一种作用于高血压血瘀症的基因及其检测引物的制作方法

1.本发明属于生物领域，尤其涉及一种作用于高血压血瘀症的基因及其检测引物。


背景技术：

2.高血压病是动脉血压持续偏高的慢性疾病，也是缺血性心脏病、脑血管损害和动脉硬化最主要的促危因素，是我国目前心脑血管并发症最严重的疾病。近年研究表明高血压患者中血瘀在整个疾病进展中起着重要的作用，高血压患者中血瘀症占比47％，高血压病不同时期均可出现不同程度的血瘀症候。
3.中医认为凡是离经之血蓄留于体内或血行不畅蓄留于器官、脏腑、组织中，引起脏腑的功能失调，均属于瘀血，因瘀血产生的一系列证候即为血瘀症。现代医学研究表明，动脉狭窄、硬化及粥样斑块的形成，影响了血流，并且血浆粘度、全血粘度、红细胞压积升高，导致了心脏血液流变学的改变及微循环障碍，致使血液呈“粘、浓、凝、聚”状态，这符合中医所认识的“血瘀”表现。临床研究发现，高血压病血瘀症患者存在相关因子如no、et-1、epcr、tm、vwf、tpa、pai等与血管舒张收缩、凝血抗凝以及相关炎症因子指标的异常改变。
4.内质网(endoplasmic reticulum,er)是在真核生物细胞中由膜围成的隧道系统，也是真核细胞合成蛋白质、脂质和钙存储的重要细胞器，在调节蛋白质正确折叠、钙稳态、内质网应激和细胞凋亡等方面发挥着重要作用。适度的内质网应激可通过迅速调节细胞内ca2 平衡、蛋白质折叠修饰和细胞凋亡，从而维持内环境的稳态，使细胞不断适应环境的改变而发挥保护作用，但持续、过度的内质网应激会引起疾病的发生。已证实由ers引发的血管内皮细胞障碍参与了各种由血管损伤引起的病理生理过程及相关疾病，如高血压、动脉粥样硬化、脑卒中等。。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种作用于高血压血瘀症的基因及其检测引物。本发明发现atf4基因可以影响et-1、epcr、tm、vwf、pai、no和tpa的表达，从而对应调节动物的血压血瘀情况。
6.为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：
7.一种作用于高血压血瘀症的基因，所述基因为atf4基因。
8.进一步的改进，所述atf4基因为小鼠atf4基因或人atf4基因。
9.一种作用于高血压血瘀症的基因的检测引物，所述检测引物用于检测atf4基因或atf4基因转录的mrna。
10.进一步的改进，所述检测引物的正向序列为：5
’‑
caaaacaagacagcagccacta-3’，所述检测引物的反向序列为5
’‑
cttcttcccccttgccttac-3’。
11.一种atf4基因的表达产物，所述表达产物用作提高动物体内et-1、epcr、tm、vwf或pai含量的药物。
12.进一步的改进，所述表达产物用作降低动物体内no或tpa含量的药物。
13.一种阻断atf4基因表达的mrna序列，所述mrna序列用作降低动物体内et-1、epcr、tm、vwf或pai含量的药物。
14.进一步的改进，所述mrna序列用作提高动物体内no或tpa含量的药物。
15.进一步的改进，所述mrna序列为atf4基因翻译的mrna序列的互补序列。
16.本发明优点：
17.本研究经高盐诱导后构建高血压血瘀症小鼠模型，wt-hs组血压明显升高，ko-hs组血压未明显改变，说明敲除atf4基因可阻滞血压升高；血瘀症相关指标结果显示：ko-hs组与wt-hs组相比，et-1、epcr、tm、vwf、pai显著降低，no、tpa表达增加(p《0.05)，et-1具有收缩血管的功能，pai能抑制溶血，epcr、tm、vwf作为血管内皮细胞损伤的特异性标志物，no具有强烈的舒张血管的功能，而tpa能高效溶解血栓。这些细胞因子的增加或减少都提示高盐诱导的高血压小鼠血管内皮功能障碍，而敲除atf4基因后，能明显舒张血管，促进血液流通，改善血管内皮功能。结合血压和血瘀症相关因子的研究结果，表明敲除atf4基因能改善高血压血瘀症。
附图说明
18.图1为4周血压测量值图；
19.图2各个时间点收缩压测量值；
20.图3为elisa的各检测图；
21.图4为atf4蛋白测量免疫印迹图；
22.图5为atf4蛋白测量灰度值；
23.图6为atf4的基因表达量(备注：ap《0.05vs wt-ns组，bp《0.05vs ko-ns组，cp《0.05vs ko-hs组；wt-ns:野生型 正常饮食组；wt-hs:野生型 8％高盐饮食组；ko-ns:atf4
/- 正常饮食组；ko-hs:atf4
/- 8％高盐饮食组)。
具体实施方式
24.以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明。
25.实施例1
26.1.实验动物：atf4基因敲除c57bl/6j小鼠购于南京动物模式研究所，野生型c57bl/6j小鼠购于南方医科大学动物中心，饲养于暨南大学实验动物管理中心spf级屏障环境。
27.2.动物分组：atf4基因敲除c57bl/6j品系小鼠18只，野生型小鼠18只。分为基因敲除 正常饮食组(ko-ns:6只)、基因敲除 8％高盐饮食组(ko-hs:12只)、野生型 正常饮食组(wt-ns:6只)、野生型 8％高盐饮食组(wt-hs:12只)。
28.3.造模方法：wt-ns组及ko-ns组给予正常小鼠饲料喂养，wt-hs组及ko-hs组给予南通特洛菲公司定制的8％高盐饲料喂养，期间自由饮食、自由饮水，共喂养28天；第29天取小鼠胸主动脉和小鼠血清做western blot和elisa检测。
29.4.抗体:atf4 antibody(11815s)、gapdh loading control antibody(51332s)、goat anti-mouse igg antibody(14709s)。
30.5.实验步骤：
31.一、血压检测
32.开始正式实验前训练小鼠3天，每天下午3点测量小鼠的血压；当测量结果重复性很好，并且测量集合的收缩压标准偏差很小时，开始正式实验。采用blood pressure analysis程序开始测量鼠尾根部(距离鼠尾根部0.5cm左右)的血压。在正式实验前测量一次每组的血压值，并在正式实验后每隔4天测量一次血压，共测量7次，整个周期为28天；正式实验期间小鼠每天下午3点放置于在固定器10分钟，且每步操作均由同一操作者完成。
33.1)imagej软件分析结果如表1所示。
34.表1实验小鼠的血压记录表
[0035][0036]ap《0.05vs wt-ns组，bp《0.05vs ko-ns组，cp《0.05vs ko-hs组；wt-ns:野生型 正常饮食组；wt-hs:野生型 8％高盐饮食组；ko-ns:atf4
/- 正常饮食组；ko-hs:atf4
/- 8％高盐饮食组。
[0037]
二、elisa检测
[0038]
1)取小鼠血液，室温血液自然凝固10-20min，2-8℃条件3000rpm离心20min，仔细收集上清，分装后于-80℃保存；
[0039]
2)标准品的稀释：按下表稀释标准品制作标准曲线。
[0040][0041]
3)加样：设置空白孔对照孔、待测样品孔、标准孔。在酶标板上加入50μl标准品，待
测样品孔中分别加入40μl样品稀释液以及10μl待测样品，待测样品最终稀释5倍。加样时尽量加在孔底部，避免触及孔壁，加样完成后轻轻摇匀。
[0042]
4)温育：封板膜封酶标板后，设置37℃温箱孵育30min。
[0043]
5)配液：超纯水稀释30倍浓缩洗涤液后备用。
[0044]
6)洗涤：轻轻揭去封板膜并弃去上样液，每孔注满稀释后的洗涤液，静置30s，弃去洗涤液，重复5次后拍干。
[0045]
6)加酶：待测样品孔、标准孔中加入50μl酶标试剂。
[0046]
8)温育：重复步骤4。
[0047]
9)洗涤：重复步骤6。
[0048]
10)显色：每孔先加入50μl a显色剂，之后再加入50μl b显色剂，轻轻摇匀，避光孵育37℃15min.
[0049]
11)终止：每孔加入50μl终止液。
[0050]
12)测定：设置空白孔为基准值，450nm波长检测每个孔的od值，在15min以内完成检测。
[0051]
三.蛋白检测
[0052]
1.1.1试剂配制
[0053]
1)10％过硫酸铵(aps)
[0054]
a)过硫酸铵
ꢀꢀ
10g
[0055]
b)超纯水
ꢀꢀ
100ml
[0056]
2)30％聚丙烯酰胺
[0057]
a)丙烯酰胺
ꢀꢀ
58g
[0058]
b)甲叉双丙烯酰胺
ꢀꢀ
2g
[0059]
c)蒸馏水定容至200ml
[0060]
3)10x电泳液
[0061]
a)tris
ꢀꢀ
30.3g
[0062]
b)甘氨酸
ꢀꢀ
187.7g
[0063]
c)sds 10g
[0064]
4)封闭液5％
[0065]
a)脱脂奶粉
ꢀꢀ
5g
[0066]
b)tbst
ꢀꢀ
100ml
[0067]
5)10x转膜液
[0068]
a)tris
ꢀꢀ
5.8g
[0069]
b)甘氨酸
ꢀꢀ
2.9g
[0070]
c)sds 0.37g
[0071]
d)甲醇
ꢀꢀ
200ml
[0072]
e)蒸馏水定容至1000ml，室温保存6)1x转膜液
[0073]
a)10x转膜液 100ml
[0074]
b)无水乙醇
ꢀꢀ
200ml
[0075]
c)蒸馏水
ꢀꢀ
700ml
[0076]
7)10xtbs
[0077]
a)tris 2.42g
[0078]
b)nacl
ꢀꢀ
8g
[0079]
c)蒸馏水定容至1000ml
[0080]
8)tbst缓冲液
[0081]
a)10xtbs缓冲液
ꢀꢀ
100ml
[0082]
b)tween 20
ꢀꢀ
1ml
[0083]
c)蒸馏水定容至1000ml，调节其ph为7.4-7.6
[0084]
1.1.2提蛋白
[0085]
1)取100mg小鼠胸主动脉加入液氮研磨；
[0086]
2)配制裂解液，10ulpmsf(100mm) 1ml ripa裂解液混匀后放置冰上待用；
[0087]
3)研磨好的组织加入600μl含pmsf的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，要经常上下颠倒离心管；
[0088]
4)将离心管置于4℃，12000rpm离心5min，将离心后端上清分装至干净的离心管中，分装至少2份，于-80℃保存。
[0089]
1.1.3 bca法测定蛋白浓度
[0090]
1)将蛋白标准配制液1.2ml加入到30mg bsa中，蛋白标准溶液终浓度为25mg/ml；
[0091]
2)取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml；
[0092]
3)按照bca试剂a:b＝50:1的比例配制bca工作液，混匀后备用；
[0093]
4)按照0、1、2、4、8、12、16、20μl的容量，将标准品加到96孔板中，用标准品稀释液稀释至20μl，标准品浓度如表中所示，并制作标准曲线：
[0094][0095]
5)样品孔加入10μl待测样品蛋白，各孔加入200μl bca工作液，37℃孵育30min；
[0096]
6)酶标仪在562nm处检测od值，绘制标准曲线，并计算样品蛋白浓度，取适量上清和5x上样缓冲液按4:1混合，煮沸10min，缓慢恢复至室温，稍离心，于-20℃保存。
[0097]
1.1.4 sds-page电泳
[0098]
1)将跑胶用的玻璃板及玻璃内板用清洁剂和柔软的擦布清洗干净，放置在玻璃板架上，烘箱烤干或者自然风干；
[0099]
2)将干燥后的玻璃板用用制胶框夹好，并在平整的桌面上保持玻璃外板与玻璃内板底部对齐，然后将装有玻璃板的制胶框固定在带封边垫条的制胶支架上，防止漏胶；
[0100]
3)按下表配制sds-page分离胶混合液：
[0101][0102]
4)按下表配制sds-page浓缩胶混合液：
[0103][0104]
5)将配制好的sds-page分离胶混合液用移液枪迅速加入玻璃外板与内板的夹层中，在分离胶上注满蒸馏水，室温静置30min；
[0105]
6)待分离胶凝固后，将分离胶上层蒸馏水用移液枪小心吸出，并用滤纸吸去多余的蒸馏水，在分离胶上层注满配制好的sds-page浓缩胶混合液，立即小心插入齿梳，室温静置30min至浓缩胶完全凝固；
[0106]
7)将玻璃板取下，放入垂直电泳槽固定架中，然后将固定架放入电泳槽中，在电泳槽中缓慢加入1x电泳缓冲液，注意缓冲液必须淹没上样孔顶端；
[0107]
8)加入3μl marker和蛋白样品，按顺序依次上样；
[0108]
9)电泳：电压先设置80v，待marker到达分离胶后，设置120v电压直至marker电泳至分离胶底部为止。
[0109]
1.1.5转膜
[0110]
1)将目的蛋白所在的分离胶泳道裁剪下来，做好标记，准备好面积稍大于分离胶的pvdf膜；
[0111]
2)将pvdf膜用甲醇预处理5s，然后放置在转膜缓冲液30min；
[0112]
3)将电泳好的凝胶取出，小心放置在滤纸上，再将处理好的pvdf膜覆盖在凝胶上，在pvdf膜上再盖滤纸，形成滤纸，凝胶，pvdf膜，滤纸的“三明治”凝胶转印堆积结构，注意操作过程中不能产生气泡；
[0113]
4)按照转印夹中的正负极指示，将“三明治”堆积结构正确放入；
[0114]
5)转膜(18v，10min)
[0115]
1.1.6免疫印记
[0116]
2)转膜完成后，pvdf膜用tbst漂洗5min，1次；
[0117]
3)放入封闭液中室温封闭1h；
[0118]
4)封闭后用tbst漂洗5min，1次；
[0119]
5)一抗4℃过夜；
[0120]
6)置于脱色摇床上，tbst漂洗5min，3次；
[0121]
7)二抗室温孵育1h；
[0122]
8)置于脱色摇床上，tbst漂洗5min，3次；
[0123]
9)将pvdf膜放置在透明板上，并保持湿润；
[0124]
10)用移液枪将beyoecl star显影液均匀地覆盖pvdf膜表面，反应5min；
[0125]
11)去除多余的显影液；
[0126]
12)显影；
[0127]
13)imagej软件分析结果。
[0128]
四.rt-pcr检测，结果如图4所示。
[0129]
逆转录
[0130]
1)在pcr管中准备以下溶液:
[0131][0132]
2)将以上溶液混匀，85℃5min，之后马上制冷，防止复性；
[0133]
3)在pcr管中配置以下试剂：
[0134][0135]
4)反应条件如下:样品体积体积20μl、30℃10min、42℃60min、85℃10min定量pcr：
[0136]
1)反应体系：
[0137][0138][0139]
2)反应条件：50℃8min；95℃8min；95℃15s，60℃32s，40cycles；
[0140]
引物：
[0141][0142]
血压结果如图2所示：tf4
/-小鼠经过正常饮食和高盐饮食后，在第4、8、12、16、20、24、28天两组收缩压之间均无统计学意义(p＞0.05)，见图展示了atf4
/-两组各个时间点收缩压的检测值
[0143]
血瘀症相关指标如图3所示：小鼠elisa结果显示，wt-hs组与wt-ns、ko-hs组相比，et-1、epcr、tm、vwf、pai显著增加，no、tpa减少(ap《0.05,cp《0.05)；wt-ns、ko-ns、ko-hs各组之间no、et-1、epcr、tm、vwf、tpa、pai无明显变化(p＞0.05)
[0144]
atf4蛋白表达量如图5所示：小鼠western blot结果显示，与wt-ns组比较，ko-ns组atf4蛋白表达降低(bp《0.05)；wt-hs组与wt-ns、ko-hs组相比，atf4、chop蛋白表达显著增加(ap《0.05,cp《0.05)；ko-ns、ko-hs两组之间atf4、chop蛋白表达无明显变化(p＞0.05)
[0145]
atf4基因表达量如图6所示：小鼠pcr结果显示，与wt-ns组比较，ko-ns组atf4 mrna表达降低(bp《0.05)；wt-hs组与wt-ns、ko-hs组相比，atf4、chopmrna表达显著增加(ap《0.05,cp《0.05)；ko-ns、ko-hs两组之间atf4、chop mrna表达无明显变化(p＞0.05)
[0146]
上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。