
优选地，所述r1为活性基团或者带有连接臂基团的活性基团，所述活性基团包括羧基、氨基、羟基或酯基，所述连接臂基团包括-(ch2)
n-或-(c6h4)
m-，所述n为1～8，所述m为1～2；
[0012]
优选地，所述莠去津半抗原具有式a或式b所示结构：
[0013][0014]
本发明提供了上述技术方案所述莠去津半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
根据莠去津半抗原的结构，在莠去津上引入r1，得到莠去津半抗原；所述r1为能够与载体蛋白偶联的连接基团。
[0016]
本发明提供了一种莠去津完全抗原，由上述技术方案所述莠去津半抗原与载体蛋白偶联得到。
[0017]
优选地，所述莠去津完全抗原具有式c所示结构：
[0018][0019]
所述r2为载体蛋白基团。
[0020]
本发明提供了上述技术方案所述莠去津完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0021]
在莠去津半抗原上偶联载体蛋白，得到莠去津完全抗原。
[0022]
本发明提供了一种抗莠去津抗体，由上述技术方案所述莠去津完全抗原制备得到。
[0023]
本发明提供了上述技术方案所述抗莠去津抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0024]
将莠去津完全抗原免疫宿主动物，从所述宿主动物中分离脾细胞，在体外将所述脾细胞与sp2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌抗莠去津抗体的杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株制备抗莠去津抗体；
[0025]
或者，提取所述宿主动物的血液中b淋巴细胞转录的mrna，反转录为cdna，通过生物工程技术构建的噬菌体或酵母抗体表达库筛选得到抗莠去津抗体。
[0026]
本发明提供了一种检测莠去津的试剂或试剂盒，含有上述技术方案所述抗莠去津抗体或上述技术方案所述制备方法制备得到的抗莠去津抗体。
[0027]
本发明提供了一种检测莠去津的方法，采用上述技术方案所述抗莠去津抗体、上述技术方案所述制备方法制备得到的抗莠去津抗体、上述技术方案所述试剂或试剂盒进行检测。
[0028]
本发明提供了一种莠去津半抗原，本发明提供的莠去津半抗原能够充分暴露莠去津结构的活性部位，且溶解性以及稳定性好，经与载体蛋白偶联得到莠去津完全抗原，利用该莠去津完全抗原制备的抗莠去津抗体效价高，特异性好，灵敏度高，并且其与其它三嗪类农药交叉反应率低，可以用于制备检测莠去津的试剂或试剂盒，建立莠去津免疫学检测方法，实现莠去津的准确检测。应用例的结果显示，本发明提供的抗莠去津单克隆抗体的ic
50
为1.678ng/ml，标准曲线工作范围(ic
20
～ic
80
)在0.384～11.565ng/ml，与其它三嗪类农药交叉反应率为4.42～13.68％，为建立莠去津免疫分析方法提供了核心原材料，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0029]
图1为具有式a所示结构的莠去津半抗原(莠去津半抗原a)的hplc谱图；
[0030]
图2为莠去津半抗原a的hrms谱图；
[0031]
图3为莠去津半抗原a的1h nmr谱图；
[0032]
图4为莠去津半抗原a的
13
c nmr谱图；
[0033]
图5为卵清白蛋白(ova)标准品的maldi-tof-ms谱图；
[0034]
图6为具有式c所示结构且载体蛋白为ova的莠去津完全抗原(莠去津完全抗原c1)的madli-tof-ms谱图；
[0035]
图7为牛血清蛋白(bsa)标准品的madli-tof-ms谱图；
[0036]
图8为具有式c所示结构且载体蛋白为bsa的莠去津完全抗原(莠去津完全抗原c2)的maldi-tof-ms谱图；
[0037]
图9为抗莠去津单克隆抗体的标准曲线。
具体实施方式
[0038]
本发明提供了一种莠去津半抗原，具有式i所示结构：
[0039][0040]
所述r1为能够与载体蛋白偶联的连接基团。
[0041]
在本发明中，需要说明的是，所述r1为连接基团，本领域技术人员可以根据实际需要选择其具体结构。在本发明中，所述r1优选为活性基团或者带有连接臂基团的活性基团，所述活性基团优选为羧基、氨基、羟基或酯基，所述连接臂基团优选为-(ch2)
n-或-(c6h4)
m-，所述n优选为1～8，更优选为1～4，所述m优选为1～2。在本发明中，具体的，所述r1可以为带有连接臂基团的羧基，更优选为-(ch2)
n-cooh，进一步优选为-ch2cooh(莠去津半抗原a)。在本发明中，所述r1还可以为带有连接臂基团(如-(ch2)
n-)的酯基，所述酯基优选为羧基经活化得到的活性酯基结构，所述活性酯基结构进一步优选为羧基与n-羟基琥珀酰亚胺在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐作用下活化形成的活性酯基结构；具体的，所述r1可以为-ch2cooh与n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐在n,n-二甲基甲酰胺作用下活化形成的基团(莠去津半抗原b)，该结构可以使得莠去津半抗原更容易与载体蛋白偶联，提高偶联的成功率。在本发明中，所述莠去津半抗原a和莠去津半抗原b的结构式分别如式a和式b所示：
[0042][0043]
本发明提供了上述技术方案所述莠去津半抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0044]
根据莠去津半抗原的结构，在莠去津上引入r1，得到莠去津半抗原；所述r1为能够与载体蛋白偶联的连接基团。
[0045]
本发明对在莠去津上引入r1的方法没有特殊限定，根据r1的具体结构，采用本领域技术人员熟知的方法在莠去津上引入r1即可。本发明中所述莠去津半抗原的合成原料易获得，合成路径简单，可以更高效地制备出莠去津半抗原，为大量制备抗莠去津抗体提供基础。下面以莠去津半抗原a和莠去津半抗原b为例进行说明。
[0046]
在本发明中，所述莠去津半抗原a的制备方法，优选包括以下步骤：
[0047]
将三聚氰胺、乙胺、乙腈、水与n,n二异丙基乙基胺混合，进行第一取代反应，得到4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺；
[0048]
将所述4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺、3-氨基丁酸、乙醇与n,n二异丙基乙基胺混合，进行第二取代反应，得到莠去津半抗原a。
[0049]
本发明将三聚氰胺、乙胺、乙腈、水与n,n二异丙基乙基胺(dipea)混合，进行第一取代反应，得到4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺。在本发明中，所述三聚氰胺与乙胺的摩尔比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：1；所述乙腈与水作为溶剂，二者用量保证第一取代反应顺利进行即可，本发明对此不作特殊限定；所述dipea与三聚氰胺的摩尔比优选为(2.5～3.5)：1，更优选为3：1。在本发明中，所述三聚氰胺、乙胺、乙腈、水与dipea混合的方式优选为：将三聚氰胺溶解于乙腈中，得到三聚氰胺溶液；将乙胺与水混合，得到乙胺溶液；将所述三聚氰胺溶液冷却至-1～1℃，然后加入乙胺溶液与dipea。在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为-1～1℃，更优选为0℃；时间优选为3～5h，更优选为4h；所述第一取代反应优选在搅拌条件下进行。所述第一取代反应后，本发明优选将所得产物体系旋蒸旋干，得到粗品，将所述粗品用硅胶柱层析分离，得到4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺。在本发明中，所述硅胶柱层析分离采用的试剂优选为石油醚和乙酸乙酯，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为(4～6)：1，更优选为5：1。
[0050]
得到4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺后，本发明将所述4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺、3-氨基丁酸、乙醇与n,n二异丙基乙基胺混合，进行第二取代反应，得到莠去津半抗原a。在本发明中，所述4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺与3-氨基丁酸的摩尔比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1：1；所述乙醇作为溶剂，用量保证第二取代反应顺利进行即可，本发明对此不作特殊限定；所述dipea与4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺的摩尔比优选为(2.5～3.5)：1，更优选为3：1。在本发明中，所述4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺、3-氨基丁酸、乙醇与n,n二异丙基乙基胺混合的方式优选为：向所述4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺中依次加入乙醇、3-氨基丁酸与n,n二异丙基乙基胺。在本发明中，所述第二取代反应的温度优选为80～90℃，更优选为85℃；时间优选为2～4h，更优选为3h。所述第二取代反应后，本发明优选将所得产物体系冷却至室温(25℃)后旋干，向所得残余物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，在搅拌条件下进行洗涤，之后采用二氯甲烷萃取，所得水相用盐酸调节ph值为4，析出白色沉淀，经固液分离，将所得固体物料进行干燥，得到莠去津半抗原a，化学名称为3-(4-氯-6-(乙氨基)-1,3,5-三嗪-2-基氨酸)丁酸。在本发明中，所述盐酸的浓度优选为1mol/l。本发明对所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，具体如过滤。
[0051]
在本发明中，所述莠去津半抗原b的制备方法，优选包括以下步骤：
[0052]
将莠去津半抗原a、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)与n,n-二甲基甲酰胺(dmf)混合，进行酯化反应，得到莠去津半抗原b。
[0053]
在本发明中，所述莠去津半抗原a与nhs的摩尔比优选为1：2；所述edc与莠去津半抗原a的摩尔比优选为2：1；所述dmf作为溶剂，所述dmf与莠去津半抗原a的用量比优选为0.5ml：0.032mmol。本发明对所述莠去津半抗原a、nhs、edc与dmf混合的方式没有特殊限定，保证各组分充分混合即可。在本发明中，所述酯化反应的温度优选为4℃；所述酯化反应的时间优选为10h。所述酯化反应后，本发明优选无需将酯化反应后所得含有莠去津半抗原b的产物体系进行后处理，直接用于后续载体蛋白的偶联即可。
[0054]
在本发明中，若制备其它结构的莠去津半抗原时，经相应反应后所得含有莠去津半抗原的产物体系中存在固体物质，优选将所述含有莠去津半抗原的产物体系进行固液分离，取液体物料进行后续载体蛋白的偶联；具体的，可以将所述含有莠去津半抗原的产物体系进行离心，取上清液进行后续载体蛋白的偶联。
[0055]
本发明提供的莠去津半抗原的制备方法操作简单、工艺流程短，生产成本低，且产物纯度高。
[0056]
本发明提供了一种莠去津完全抗原，由上述技术方案所述莠去津半抗原与载体蛋白偶联得到。在本发明中，所述载体蛋白优选为卵清白蛋白、牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白，更优选为卵清白蛋白(ova)或牛血清白蛋白(bsa)。在本发明中，所述莠去津完全抗原优选具有式c所示结构：
[0057][0058]
所述r2为载体蛋白基团。
[0059]
具体的，当所述载体蛋白为ova时，所述莠去津完全抗原具有式c1所示结构(记为莠去津完全抗原c1)；当所述载体蛋白为bsa时，所述莠去津完全抗原具有式c2所示结构(记为莠去津完全抗原c2)：
[0060][0061]
本发明提供了上述技术方案所述莠去津完全抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0062]
在莠去津半抗原上偶联载体蛋白，得到莠去津完全抗原。
[0063]
本发明对在莠去津半抗原上偶联载体蛋白的具体方法没有特殊限定，根据莠去津完全抗原的具体结构，采用本领域技术人员熟知的方法在莠去津半抗原上偶联载体蛋白即可。下面以式c所示结构的莠去津完全抗原为例进行说明。
[0064]
在本发明中，具有式c所示结构的莠去津完全抗原的制备方法，优选包括以下步骤：
[0065]
将莠去津半抗原b、载体蛋白与缓冲液混合，进行偶联反应，得到具有式c所示结构的莠去津完全抗原。
[0066]
在本发明中，所述莠去津半抗原b与载体蛋白的摩尔比优选为(10～80):1，更优选为(30～60):1。在本发明中，所述缓冲液优选包括碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(pbs缓冲
液)、硼酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，更优选为pbs缓冲液；所述缓冲液作为溶剂，其用量保证偶联反应顺利进行即可，本发明对此不作特殊限定。在本发明中，所述莠去津半抗原b、载体蛋白与缓冲液混合的方式优选为：将载体蛋白与缓冲液混合，得到载体蛋白的缓冲液溶液，之后加入所述莠去津半抗原b；所述载体蛋白的缓冲液溶液的ph值优选为5～9，更优选为7.4。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为0～50℃，更优选为4～25℃；时间优选为4～36h，更优选为4～12h；所述偶联反应优选在搅拌条件下进行。所述偶联反应后，本发明优选将所得产物体系进行透析，得到具有式c所示结构的莠去津完全抗原。在本发明的实施例中，具体是以pbs缓冲液作为溶剂进行所述偶联反应，所述偶联反应后进行透析所采用的透析液优选为pbs缓冲液，所述pbs缓冲液的ph值优选为7～10，更优选为7.4；浓度优选为0.01～0.2mol/l，更优选为0.01mol/l；所述透析的次数优选为5～7次，更优选为6次；每次透析的时间优选为3～5h，更优选为4h。
[0067]
本发明提供了一种抗莠去津抗体，由上述技术方案所述莠去津完全抗原制备得到。在本发明中，所述抗莠去津抗体优选为抗莠去津的血清。
[0068]
本发明提供了上述技术方案所述抗莠去津抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0069]
将莠去津完全抗原免疫宿主动物，从所述宿主动物中分离脾细胞，在体外将所述脾细胞与sp2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌抗莠去津抗体的杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株制备抗莠去津抗体；
[0070]
或者，提取所述宿主动物的血液中b淋巴细胞转录的mrna，反转录为cdna，通过生物工程技术构建的噬菌体或酵母抗体表达库筛选得到抗莠去津抗体。
[0071]
下面分别对本发明制备抗莠去津抗体的两种方法进行说明。
[0072]
本发明将莠去津完全抗原免疫宿主动物，从所述宿主动物中分离脾细胞，在体外将所述脾细胞与sp2/0瘤细胞融合，筛选能够分泌抗莠去津抗体的杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株制备抗莠去津抗体。采用本发明提供的莠去津完全抗原免疫宿主动物所制备的抗莠去津抗体(或抗莠去津的血清)，能够与莠去津特异性结合，具有较好的免疫效果。本发明对所述宿主动物的种类没有特殊限定，本领域技术人员熟知的宿主动物均可。本发明对所述分离脾细胞、将所述脾细胞与sp2/0瘤细胞融合、筛选能够分泌抗莠去津抗体的杂交瘤细胞株以及基于所述杂交瘤细胞株制备抗莠去津抗体的具体方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。本发明优选通过采用不同的宿主动物得到不同的抗莠去津抗体，具体的，以小鼠为宿主动物，可以得到单克隆抗体；以兔子或山羊为宿主动物，可以得到多克隆抗体；以骆驼或羊驼为宿主动物，可以得到纳米抗体。在本发明的实施例中，具体是以小鼠为宿主动物，最终得到单克隆抗体。
[0073]
本发明提取所述宿主动物的血液中b淋巴细胞转录的mrna，反转录为cdna，通过生物工程技术构建的噬菌体或酵母抗体表达库筛选得到抗莠去津抗体。本发明对提取宿主动物的血液中b淋巴细胞转录的mrna、反转录为cdna以及通过生物工程技术构建的噬菌体或酵母抗体表达库进行筛选的具体方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
[0074]
本发明提供了一种检测莠去津的试剂或试剂盒，含有上述技术方案所述抗莠去津抗体或上述技术方案所述制备方法制备得到的抗莠去津抗体。
[0075]
本发明提供了一种检测莠去津的方法，采用上述技术方案所述抗莠去津抗体、上述技术方案所述制备方法制备得到的抗莠去津抗体、上述技术方案所述试剂或试剂盒进行
检测。
[0076]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0077]
实例中部分材料的来源：碳酸氢钠、乙醇以及二氯甲烷购自北京化工厂，n,n-二异丙基乙基胺(dipea)以及3-氨基丁酸购自北京偶合科技有限公司；盐酸、十二水磷酸二氢钠、氯化钠、明胶、一水合柠檬酸以及tween-20购自国药集团化学试剂有限公司；无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)购自阿拉丁；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白(bsa)以及卵清白蛋白(ova)购自sigma公司；羊抗鼠igg-hrp购自jackson公司。
[0078]
实施例1
[0079]
制备3-(4-氯-6-(乙氨基)-1,3,5-三嗪-2-基氨酸)丁酸(即莠去津半抗原a)，反应式如下所示：
[0080][0081]
将三聚氯氰(0.92g，5.0mmol)溶解在乙腈(50ml)中，得到三聚氰胺溶液；将乙胺(5.0mmol)与水混合，得到乙胺溶液(0.99ml)；将所述三聚氰胺溶液用冰水浴冷却到0℃，然后加入乙胺溶液和n,n-二异丙基乙基胺(2.65ml，15.0mmol)，在0℃、搅拌条件下反应4h；反应结束后，将所得产物体系旋蒸旋干，得到粗品，将所述粗品用硅胶柱层析分离(按体积比计，所用试剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1)，得到4,6-二氯-n-乙基-1,3,5-三嗪-2胺(记为化合物sm1)，产量为780mg，收率为81％。
[0082]
向100ml烧瓶中加入化合物sm1(935mg，5mmol)和乙醇(20ml)，然后加入3-氨基丁酸(化合物sm2，515mg，5mmol)和dipea(1.94g，15mmol)，加热至85℃反应3h，tlc监测化合物sm1反应完全；反应结束后，将所得产物体系冷却至室温(25℃)后旋干，向所得残余物中加入饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)，搅拌20min进行洗涤，之后采用二氯甲烷萃取两次(每次用量20ml)，所得水相用浓度为1m的盐酸调节ph值为4，析出白色沉淀，过滤，将所得固体物料进行干燥，得到3-(4-氯-6-(乙氨基)-1,3,5-三嗪-2-基氨酸)丁酸，精确分子量理论值为259.69，产量为850mg，收率为62.5％。
[0083]
产物经hplc(图1)、hrms(图2)、1h nmr(图3)和
13
c nmr(图4)确证，为具有式a所示结构的莠去津半抗原a；相关表征数据具体如下：
[0084]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.16(s,1h),7.86
–
7.61(m,2h),4.27(h,j＝6.8hz,1h),3.24(dt,j＝14.1,6.9hz,2h),2.60
–
2.51(m,0h),2.32(dt,j＝15.8,6.4hz,1h),1.18
–
1.02(m,6h)。
[0085]
13
c nmr(101mhz,dmso)δ172.37,167.53,165.07,164.81,164.54,43.39,43.12,40.27,40.12,39.91,39.70,39.49,39.28,39.08,38.87,35.01,34.84,20.26,20.00,19.81,14.59,14.36,14.23。
[0086]
hrms calcd for c9h
14
cln5o2:[m
h
]259.69,found 260.0946。
[0087]
实施例2
[0088]
制备莠去津半抗原b，反应式如下所示：
[0089][0090]
将实施例1制备的莠去津半抗原a(8.26mg，0.032mmol)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，7.40mg，0.064mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc，12.33mg，0.064mmol)充分溶解于无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf，0.5ml)中，在4℃冰箱中磁力搅拌反应10h；反应结束后，得到含有莠去津半抗原b的产物体系，无需后处理，可直接用于后续载体蛋白的偶联。
[0091]
实施例3
[0092]
制备莠去津完全抗原c1，反应式如下所：
[0093][0094]
将卵清白蛋白(ova，10mg，所述ova与莠去津半抗原b的摩尔比为1：40)溶于磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液，ph值为7.4，1ml)中，得到载体蛋白溶液；在搅拌条件下，将所述实施例2制备得到的含有莠去津半抗原b的产物体系以逐滴滴加至所述载体蛋白溶液中，在25℃条件下搅拌反应4h；反应结束后，将所得产物体系用pbs缓冲液(ph值为7.4，浓度为0.01mol/l)透析6次，每次透析的时间为4h，得到含有莠去津完全抗原c1的溶液；将所述含有莠去津完全抗原c1的溶液用pbs缓冲液(ph值为7.4，浓度为0.01mol/l)稀释至莠去津完全抗原c1浓度为1mg/ml，将所得稀释液进行液氮速冻，于-20℃冻存待用。
[0095]
图5为ova标准品的maldi-tof-ms谱图，结果显示ova单电荷离子峰为44586.160；图6为莠去津完全抗原c1的madli-tof-ms谱图，结果显示莠去津完全抗原c1单电荷离子峰为46144.036。载体蛋白与半抗原偶联比率＝(完全抗原分子量-载体蛋白分子量)/半抗原分子量，由此公式计算得到完全抗原c1的偶联比率为1：6.00。
[0096]
实施例4
[0097]
制备莠去津完全抗原c2，反应式如下所：
[0098][0099]
将牛血清蛋白(bsa，20mg，所述bsa与莠去津半抗原b的摩尔比为1：60)溶于pbs缓冲液(ph值为7.4，5ml)中，得到载体蛋白溶液；在搅拌条件下，将所述实施例2制备得到的含有莠去津半抗原b的产物体系逐滴滴加至所述载体蛋白溶液中，在25℃条件下搅拌反应4h；反应结束后，将所得产物体系用pbs缓冲液(ph值为7.4，浓度为0.01mol/l)透析6次，每次透析的时间为4h，得到含有莠去津完全抗原c2的溶液；将所述含有莠去津完全抗原c2的溶液用pbs缓冲液(ph值为7.4，浓度为0.01mol/l)稀释至莠去津完全抗原c2浓度为1mg/ml，将所得稀释液进行液氮速冻，于-20℃冻存待用。
[0100]
图7为bsa标准品的maldi-tof-ms谱图，结果显示bsa标准品单电荷离子峰为67308.849；图8为莠去津完全抗原c2的madli-tof-ms谱图，结果显示莠去津完全抗原c2单电荷离子峰为72079.531。载体蛋白与半抗原偶联比率＝(完全抗原分子量-载体蛋白分子量)/半抗原分子量，由此公式计算得到完全抗原c2的偶联比率为1：18.37。
[0101]
应用例
[0102]
一、利用实施例4制备的莠去津完全抗原c2抗原制备抗莠去津抗体
[0103]
(1)取6～8周龄的balb/c小鼠作为实验动物(8周龄的balb/c小鼠体重为23～25g)。
[0104]
(2)初次免疫：取实施例4中稀释好的莠去津完全抗原c2溶液(浓度为1mg/ml)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到莠去津完全抗原c2乳液；所述莠去津完全抗原c2乳液的免疫策略为注射小鼠腹腔0.05mg和背部皮下多点注射0.05mg，注射总剂量为0.1mg莠去津完全抗原c2乳液/只。
[0105]
(3)加强免疫：初次免疫2周后，取1ml实施例4中稀释好的莠去津完全抗原c2溶液(浓度为1mg/ml)，然后加入等体积弗氏不完全佐剂，充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到莠去津完全抗原c2乳液；将所述莠去津完全抗原c2乳液注射小鼠腹腔0.05mg和背部皮下多点注射0.05mg，注射总剂量为0.1mg莠去津完全抗原c2乳液/只；加强免疫每隔14天免疫一次，从第3次加强免疫开始，每次免疫3天后，从小鼠眼眶采血，测定抗体效价，包被抗原为1mg/ml莠去津完全抗原c1，稀释4个梯度，分别为500倍、1000倍、2000倍和4000倍；待效价等于或大于1：8000后(效价定义为对照孔的od值为1.0以上时，血清的稀释倍数)，摘除小鼠眼球采血，摘取小鼠脾，分离脾细胞进行细胞融合；从融合后的杂交瘤细胞株中取培养液进行检测，筛选出阳性单克隆细胞株后，对其进行大量培养，选择效价和特异性均优的单克隆细胞株进行腹水的制备，纯化出抗莠去津单克隆抗体；对莠去津单抗的效价、特异性进行检测；将融合小鼠的血液在37℃恒温培养箱静置30min后，再于4℃冰箱中静置2h，然后于离心机中4℃、10000r/min离心5min，分离出莠去津抗血清，用于下述实验。
[0106]
二、莠去津抗血清中抗体的效价检测
[0107]
下述实验中所用的各种缓冲液如下：
[0108]
(1)包被缓冲液(ph＝9.6，0.05m碳酸盐缓冲液)：称取na2co
3 1.5g和nahco
3 2.94g，超纯水定容至1000ml；
[0109]
(2)磷酸盐缓冲液(0.01m、ph＝7.4)：称取kh2po
4 0.2g、nacl 8g和nah2po4·
12h2o 2.92g，超纯水定容至1000ml；
[0110]
(3)洗涤缓冲液：在配好的磷酸盐缓冲液中加入tween-20，使tween-20的体积分数为0.1％；
[0111]
(4)样品稀释液：在配好的磷酸盐缓冲液中加入10ml的tween-20和1g明胶，微波炉加热融化，超纯水定容至1l；
[0112]
(5)底物缓冲液(ph＝5.5)：称取na2hpo4·
12h2o 9.22g、一水合柠檬酸2.55g、量取0.5ml的tween-20，超纯水定容至1l；
[0113]
(6)终止液(2m h2so4)：量取蒸馏水445.6ml，在搅拌条件下逐滴加入98％(体积/体积)浓硫酸54.4ml。
[0114]
(一)莠去津抗血清中抗体的抑制实验
[0115]
1、莠去津完全抗原c1的包被抗原溶液的配制
[0116]
将上述实施例3制备的莠去津完全抗原c1，用包被缓冲液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行梯度稀释，得到不同浓度的莠去津完全抗原c1的包被抗原溶液。
[0117]
2、莠去津标准品溶液的配制
[0118]
(1)称取10mg莠去津标样，充分溶解于10ml甲醇中，即得到1mg/ml的莠去津标准品储备液；
[0119]
(2)用样品稀释液将所述步骤(1)中1mg/ml莠去津标准品储备液配制成终浓度为1000ng/ml的莠去津标准品溶液。
[0120]
3、莠去津抗血清稀释液的配制
[0121]
将上述步骤制备的莠去津抗血清用样品稀释液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行梯度稀释，得到莠去津抗血清稀释液。
[0122]
4、抗原、抗血清的棋盘格实验
[0123]
包被：在96孔酶标板中每孔加入100μl步骤1制备得到的莠去津完全抗原c1的包被抗原溶液，37℃恒温孵育3h，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。
[0124]
竞争：对照孔中，每孔加入50μl样品稀释液；抑制孔中，每孔加入50μl步骤2制备得到的莠去津标准品溶液；将步骤3制备得到的莠去津抗血清稀释液加入酶标板中(50μl/孔)，置于37℃条件下孵育30min，用洗涤缓冲液洗板3次，甩干。
[0125]
加酶标二抗：将羊抗鼠酶标二抗(igg-hrp，jackson公司)稀释1000倍，稀释液是0.1m、ph值为9.6的样品稀释液，每孔加100μl，37℃条件下孵育30min，用洗涤缓冲液洗板3次，甩干。
[0126]
显色：显色液现用现配，每10ml底物缓冲液中加入15～20mg邻苯二胺(opd)和4μl浓度为30wt％的双氧水，每孔加入100μl所得混合溶液，常温避光显色15min。
[0127]
终止：每孔加入50μl终止液，用酶标仪492nm处测定各孔的od值。
[0128]
抑制率的计算公式：ir＝(c-i)/c
×
100％，ir表示抑制率，i表示酶标板中的抑制孔，c表示酶标板中的对照孔。第三次、第四次免疫后抗血清效价结果如表1所示。抗莠去津小鼠的单克隆抗体效价检测结果(opd显色15min，100ng/ml标样抑制)如表2所示。
[0129]
表1抗莠去津小鼠的血清效价检测
[0130][0131]
[0132][0133]
注：表1中i表示酶标板中的抑制孔，c表示酶标板中的对照孔，ir表示抑制率，k表示1000倍。
[0134]
表1结果表明，第四次免疫后，当包被抗原稀释16000倍和抗体的稀释度为32000倍时抗血清抑制率最好，为81.46％。说明上述实施例4制备的莠去津完全抗原c2可以作为免疫原制备出抗莠去津抗体。
[0135]
表2抗莠去津小鼠的单克隆抗体效价检测结果
[0136][0137][0138]
注：表2中i表示酶标板中的抑制孔，c表示酶标板中的对照孔，ir表示抑制率，k表示1000倍。
[0139]
表2结果表明，上述实施例4制备的莠去津完全抗原c2可以作为免疫原制备出抗莠
去津单克隆抗体。当包被抗原稀释度为1：16000，血清稀释度为1：64000时，od值在1.0以上，抑制率为91.65％，此时的抑制效果较好，选择此最优抗原和抗体稀释倍数组合，用于抗莠去津单克隆抗体标准曲线的建立。
[0140]
(二)抗莠去津单克隆抗体标准曲线的建立
[0141]
将莠去津标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml。
[0142]
(1)抗原的包被：将实施例3制备的莠去津完全抗原c1用样品稀释液按1：64000稀释后加入到酶标板中，每孔100μl，置于湿盒中37℃恒温培养箱包被3h；倒去酶标板中的溶液，用洗涤缓冲液洗板3次，甩干；
[0143]
(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的莠去津标准品溶液(抑制孔)，每孔50μl，对照孔中不添加莠去津标准品溶液而加入50μl样品稀释液；
[0144]
(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1：64000的莠去津抗体稀释液，每孔50μl，37℃温育30min；倒去酶标板中的溶液，用洗涤缓冲液洗板3次，甩干；
[0145]
(4)在实验孔和对照孔中分别加入100μl稀释倍数为1：1000的igg-hrp二抗，37℃温育30min；倒去酶标板中的溶液，用洗涤缓冲液洗板3次，甩干；
[0146]
(5)向实验孔和对照孔中分别加入100μl配制好的底物缓冲液，室温反应15min后，再向每孔中加入50μl浓度为1m的盐酸终止反应；
[0147]
(6)在492nm下测定吸光值；
[0148]
(7)绘制标准曲线：以莠去津标准品溶液的不同浓度(ng/ml)作为x轴，以吸光度值的比值(b/b0×
100％，其中，b为莠去津标准品溶液的平均吸光度值，b0为对照孔的平均吸光度值)作为y轴，绘制标准曲线。实验设3次重复，取3次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图9所示。
[0149]
结果表明，其灵敏度(以抑制中浓度ic
50
表示，抑制率达到50％的标样浓度值)为1.678ng/ml，检测范围(ic
20
～ic
80
)是0.384～11.565ng/ml。说明上述实施例4制备的莠去津完全抗原c2作为抗原免疫小鼠得到的抗体具有很好的检测效果，检测限低。
[0150]
(三)抗体特异性检测
[0151]
三嗪类农药标准品的配制，参照莠去津标准品溶液的配制方法，配制扑草净、特丁通、西草净、特丁津、西玛津的标准样品溶液，用样品稀释液将上述5种类似物分别稀释成如下浓度：100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml，1.5625ng/ml。
[0152]
建立标准曲线，测定抑制中浓度ic
50
，标准曲线的建立方法与上述莠去津标准曲线的建立方法相同。
[0153]
交叉反应率(％)＝(莠去津ic
50
)/(其它三嗪类农药ic
50
)
×
100％。
[0154]
实验设3次重复，取3次实验结果的平均值，结果如表3所示。
[0155]
表3由莠去津完全抗原c2制备的单克隆抗体的特异性检测结果
[0156][0157][0158]
表3结果表示，上述由莠去津完全抗原c2制备得到的单克隆抗体与三嗪类农药的交叉反应率较低，说明用莠去津完全抗原c2制备的抗体对莠去津有很好的特异性。
[0159]
本发明提供的莠去津半抗原溶解性以及稳定性好，能够满足载体蛋白偶联要求；利用所述莠去津半抗原与载体蛋白偶联即得到莠去津完全抗原，利用所述莠去津完全抗原免疫宿主动物后，能够刺激机体产生特异性和高灵敏度的抗莠去津抗体，所述抗莠去津抗体的ic
50
为1.678ng/ml，标准曲线工作范围(ic
20
～ic
80
)为0.384～11.565ng/ml；并且所述抗莠去津抗体与其它三嗪类农药交叉反应率低，为建立莠去津免疫学检测方法提供了技术基础，具有广阔应用前景。
[0160]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。