一种重组地中海富盐菌及其在制备PHBV中的应用

mediterranei)df50-δeps。
11.所述cas3基因的序列为序列表中seq id no.3。
12.上述方法中，所述柠檬酸合酶基因可为hfx_0432基因和/或hfx_6170基因，所述hfx_0432基因的序列如seq id no.5所示，所述hfx_6170基因的序列如seq id no.6所示。
13.上述方法中，所述crrna可靶向所述柠檬酸合酶基因的编码区或启动子区。
14.上述方法中，所述表达盒可由启动子、repeat序列、spacer序列和终止子序列连接得到；所述repeat序列为序列表中seq id no.4中的第55-84位，所述spacer序列靶向所述柠檬酸合酶基因的编码区或启动子区。
15.所述spacer序列可为序列表中seq id no.4中的第85-119位和/或第150-184位。
16.上述方法中，所述启动子可为序列表中seq id no.4的第1-54位所示的启动子p
phar
；所述终止子可为序列表中seq id no.4的第215-222位所示的t8终止子。
17.上述方法中，所述表达盒可为序列表中seq id no.4所示的dna片段。
18.所述表达盒可通过含有所述表达盒的重组载体导入所述出发地中海富盐菌中。
19.所述重组载体可为pwl502-crcs，所述pwl502-crcs为将pwl502的bamh i和kpn i识别序列间的dna片段替换为所述表达盒得到的重组载体。
20.本发明还提供了另一种构建重组地中海富盐菌的方法，所述方法包括抑制出发地中海富盐菌中所述柠檬酸合酶基因的表达，或降低所述出发地中海富盐菌中柠檬酸合酶的含量或活性，得到重组地中海富盐菌。
21.在本发明的一个实施例中，所述出发地中海富盐菌为地中海富盐菌(haloferax mediterranei)df50-δeps。
22.利用所述构建重组地中海富盐菌的方法得到的重组地中海富盐菌，也属于本发明的保护范围。
23.本发明还提供了一种生产phbv的方法，所述方法包括：在含有葡萄糖或淀粉的培养基中培养所述重组地中海富盐菌，获得phbv。
24.上述方法中，所述培养基可为mg培养基。
25.所述mg培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述mg培养基中的浓度为nacl 110g/l、mgso4·
7h2o 29.52g/l、mgcl2·
6h2o 20.51g/l、kcl 5g/l、nh4cl 2g/l、cacl
2 1g/l、kh2po
4 37.5mg/l、feso4·
7h2o 5mg/l、mncl2·
4h2o0.036mg/l、哌嗪-1,4-二乙磺酸(pipes)15g/l、葡萄糖(glucose)10g/l，ph7.0-7.2。
26.上述方法中，所述培养可在37℃下进行。
27.本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂由所述cas3敲除菌与所述表达盒组成，或由所述cas3敲除菌与所述重组载体组成。
28.所述成套试剂可用于构建用于制备phbv的重组菌，可以用于制备phbv。
29.所述构建重组地中海富盐菌的方法或所述重组地中海富盐菌在制备phbv中的应用，也属于本发明的保护范围。
30.实验证明，利用本发明的构建重组地中海富盐菌的方法所得重组地中海富盐菌具有更高的生物量和更快的葡萄糖消耗速率，在培养120h时就耗完了所有的葡萄糖，比对照菌株提前了72h耗完残糖，缩短了发酵周期。相比对照菌株，本发明所得重组地中海富盐菌的细胞干重和phbv积累量均有明显的提升，其细胞干重由对照菌的3.63g/l提高到了
5.66g/l，phbv产量由1.78g/l增加到了3.14g/l，phbv产量相比对照菌提高了76.4％。本发明的方法与所得重组地中海富盐菌具有很好的应用前景。
附图说明
31.图1为地中海富盐菌df50δepsδcas3-crcs中hfx_0432和hfx_6170被同时抑制后，hfx_0432的转录水平变化情况。no crrna表示df50δepsδcas3-no crrna，crcs表示df50δepsδcas3-crcs。
32.图2为地中海富盐菌df50δepsδcas3-crcs中hfx_0432和hfx_6170被同时抑制后，hfx_6170的转录水平变化情况。no crrna表示df50δepsδcas3-no crrna，crcs表示df50δepsδcas3-crcs。
33.图3为柠檬酸合酶基因抑制菌株的生长情况。no crrna表示df50δepsδcas3-no crrna，crcs表示df50δepsδcas3-crcs。
34.图4为柠檬酸合酶基因抑制菌株的葡萄糖消耗情况。no crrna表示df50δepsδcas3-no crrna，crcs表示df50δepsδcas3-crcs。
具体实施方式
35.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
37.地中海富盐菌(haloferax mediterranei)df50-δeps是一株敲除了胞外多糖合成基因簇的尿嘧啶营养缺陷型的高产phbv地中海富盐菌，记载于“zhao d,cai l,wu j,et al.improving polyhydroxyalkanoate production by knocking out the genes involved in exopolysaccharide biosynthesis in haloferax mediterranei[j].applied microbiology and biotechnology,2013,97:3027-3036.”一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0038]
下文中质粒转化地中海富盐菌的步骤如下：
[0039]
①
将地中海富盐菌单菌落接于含有尿嘧啶的as-168培养基(即向as-168培养基中添加尿嘧啶，尿嘧啶在该培养基中的浓度为50mg/l)中，培养至稳定期，然后以1：50的比例转接至新鲜培养基中，37℃培养约24h后用于转化；
[0040]
②
取1ml菌液至灭菌的1.5ml离心管中，6,000rpm，离心3min；
[0041]
③
弃尽上清，加入200μl的bss-ls溶液，用移液枪轻轻吹吸悬浮菌体，6,000rpm，离心3min；
[0042]
④
弃尽上清，加入100μl的bss-ls glycerol溶液，用移液枪轻轻吹匀；
[0043]
⑤
加10μl 0.5m edta溶液(ph 8.0)至离心管壁上，用手轻轻拍打离心管壁，使edta溶液与菌液混合，室温放置10min以形成原生质体；
[0044]
⑥
吸取10μl待转化的质粒加至管壁，轻拍离心管，使其与菌液混合，室温放置5min；
[0045]
⑦
加入120μl 60％(体积百分比)peg 600(溶剂为ubss-ls溶液，溶质为peg600)至管壁，迅速上下颠倒离心管，使溶液变的均一透亮，室温静置25min；
[0046]
⑧
加入1ml复苏培养基，上下颠倒混匀，6,000rpm，离心3min，弃上清，加入600μl复苏培养基，于37℃，200rpm摇床复苏24h；
[0047]
⑨
菌液加至as-168sy培养基平板上，晃动平板使菌液均匀地吸附其上，将平板正置于37℃恒温培养箱，待板上的菌液变干后，放入密封的塑料袋中，42℃倒置培养，4天左右可看到淡粉色的转化子。
[0048]
bss-ls溶液：
[0049][0050][0051]
115℃高压灭菌30min，然后再加入5ml灭菌的1m tris-hcl(ph 8.2)，分装备用。
[0052]
bss-ls glycerol溶液：
[0053][0054]
115℃高压灭菌30min，然后再加入5ml灭菌的1m tris-hcl(ph 8.2)，分装备用。
[0055]
ubss-ls溶液：
[0056][0057]
用naoh调节ph值至7.2，115℃高压灭菌30min，分装备用。
[0058]
复苏培养基：
[0059][0060]
用tris碱或naoh调节ph至7.5，115℃高压灭菌30min。
[0061]
30％人工盐水：
[0062][0063]
先溶解除cacl2外的试剂，然后再缓慢加入cacl2溶液。
[0064]
0.5m edta溶液(ph 8.0)：将edta溶解于水中，使edta的浓度为0.5m，用naoh调节ph至8.0。
[0065]
as-168sy培养基的配方如下：
[0066][0067]
用naoh调ph至7.0-7.2。
[0068]
as-168培养基的配方如下：
[0069][0070]
用naoh调ph至7.0-7.2。
[0071]
其中，casamino acids为美国bd公司(becton,dickinson and company)产品，货号为7241547；二水合柠檬酸三钠为国药集团化学试剂有限公司产品，货号为10019418；l-谷氨酸钠为国药集团化学试剂有限公司产品，货号为62010638；yeast extract为oxoid产品，货号为2831838-02；peptone(soya)为北京双旋微生物培养基制品厂产品，货号为cm：02-19。
[0072]
mg培养基配方如下：
[0073][0074][0075]
用naoh调ph至7.0-7.2，115℃高压灭菌30min。
[0076]
其中，pipes为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品，货号为bp248-250g。
[0077]
实施例1、
[0078]
1.敲除cas3基因
[0079]
以高产phbv的地中海富盐菌(haloferax mediterranei)df50-δeps为出发菌株，
对地中海富盐菌df50-δeps中的cas3基因进行敲除构建地中海富盐菌df50δepsδcas3。方法如下：
[0080]
(1)以地中海富盐菌df50-δeps基因组dna为模板，用引物cas3-u-f/cas3-u-r和cas3-d-f/cas3-d-r分别pcr扩增cas3基因上、下游同源臂，然后以所扩增的含有上、下游同源臂的pcr产物为模板，用引物cas3-u-f和cas3-d-r进行overlap pcr，产物回收后用bamh i和kpn i进行酶切，回收大片段，将所得大片段与利用bamh i和kpn i对载体phfx(liu h,han j,liu x,et al.development of pyrf-based gene knockout systems for genome-wide manipulation of the archaea haloferax mediterranei and haloarcula hispanica[j].journal of genetics and genomics,2011,38:261-269.)进行双酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为phfx-cas3。
[0081]
所用引物序列如下：
[0082]
cas3-u-f：5
′-
ataggatccgctcgttgacccggcgta-3
′
，下划线表示bamh i的识别序列；
[0083]
cas3-u-r：5
′
加粗部分为上游同源臂中的部分序列，方框部分为下游同源臂中的部分序列；
[0084]
cas3-d-f：5
′
加粗部分为下游同源臂中的部分序列，方框部分为上游同源臂中的部分序列；
[0085]
cas3-u-r与cas3-d-f反向互补；
[0086]
cas3-d-r：5
′-
ataggtacccagtcaattctacgtctt-3
′
，下划线表示kpn i的识别序列。
[0087]
利用cas3-u-f与cas3-u-r扩增得到的pcr产物含有序列表中seq id no.1所示的上游同源臂，利用cas3-d-f与cas3-d-r扩增得到的pcr产物含有序列表中seq id no.2所示的下游同源臂。
[0088]
(2)将(1)所得到的phfx-cas3导入大肠杆菌e.coli jm110(擎科生物公司产品，货号为tsc08)中进行去甲基化，提取重组载体phfx-cas3再导入地中海富盐菌(haloferax mediterranei)df50-δeps中，得到重组菌；将所得重组菌在as-168sy培养基平板上培养4天左右，长出的转化子，在as-168sy培养基平板上划线，培养2天左右，通过对长出的单克隆的基因组dna进行pcr扩增鉴定发生单交换的菌株(上游或下游同源臂发生了第一次同源重组的菌株)。
[0089]
所用引物为cas3-u-f与cas3-d-r。
[0090]
能扩增到大小为3419bp和828bp两条带的为单交换菌株，否则为未交换的菌株。
[0091]
(3)将单交换菌株接种至as-168 fu液体培养基(该培养基为向as-168培养基中添加尿嘧啶和5-氟乳清酸得到的尿嘧啶浓度为50mg/l、5-氟乳清酸浓度为250mg/l的培养基)中，37℃，200rpm培养2-3天，将所得培养液用as-168培养基稀释105倍后，涂200μl至as-168 fu培养基平板上于37℃下继续培养。
[0092]
(4)长出单菌落后，划线as-168 fu培养基平板，培养2天左右，通过对长出的单克隆的基因组dna进行pcr扩增鉴定是否为双交换菌株。
[0093]
所用引物为cas3-u-f与cas3-d-r。
[0094]
能扩增到大小为828bp单一条带的为双交换菌株，扩增到大小为3419bp单一条带
的为野生型菌株。所得双交换菌株即为敲除cas3基因的地中海富盐菌df50-δeps，记为地中海富盐菌df50δepsδcas3。地中海富盐菌df50-δeps中cas3基因的序列为序列表中seq id no.3。
[0095]
2.构建靶向柠檬酸合酶候选基因的crrna表达质粒pwl502-crcs
[0096]
人工合成mini-crispr结构，序列如下(5
’-3’
)：
[0097][0097]
(序列表中seq id no.4)。
[0098]
该mini-crispr结构可转录两条分别靶向柠檬酸合酶基因hfx_0432(其序列为序列表中seq id no.5)和hfx_6170(其序列为序列表中seq id no.6)启动子区的crrna。上述序列中，下划线部分为强组成型启动子p
phar
序列，加粗部分为repeat序列，方框为靶向hfx_0432的spacer序列，双下划线为靶向hfx_6170的spacer序列，阴影部分为t8终止子序列。
[0099]
用引物crrna-f与crrna-r对合成的mini-crispr结构进行扩增，而后利用bamh i和kpn i对得到的pcr产物进行双酶切，将得到的大片段与pwl502质粒(cai s,cai l,liu h,et al.identification of the haloarchaeal phasin(phap)that functions in polyhydroxyalkanoate accumulation and granule formation in haloferax mediterranei[j].applied and environmental microbiology,2012,78:1946-1952.)经bamh i和kpn i双酶切得到的载体骨架相连，得到crrna表达质粒，将序列正确的重组质粒记为pwl502-crcs。
[0100]
pwl502-crcs为将pwl502的bamh i和kpn i识别序列间的dna片段替换为上述mini-crispr结构得到的重组质粒。
[0101]
所用引物序列如下：
[0102]
crrna-f：5
′-
acaacaaccccccatggatccaatggtgtcgaagggaac-3
′
；
[0103]
crrna-r：5
′-
cgcacacaagaaaacggtaccaaaaaaaagcttcaaccc-3
′
。
[0104]
3.转化pwl502-crcs质粒到地中海富盐菌中
[0105]
将所得crrna表达质粒pwl502-crcs导入至e.coli jm110中进行去甲基化，而后提取crrna表达质粒再导入至地中海富盐菌df50δepsδcas3中，得到重组菌，将含有pwl502-crcs的重组菌记为地中海富盐菌df50δepsδcas3-crcs。
[0106]
将pwl502经e.coli jm110去甲基化后导入到地中海富盐菌df50δepsδcas3中作为空载体对照菌株，获得的菌株记为df50δepsδcas3-no crrna。
[0107]
4.rt-qpcr检测地中海富盐菌df50δepsδcas3-crcs柠檬酸合酶基因表达
[0108]
将步骤3所得地中海富盐菌df50δepsδcas3-crcs在mg培养基中培养72h后提取rna，转录为cdna，进行real time pcr检测两个柠檬酸合酶基因hfx_0432和hfx_6170的表达情况，以7s rrna为内参，并利用df50δepsδcas3-no crrna作为对照。
[0109]
所用引物为0432-rt-f/0432-rt-r和6170-rt-f/6170-rt-r，分别用以检测hfx_0432和hfx_6170的mrna水平。引物序列如下：
[0110]
0432-rt-f：5
′-
atgcggatgctcaaggatgt-3
′
；
[0111]
0432-rt-r：5
′-
agacccttctcctcgctgat-3
′
；
[0112]
6170-rt-f：5
′-
ccgactcccaaccgatagag-3
′
；
[0113]
6170-rt-r：5
′-
agtacgcggctacaatcgtc-3
′
。
[0114]
rt-qpcr结果显示，hfx_0432和hfx_6170的转录均受到了明显的抑制。其中，hfx_0432的转录水平被抑制到原来的7％(见图1)，hfx_6170的转录水平被抑制到原来的21％(见图2)。
[0115]
5.利用crispri抑制柠檬酸合酶基因可以提高地中海富盐菌的phbv产量
[0116]
待测菌株为：步骤3所得地中海富盐菌df50δepsδcas3-crcs和df50δepsδcas3-no crrna。
[0117]
采用50ml mg培养基在250ml摇瓶里培养等量(初始od值为0.1)的待测菌株至葡萄糖耗尽，培养条件为37℃，200rpm摇床培养，培养总时间为192h。培养结束后检测待测菌株的生长情况、葡萄糖消耗情况和phbv积累情况。
[0118]
生长情况检测：每隔24h取样，在600nm波长下检测菌液的吸光度。
[0119]
葡萄糖消耗情况检测：每隔24h取样，12,000rpm，3min离心收集上清，吸取50μl上清，加950μl蒸馏水稀释，取25μl用测糖仪(sba-40d，china)检测，测得的葡萄糖浓度乘以稀释倍数(20倍)即为培养基中的葡萄糖浓度。标液为1g/l的葡萄糖溶液。
[0120]
phbv积累情况检测：取培养120h的菌液进行phbv检测，具体方法如下：
[0121]
(1)配制酯化液：在甲醇和浓硫酸(体积比97:3)混合液中溶解1g/l的苯甲酸(内标)，即得到酯化液；
[0122]
(2)离心收集20-50ml菌液，冷冻干燥后称重并记录准确数值，取50mg左右干菌体于酯化管中；
[0123]
(3)步骤(2)完成后，向酯化管中加入2ml酯化液和2ml三氯甲烷，100℃酯化4h；
[0124]
(4)步骤(3)完成后，自然冷却，加入1ml蒸馏水振荡混匀，静置分层；
[0125]
(5)步骤(4)完成后，取下层氯仿相进行气相色谱分析，以苯甲酸(国药集团化学试剂有限公司产品，货号为30018617)为内标。使用agilent gc6820气相色谱仪，进样量1μl，设定柱温为200℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱长30m，柱头压力为0.25mpa。程序升温条件为：80℃维持1.5min后，以30℃/min的速度升温至140℃，再以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5min。
[0126]
发酵结果显示，相比对照菌株df50δepsδcas3-no crrna，抑制柠檬酸合酶基因的菌株df50δepsδcas3-crcs具有更高的生物量和更快的葡萄糖消耗速率(见图3和图4)，在培养120h时就耗完了所有的葡萄糖，比对照菌株df50δepsδcas3-no crrna提前了72h耗完残糖，缩短了发酵周期。
[0127]
此外，相比对照菌株df50δepsδcas3-no crrna，在发酵结束时df50δepsδcas3-crcs的细胞干重和phbv积累量均有显著的提升(见表1)，其细胞干重由对照菌株df50δepsδcas3-no crrna的3.63g/l提高到了5.66g/l，phbv产量由1.78g/l增加到了3.14g/l，phbv产量相比对照菌提高了76.4％。相比对照菌株df50δepsδcas3-no crrna，在发酵结束时df50δepsδcas3-crcs合成的phbv的3hv单体比例发生了改变，由10.57mol％变成了6.07％，表明本发明的方法在合成单体比例不同的phbv上具有一定的应用潜力。
[0128]
表1.柠檬酸合酶候选基因抑制菌株的phbv积累情况
[0129][0130]acdw,cell dry weight，细胞干重。
[0131]
phbv content(％)即phbv含量(％)，表示phbv的质量占细胞干重的百分比。
[0132]
3hv fraction(mol％)即3hv单体比例，表示phbv中3hv单体所占的摩尔百分比。
[0133]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。