小分子化合物哌立福新在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用

小分子化合物哌立福新在制备抗sars-cov-2药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及小分子化合物哌立福新在制备抗sars-cov-2药物 中的应用。


背景技术：

2.小分子化合物哌立福新(perifosine)是一种新型的akt抑制剂，靶向作用于akt的pleckstrinhomology区，被美国fda批准用于临床。对永生化角质形成细胞(hacat细胞)和头颈部 鳞状癌细胞有显著抑制效果；目前尚无文献报导其在抗sars-cov-2中的作用。
3.哌立福新化学结构式如下(casno.157716-52-4)：
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， sars-cov-2)，是一种新出现的高感染、高致病性传染病病原体，主要通过飞沫、密切接触 等途径经呼吸道传播。sars-cov-2感染引起的疾病被称为冠状病毒病2019(covid-19)， 常包括下呼吸道感染，即病毒性肺炎，以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻 塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速 进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多 器官功能衰竭等。瑞德西韦(remdesivir)是腺苷类似物，是一种广谱抗病毒剂，对多种rna 病毒(包括埃博拉病毒和冠状病毒)具有抑制活性。虽然瑞德西韦获得了美国食品和药物管 理局治疗covid-19的紧急使用授权，但其临床疗效较为有限。鉴于此，寻找、研发能有效 用于抗sars-cov-2感染的药物是当前全球生物医药领域界的重要任务，也是保护人类生命 健康的迫切需求。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供哌立福新在制备抗sars-cov-2药物中的应用。
[0007]
所述哌立福新的化学结构式如下：
[0008][0009]
本发明提供了额小分子化合物哌立福新在制备抗sars-cov-2药物中的应用。
[0010]
本发明所述的哌立福新在制备抗sars-cov-2药物中的应用，其特征在于：所述抗 sars-cov-2药物是指预防或治疗sars-cov-2感染的药物。
[0011]
本发明所述的哌立福新在制备抗sars-cov-2感染药物中的应用，其特征在于：所述抗 sars-cov-2药物是以哌立福新为唯一的活性成份，或包含哌立福新的药物组合物。
sars-cov-2感染的实验操作均在海军军医大学p3实验室中进行。
[0027]
6.兔抗sars-cov-2核衣壳蛋白多克隆抗体购自北京义翘神州科技股份有限公司(sinobiological#40143-t62)。
[0028]
7.alexafluor488标记的抗兔igg为美国thermofisher公司产品。
[0029]
二、实验方法：
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(一)从被批准用于临床的小分子药物库中筛选抗sars-cov-2化合物
[0031]
分别将培养于t25方瓶中的非洲绿猴肾细胞veroe6接种于96孔板，每孔内10000个细 胞，培养基100μl，12小时后，每孔加入50μl用培养液稀释的sars-cov-2，以及50μl 培养液稀释的小分子化合物。sars-cov-2病毒剂量为1
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103ffu(focusformingunits)(即 感染1000个veroe6细胞的病毒量)，小分子化合物终浓度为5μm，用5μm瑞德西韦(remdesivir)作为阳性对照，用含等体积溶剂dmso作为阴性对照，重复3个孔。18小 时后用免疫荧光法检测每孔细胞中sars-cov-2的感染，具体操作如下：吸除培养板中的培 养液，每孔加0.1ml甲醇，将培养板至于-20℃冰箱，20分钟后，取出培养板，吸除甲醇，每 孔以磷酸盐缓冲液(pbs)洗孔一次，随后加入100μl含3％牛血清白蛋白(bsa)的pbs (以下简称3％bsa-pbs)，置于水平摇床上，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的3％ bsa-pbs，每孔加0.1ml含兔抗sars-cov-2核衣壳蛋白多克隆抗体的1％bsa-pbs(抗体 500倍稀释)，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的兔多克隆抗体工作液，每孔以pbs洗3次， 随后加入0.1ml含荧光素alexafluor488-标记的抗兔igg的1％bsa-pbs(荧光素抗体1500 倍稀释)，室温避光缓慢摇1小时，吸除培养板中的荧光素抗体工作液，每孔加入dapi细胞 核染色液0.1ml，室温避光缓慢摇10分钟，吸除培养板中的dapi细胞核染色液，每孔以 pbs洗3次，用细胞成像及分析系统(biotekcytation5imagingreader)对每孔细胞的绿色 荧光阳性细胞进行计数，然后计算药物对sars-cov-2感染的抑制率(％)＝1-(药物处理孔 阳性细胞数/dmso处理孔阳性细胞数)*100％。
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对抑制率大于95％且细胞核计数与dmso处理孔相差不超过5％的小分子药物，作为候 选抗病毒药物，进一步测定其细胞毒性与抗病毒活性。筛选结果显示：作为阳性对照的瑞德 西韦对sars-cov-2感染的抑制率大于99％；2580个化合物中有98种化合物达到候选抗病 毒药物的标准，其中哌立福新对sars-cov-2感染的抑制率大于99％。查阅公开的研究论文 以及发明专利，未见哌立福新具有抗sars-cov-2活性的报道。
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(二)哌立福新的细胞毒性检测
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分别将培养中的非洲绿猴肾细胞veroe6以及人肺腺癌细胞calu-3分别接种于96孔板 内，每孔内10000个细胞，dmem培养液100μl，12小时后，吸除原培养液，每孔内加入 含有浓度梯度稀释的哌立福新的dmem培养液100μl，哌立福新终浓度分别为0、0.064、 0.32、1.6、8、40和100μm，用加入含有等体积溶剂dmso的dmem培养液作为对照。每 种药物浓度以及对应体积的dmso均设三个重复孔，置于37℃、5％co2孵箱内培养。48小 时后，每孔内加入celltiter-glo发光法细胞活性检测试剂100μl，室温孵育20min后，于酶 标仪上检测每孔细胞的化学发光值(化学发光值代表细胞活性)。计算药物处理孔细胞平均化 学发光值与含相应体积dmso溶剂孔细胞化学发光值的比值，比值越接近1表示药物对细胞 生长的影响越小，一般比值大于0.9被认为细胞毒性不明显。
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结果见表1所示，当浓度低于或等于40μm时，哌立福新对两种细胞系均没有明显毒
能够显著抑制病毒感染，表明哌立福新可能作用于病毒的复制阶段。
[0044]
表2.哌立福新处理对sars-cov-2感染不同阶段的影响
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上述实验结果均表明，哌立福新可有效抑制sars-cov-2感染，且主要作用于病毒复制 阶段。
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以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不 脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求 保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。