一种博落回小檗碱桥酶基因优化序列及其应用的制作方法

1.本发明属于基因工程与生物工程技术领域，具体涉及一种密码子优化的博落回小檗碱桥酶基因及其应用。


背景技术：

2.酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是单细胞真核生物，拥有蛋白质修饰加工功能及同源重组机制，与其他真核生物相比，酵母拥有更清晰简单的遗传学背景，同时由于其易操作性与安全性，是基础研究中的模式生物。在合成生物学中，酵母常作为表达天然产物的微生物体系。
3.在蛋白翻译的过程中，trna是一种重要分子，能特异性地直接将三联密码子和相应的氨基酸联系起来。因此，trna与密码子在核糖体内的相互作用，对蛋白翻译过程的速率和精确度等方面有重要影响。在64个密码子中，合成蛋白质的20种标准氨基酸通过61个密码子编码翻译而成，除了甲硫氨酸(met)和色氨酸(trp)外，其它氨基酸都有2-6个同义密码子，即编码同种氨基酸的不同密码子。几乎在所有物种中都发现有密码子偏好性存在：编码基因(coding sequence，cds)对密码子的选择是非随机的，同义密码子的使用频率不同，并且在不同基因组中的择倾向性也不同。
4.密码子优化是影响蛋白质翻译和功能的重要因素。根据表达宿主的密码子偏好优化目的基因，往往能显著提高表达量。1982年，bennetzem等在酿酒酵母中分析高表达基因的密码子使用偏好,并和酿酒酵母的其它基因比较，发现这些基因对密码子选择有一定的相似性，找到了酿酒酵母所偏好的22个密码子。为酿酒酵母中异源基因的密码子优化提供了理论基础。1996年酿酒酵母基因组全序列测序工作完成，基因组信息为酵母密码子偏好的研究提供了更多依据。
5.crispr/cas体系最早是在大肠杆菌中发现的，是细菌针对噬菌体等外源dna的获得性免疫系统，该系统主要依赖于crrna与cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的pam结构，进而对入侵噬菌体或质粒进行特异性切割。crispr系统主要有三种类型,其中ii型体系仅需要一个cas9蛋白、crrna与tracrrna就能行使其功能。有研究表明将crrna与tracrrna整合成sgrna并不影响crispr/cas9体系的作用。dicarlo等人在2013年首次在酿酒酵母中使用了crispr-cas9系统，他们将人工设计的sgrna质粒与供体dna转入酿酒酵母中，实现了精氨酸通透酶基因的编辑，同时表明crispr-cas9系统对酿酒酵母无明显毒性。从此crispr-cas9系统在酿酒酵母的应用逐渐广泛。
6.mcbbe基因是博落回小檗碱桥酶基因的简称，小檗碱桥酶参与催化网状番荔枝碱((s)-reticuline)转化成金黄紫堇碱((s)-scoulerine)，是血根碱合成途径中的关键酶。目前已经利用酿酒酵母体系对mcbbe进行了功能验证，但是已获得的mcbbe在酿酒酵母中的催化效率极低。因此亟需提高mcbbe在酿酒酵母中的催化效率，提高金黄紫堇碱的产量。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中的问题，本发明提供一种密码子优化的博落回小檗碱桥酶基因及其应用。
8.为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
9.本发明第一发面提供一种博落回小檗碱桥酶基因优化序列，所述博落回小檗碱桥酶基因优化序列包括：mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4、mcbbe5，其中：mcbbe1的核苷酸序列如seq id no.1所示，mcbbe2的核苷酸序列如seq id no.2所示，mcbbe3核苷酸序列如seq id no.3所示，mcbbe4核苷酸序列如seq id no.4所示，mcbbe5核苷酸序列如seq id no.5所示。
10.本发明第二方面提供一种重组表达载体，含有如权利要求1所述的记为mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4或mcbbe5的基因优化序列。
11.进一步地，
12.所述表达载体为pyes2-ura。
13.进一步地，
14.包含mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4和mcbbe5的优化后基因序列的重组表达载体分别为pyes2-n1、pyes2-n2、pyes2-n3、pyes2-n4和pyes2-n5。
15.本发明第三方面提供一种基因工程宿主菌，其含有上述的重组表达载体。
16.进一步地，
17.所述宿主菌为酿酒酵母菌。
18.本发明第四方面提供上述博落回小檗碱桥酶基因优化序列、上述重组表达载体或上述基因工程宿主菌在制备金黄紫堇碱中的应用。
19.本发明第五方面提供一种博落回小檗碱桥酶基因优化序列制备高产金黄紫堇碱的酿酒酵母工程菌的方法，包括以下步骤：
20.(1)将优化后基因序列mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4和mcbbe5分别连接到表达载体上，经过转化后得到pcr鉴定正确的重组载体分别命名为：pyes2-n1、pyes2-n2、pyes2-n3、pyes2-n4、pyes2-n5；
21.(2)将步骤(1)中得到的重组载体分别转化至酿酒酵母菌中进行表达，筛选阳性克隆，鉴定正确的菌株分别命名为：yh01、yh02、yh03、yh04、yh05；
22.(3)将步骤(2)中得到的菌株分别通过摇瓶发酵和前体饲喂后，收集菌液后进行金黄紫堇碱提取及产量测定，得到能生成金黄紫堇碱的酿酒酵母菌株；
23.(4)找出步骤(3)中得到的菌株对应的优化后基因，并利用crispr-cas9技术将其整合进酿酒酵母基因组，鉴定正确后得到高产金黄紫堇碱的酿酒酵母工程菌。
24.本发明第六方面提供一种采用上述的博落回小檗碱桥酶基因优化序列制备高产金黄紫堇碱的酿酒酵母工程菌的方法所制备得到的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌为包含mcbbe3基因序列的ypr01。
25.本技术中crispr/cas9:为clustered regularly interspaced short palindromic repeats(规律成簇的间隔短回文重复)/crispr-associated protein 9(crispr相关蛋白9)的缩写，是第三代“基因组定点编辑技术”。
26.pam：(protospacer adjacent motif)前间区序列邻近基序，这是一种见于crrna
分子的短核苷酸基序，可以被cas9蛋白特异性识别并切割。
27.本发明的有益效果如下：
28.本发明根据酿酒酵母的密码子偏好性对博落回小檗碱桥酶基因(mcbbe)进行优化后得到mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4和mcbbe5，然后将五条优化后博落回小檗碱桥酶基因序列分别转化至酿酒酵母中进行表达，得到分别为yh01、yh02、yh03、yh04、yh05的菌株，然后通过摇瓶发酵和前体饲喂后，测定金黄紫堇碱产量，得出产量最高的菌株为yh03，最后将菌株yh03对应的mcbbe3序列整合进酿酒酵母基因组，得到高产的金黄紫堇碱的酿酒酵母工程菌，提高mcbbe在酿酒酵母中的催化效率，实现金黄紫堇碱产量的提高。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4、mcbbe5的基因扩增电泳图；
31.图2为博落回小檗碱桥酶基因(mcbbe)表达载体构建示意图；
32.图3为网状番荔枝碱的标准曲线图；
33.图4为金黄紫堇碱的标准曲线图；
34.图5为grna质粒示意图；
35.图6为ypr1位点grna的测序结果；
36.图7为ypr1up、ypr1down、gal1p、cyc1t、mcbbe3的基因扩增电泳图；
37.图8为puc19-ypr1-n3的质粒图谱。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
40.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
41.1、博落回小檗碱桥酶基因(mcbbe)密码子优化序列的设计及引物合成
42.根据酿酒酵母的密码子偏好性，将博落回小檗碱桥酶基因(mcbbe)进行优化，设计
5种密码子优化方案，基因分别命名为mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4和mcbbe5，其中基因的合成由南京金斯瑞生物科技公司完成。
43.本发明使用in-fusion克隆技术进行载体构建，根据此技术原理，我们设计了mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4、mcbbe5基因的引物，由北京擎科生物有限公司合成，具体引物序列见表1。
44.表1
[0045][0046]
2、鉴定引物的设计与合成
[0047]
利用表1所示的引物对mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4、mcbbe5进行扩增，扩增后的基因要连接到pyes2-ura载体质粒上，所以在pyes2-ura载体连接位点的上下游各约300-400bp左右设计引物，主要用于载体构建结果的鉴定，具体引物序列见表2。
[0048]
表2
[0049][0050]
具体制备过程如下：
[0051]
(1)将pyes2-ura质粒用kpni-hf、xbai双酶切成线性化质粒，反应条件为37℃，2小时，并进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120v，20min，切胶回收目标片段，用凝胶回收试剂盒纯化目的dna，片段大小约5768bp。
[0052]
(2)以合成的mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4、mcbbe5基因序列为模板，使用primerstar max dna polymerase以及表1中的引物扩增目的基因。pcr反应程序：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火10s，72℃延伸30s/kb(25个循环)，72℃终延伸7min，4℃保持。完成后在琼脂糖凝胶上电泳检测，结果如图1所示，其中m表示dl 2000dna marker，1表示mcbbe1，2表示mcbbe2，3表示mcbbe3，4表示mcbbe4，5表示mcbbe5。将正确的目的条带用
zymocleantm gel dna recovery kit回收。
[0053]
(3)将(2)中扩增的5个目的基因通过连接酶分别与pyes2-ura线性化载体相连接，其中表达载体构建示意图如图2所示，根据infusion同源重组酶的说明书，通过目的基因与线性载体片段的长度，计算出连接时所需要的浓度，在反应体系中加入片段与infusion酶，涡旋混匀，置于50℃反应20min。
[0054]
3、大肠杆菌转化
[0055]
表达载体构建完成后，将其转入大肠杆菌中，具体方法如下：
[0056]
(1)吸取上述的1μl连接产物，转入预冷的50μl大肠杆菌感受态dh5α中，混匀后，冰上静5min。
[0057]
(2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰上静置2min。
[0058]
(3)加入200μl无抗lb培养基。37℃摇床培养1小时。
[0059]
(4)涂布至带有amp抗性的lb平板上。37℃恒温过夜培养。lb平板上长出菌落后，挑取单菌落进行菌落pcr鉴定筛选阳性克隆，鉴定正确的重组载体分别命名为：pyes2-n1、pyes2-n2、pyes2-n3、pyes2-n4、pyes2-n5。
[0060]
4、酿酒酵母转化
[0061]
(1)首先取出实验室在-80℃保存的cen.pk2-1c酿酒酵母菌株，在ypd培养基上划线培养，活化酿酒酵母菌。挑取cen.pk2-1c菌株的单菌落于3ml ypd培养基中30℃过夜培养，第二天吸取200μl菌液转接于5ml ypd培养基中，放入30℃摇床培养4-5个小时，待菌液od值达到0.8左右时制备感受态细胞。
[0062]
(2)将1ml菌液吸入1.5ml无菌ep管中，于4℃离心机4000rpm离心1min，弃上清；1ml无菌水清洗一次，再次离心弃上清；用0.1m的liac重悬，放在冰上静置10min后离心去上清，保留菌体待转化使用。
[0063]
(3)同时，将ssdna用pcr仪进行变性处理，99℃，5min后立即埋入冰盒中进行冷却，待转化时使用；配置360μl转化体系：240μl的peg3350(50％w/v)，10μl的ssdna，36μl的1m liac，2μl质粒，72μl无菌水；然后将360μl转化体系加入制备好的感受态中，涡旋混匀，30℃培养30min后,置于42℃水浴锅热激25min；于4℃离心机4000rpm离心5min，弃上清；加入相应sd/dropout培养基重悬，并涂布于相应培养基平板中，倒置于30℃培养箱中培养。菌落pcr鉴定筛选阳性克隆，鉴定正确的菌株分别命名为：yh01、yh02、yh03、yh04、yh05。
[0064]
5、酿酒酵母摇瓶发酵及前体饲喂
[0065]
含有原mcbbe基因的菌株bhh001和含有罂粟来源的psbbe基因的菌株ys001作为阳性对照组，与菌株yh01、yh02、yh03、yh04、yh05一同进行摇瓶发酵和前体饲喂。在超净工作台挑取酵母单菌落于2ml葡萄糖缺陷培养基中，放于摇床，30℃过夜培养，培养液用离心机以12000rpm离心1min，收集菌体，用1ml半乳糖缺陷培养基重悬菌体，转接于含19ml半乳糖缺陷培养基的无菌摇瓶中，30℃摇床培养24h；用紫外分光光度计测定od600，按照比例用半乳糖培养基将od值稀释至0.8，总体积为6ml，将od600＝0.8的培养液继续培养7h后，培养液用离心机以5000rpm离心5min，弃上清，将菌体重悬于2ml tris-edta缓冲液中，加入6.5mg/l的(s)-reticuline进行饲喂，震荡使菌体重悬，继续培养24h。
[0066]
6、金黄紫堇碱提取及产量测定
[0067]
(1)提取：将上述7个菌株在培养24h后，培养液分别用5 000rpm离心10min，将上清
转移至5ml离心管中，剩余菌体中加入500μl甲醇及适量玻璃珠，涡旋震荡30min。再次离心5min，吸取上清液，过0.22μm滤膜，得到7个样品，等待上机检测。
[0068]
(2)标准曲线的制备：使用电子天平分别精密称取(s)-reticuline(网状番荔枝碱)和(s)-scoulerine(金黄紫堇碱)标准品用dmso溶解，配制出这2种生物碱的标准品储备液。吸取适量的标准品储备液，用甲醇按照比例依次稀释。(s)-reticuline制成浓度分别为40000ng/ml、20000ng/ml、10000ng/ml、5000ng/ml、2500ng/ml、1000ng/ml的标准品溶液。(s)-scoulerine制成浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml的标准品溶液。采用hplc-qqq ms进行测定，记录色谱峰面积。以峰面积积分值为纵坐标(y)，质量浓度(ng/ml)为横坐标(x)绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程y＝ax b。得到的标准曲线如图3和图4所示，其中图3为(s)-reticuline的标准曲线图，图4为(s)-scoulerine的标准曲线图。
[0069]
(3)产量测定：使用hplc-qqq-ms对(1)中得到的样品进行产量测定。结果如表3所示。根据数据得出yh03菌株的产量最高，达到了1.12mg/l，产率提高到了17.4％。相较于菌株blh001提高了58倍。说明mcbbe3在酿酒酵母中的催化效率最高。
[0070]
表3
[0071][0072]
6、利用crispr-cas9技术将mcbbe3基因整合进酿酒酵母基因组
[0073]
(1)构建grna质粒：通过网站http://chopchop.cbu.uib.no/设计了ypr1位点的grna，利用上下引物退火连接得到了双链核苷酸片段，引物序列见表4。之后使用bsai酶切pcrct质粒载体，将片段和线性载体连接后进行大肠杆菌转化，获得重组质粒ypr1-grna，质粒示意图见图5。得到的转化子进行菌落pcr验证，经过凝胶电泳检测发现目的dna条带与理论dna条带长度一致。之后挑取阳性转化子在amp抗性的lb液体培养基中过夜培养，次日提取质粒送测序公司进行序列测序。测序结果如图6所示，表明grna质粒构建成功。
[0074]
表4
[0075]
[0076]
(2)表达模块治理构建：以cen.pk2-1c基因组dna为模板，扩增ypr1up、ypr1down基因片段，以pyes2-ura质粒为模板扩增gal1p、cyc1t基因片段，以pyes2-n3质粒为模板扩增mcbbe3基因片段，具体引物信息见表5。经过凝胶电泳检测后可观察到长度分别为499bp、442bp、1611bp、248bp和476bp的dna条带，结果如图7所示，其中m表示dl 2000dna marker，1表示ypr1up，2表示gal1p，3表示：mcbbe3，4表示cyc1t，5表示ypr1down，与它们的理论条带长度一致，这一结果证明基因扩增成功。将ypr1up和gal1p进行连接，cyc1t和ypr1down进行连接，然后利用infusion的方法将最终的三个片段连接到已经进行酶切的puc19载体上。infusion连接结束后进行大肠杆菌转化，获得表达模块质粒puc19-ypr1-n3。得到的转化子进行菌落pcr验证，经过凝胶电泳检测发现目的dna条带与理论dna条带长度一致。之后挑取阳性转化子在amp抗性的lb液体培养基中过夜培养，次日提取质粒送测序公司进行全长测序。测序结果显示阳性菌落的基因序列与目的基因序列一致，证明重组质粒构建成功，质粒图谱见图8。
[0077]
表5
[0078][0079][0080]
(3)将mcbbe3基因整合到基因组：酶切puc19-ypr1-n3质粒获得ypr1位点的表达模块，与ypr1-grna质粒一同转入酿酒酵母cen.pk2-1c中，通过尿嘧啶(ura)单缺陷sd/dropout培养基筛选阳性克隆，酵母菌落pcr验证后得到单拷贝菌株ypr01。菌株ypr01即为含有mcbbe3基因的可以高产金黄紫堇碱的酿酒酵母工程菌。
[0081]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
[0082]
序列说明：
[0083]
seq id no.1-5分别为mcbbe1、mcbbe2、mcbbe3、mcbbe4和mcbbe5的核苷酸序列。
[0084]
seq id no.6-15分别为mcbbe1-ura-f、mcbbe1-ura-r、mcbbe2-ura-f、mcbbe2-ura-r、mcbbe3-ura-f、mcbbe3-ura-r、mcbbe4-ura-f、mcbbe4-ura-r、mcbbe52-ura-f、mcbbe5-ura-r的核苷酸序列。
[0085]
seq id no.16-17分别为pyes2-ura-f、pyes2-ura-r的核苷酸序列。
[0086]
seq id no.18-19分别为ypr1-grna-f、ypr1-grna-r的核苷酸序列。
[0087]
seq id no.20-29分别为y-up-f、y-up-r、y-gal-f、gal-mcbbe3-r、mcbbe3-f、mcbbe3-r、cyc1-mcbbe3-f、y-cyc1-r、y-down-f、y-down-r的核苷酸序列。