一种基于G-四联体的双模式卡那霉素适配体传感器的制备方法

一种基于g-四联体的双模式卡那霉素适配体传感器的制备方法
技术领域
1.本发明涉及基于g-四联体制备比色和电化学联用的双模式传感器领域。


背景技术：

2.卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，常应用于临床药物治疗的细菌感染和结核病、也被用作畜牧业中兽药和动物生长促进剂；滥用或错误使用卡那霉素会导致蛋、奶、肉等动物源性食品的残留，最终通过食物链在人体内蓄积，对人体健康构成威胁并产生诸多副作用，包括肾毒性、听力损失、发育问题和过敏反应；欧盟已经确定了可食用组织和牛奶中的最大残留限值(mrls)为150 μg kg-1
；因此，开发足够灵敏的方法来检测卡那霉素残留对于食品安全和加强市场监督至关重要。
3.已经开发了几种传统的分析技术来检测食品样品中的卡那霉素，例如液相色谱-质谱(lc-ms)、高效液相色谱(hplc)和气相色谱(gc)等，虽然这些方法仍然是黄金标准；然而，这些方法由于昂贵的设备、复杂的样品预处理和繁琐的操作在应用上受到限制；最近报道了一些简单快速的传感器，如适配体传感器，一般采用比色法、电化学方法、荧光法、电化学发光等；在众多用于检测卡那霉素的生物传感器中，比色法生物传感器具有成本低、设备简单、肉眼可视化检测等优点，是一种便捷的监测方法；电化学生物传感器由于其高灵敏度、精密度和选择性而被广泛使用；利用这些互补的优势，可以开发比色和电化学联用的双模式检测策略对卡那霉素进行视觉和超灵敏的检测。
4.适配体是一类人工单链核苷酸，可以根据其三维构型特异性识别其靶标；它们是通过体外指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选获得；适配体具有重现性好、合成简单、生产成本低、修饰容易、稳定性好等优点；由于适配体的核酸性质，它可以更好地与dnazyme和核酸等温扩增结合构建高灵敏度的生物传感器；富含g的核酸片段很容易折叠成g-四分体并堆叠成g-四联体结构；许多dna扩增技术已用于适配体传感器，非等温核酸扩增技术不依赖高精度的温度循环和精密仪器，只需恒温水浴锅就可以满足实验要求；其中非等温核酸扩增-滚环扩增(rca)具有效率高、适应性强、操作简单等优点；rca只需要短引物、圆形扩增模板、dntps 和两种酶（t4 dna 连接酶和 phi29 dna 聚合酶）即可产生长ssdna，而且rca的核酸序列设计没有那么严格（没有特异性限制位点）；它更易于设计和应用在许多场景中。
5.将血红素与g-四联体结合具有辣根过氧化物酶的作用，通过催化h2o2氧化3,3`,5,5`-四甲基联苯胺(tmb)生成显色化合物，为视觉信号输出提供传感平台；与传统蛋白酶相比，dnazymes具有合成简单、化学稳定性高、成本低、易修饰等优点；尽管方便的g-四联体-血红素dnazyme已广泛用于生物传感器设计，但一个严重的挑战限制进一步的开发和应用，即相对较低的灵敏度；可以利用亚甲基蓝和g-四联体之间的强吸附作用构建电化学传感器；aunps不仅具有良好的导电性，而且可以形成au-s键来固定适配体；多壁碳纳米管(mwcnts)是一种具有高化学稳定性的碳材料，可以增加电活性面积并增强导电性；然而，由
于其强疏水性和生物不相容性，mwcnts会在水中形成大的团聚体；具有非凡水溶性的壳聚糖(cs)可用作多壁碳纳米管的分散剂和稳定剂；为了进一步提高灵敏度，使用mwcnts-cs@aunps对电极进行了改性；因此，基于g-四联体，采用比色结合电化学的双模式传感器检测卡那霉素，既保留了视觉优势，又结合了高灵敏度的优势。


技术实现要素：

6.在本发明的目的是提供一种检测卡那霉素残留的双模式传感器的制备方法，实现卡那霉素可视化和高灵敏的双模式检测。
7.本发明的第二个目的是放大双模式传感器的信号，提高灵敏度。
8.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种基于g-四联体的双模式卡那霉素适配体传感器的制备方法，包括以下步骤的方法制备而成：（1）制备成50 nm适配体(apt)和其互补链结合的互补双链dna (apt-pr/apt-sh-pr)；（2）在卡那霉素存在时，特异性结合释放pr，利用t4 dna连接酶将pr与挂锁结合，生成滚环模板；（3）在phi29 dna聚合酶和钾离子的作用下，驱动滚环扩增形成大量g-四联体；（4）在0.5 ml离心管中，加入g-四联体产物和血红素溶液孵育1 h，形成dnazyme，加入显色混合液(tmb、h2o2、柠檬酸缓冲液)，观察颜色变化，加入硫酸终止反应，测量吸光度值，根据颜色情况和吸光度值检测卡那霉素含量；（5）制备mwcnts-cs和aunps，处理裸金电极，用氧化铝浆液仔细抛光，然后在乙醇和超纯水中超声5 min，直到铁氰化钾溶液中循环伏安图的峰值电位差低于80 mv；（6）在电极表面修饰mwcnts-cs@aunps，过夜固定巯基修饰的g-四联体产物，滴加mch溶液，以防止非特异性吸附，接着滴加亚甲基蓝到修饰后的电极上，用0.5 ml的离心管覆盖，在室温下孵育1 h后，用pbs冲洗去除多余的mb，在pbs缓冲液(ph 6.0)中、-0.6 ~ 0.1 v范围内测量差分脉冲伏安法，卡那霉素的含量与亚甲基蓝的电信号成正比；（7）对牛奶样品进行去脂去蛋白后，取上清进行应用评估。
9.本发明的有益效果：(1) 将比色法和电化学方法相结合，实现了可视化和高灵敏度的双模式检测卡那霉素的目的；(2) rca产生了大量的g-四联体来放大双模式传感器的信号，结合纳米复合材料和rca实现了对电化学检测信号的双重放大；(3) 所制备的适配体传感器不仅适用于牛奶中卡那霉素的检测，还有望通过简单地改变适配体实现对其他抗生素的灵敏检测和大规模定量，在食品安全、环境监测、疾病诊断等方面具有巨大的应用潜力。
附图说明
10.图1是本发明制备的双模式生物传感器示意图。
11.图2是卡那霉素置换双链dna中pr的gelred的荧光光谱表征图。
12.图3是发生rca扩增反应的琼脂糖凝胶电泳表征图。
13.图4是生成g-四联体的圆二色谱表征图。
14.图5是纳米材料的扫描电镜图像和透射电镜图像。
15.图6是mwcnts-cs-aunps的eds图像。
16.图7是电化学传感器的循环伏安法和差分脉冲伏安法的表征图。
17.图8是酶时间和浓度优化图。
18.图9是氯化钾浓度、电化学和比色传感器的ph值及血红素浓度优化图。
19.图10是测量不同浓度卡那霉素的吸收光谱和比色传感器的标准曲线。
20.图11是测量不同浓度卡那霉素的差分脉冲伏安曲线和电化学传感器的标准曲线。
21.图12是研究双模式传感器的特异性和抗干扰性图。
具体实施方式实施例
22.互补双链的制备：使用含有50 mm nacl的te缓冲液溶解50 nm适配体(apt)和其互补链(pr/sh-pr)，在95℃退火2 min，然后冷却至室温进行杂交，制备成50 nm互补dna (apt-pr/apt-sh-pr)。
23.进行滚环扩增反应：首先，加入4 μl步骤(1)中制备的apt-pr/apt-sh-pr，再加入2 μl卡那霉素，反应1 h，使目标物与适配体充分结合，释放出游离的互补链；然后，加入4 μl 50 nm padlock、2 μl 10
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t4连接酶缓冲液、5 μl t4 dna 连接酶 (1 u/μl)，25℃下孵育3 h形成滚环模板，并在65℃加热10 min使酶失活；最后，加入5 μl 1 mm dntps、6.5 μl 1 mg/ml bsa、6 μl 10
×
phi29dna聚合酶缓冲液、3.25 μl 1 m kcl和2 μl phi29 dna聚合酶（1 u/μl），30℃孵育1.5 h，这触发 rca 产生大量富含g的ssdna，其与k

形成g-四联体，将混合物在65℃下加热10 min以使酶失活。
24.荧光表征：利用gelred与ssdna的结合信号约为dsdna的一半的原理，验证了卡那霉素是否可以取代互补双链dna中的pr；490 μl apt-pr和10 μl不同浓度卡那霉素产生的样品被添加到离心管中，在37℃孵化1 h后，添加1 μlgelred，反应15 min后，记录635 nm处的荧光发射光谱和荧光强度被用来验证置换单链的情况，见附图2。
25.凝胶电泳表征：用凝胶电泳法验证了rca反应的完成情况，用1
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tae配置20 ml 3%琼脂糖，然后加入1 μl gelred，冷却凝固后，混合加入5 μl制备样品和1 μl加样缓冲液，放入电泳槽中在室温和100v恒压下移动25 min，最后，在紫外成像系统下进行拍照，见附图3。
26.圆二色性(cd)表征：对照两种浓度的卡那霉素产生生成的g-四联体，设置测量范围为200~400 nm，扫描速度为100 nm/min，响应时间为1 s，带宽为0.2 nm，在微量比色皿中记录的g-四联体的cd光谱，见附图4。
27.构建比色传感器：使用0.1 m氢氧化钠制备10mm的血红素原液，然后用10 mm tris-hcl缓冲液(ph8.5)稀释至20 μm。用无水乙醇制备5 mm tmb溶液。用超纯水稀释30%过氧化氢至3%。在0.5 ml离心管中加入6 μl rca产物与14 μl血红素孵育，37℃孵育1 h，然后加入100 μl显色混合液 (1900 μl ph=4.5柠檬酸缓冲液，4.4 μl 3%过氧化氢溶液和100 μl tmb溶液)，孵育50 min。最后，在上述混合溶液中加入100 μl 2 m硫酸终止反应，在450 nm处检测吸光度。
28.纳米材料的制备：mwcnts-cs的制备：称取10 mg的mwcnts-cooh溶解在混合酸溶液（浓硫酸：浓硝酸=3：1）中超声处理3 h，用超纯水多次清洗离心直到中性，调至浓度为2.5 mg/ml。制备2%壳聚糖溶液，将1 ml冰醋酸溶解于99 ml超纯水中，加入2 g壳聚糖，搅拌混合至完全溶解。用上述试剂制备1 mg/ml mwcnts-cs (0.05%cs)；aunps的制备：将1 ml 1%氯金酸加入100 ml沸腾的超纯水中，连续搅拌4 min，然后加入2.5 ml 1%柠檬酸三钠，继续煮沸10 min，然后继续搅拌至冷却。
29.对材料进行扫描、透射和eds表征，结果见附图5、6；构建电化学传感器：取6 μl步骤(7)中制备的mwcnts-cs和aunps逐层滴在处理好的裸金电极上，然后滴加入rca产物-巯基修饰的g-四联体，在室温下孵育过夜通过au-s键组装在电极表面，然后滴注加入6 μl 1 mm mch溶液，以防止非特异性吸附，接下来将8 μl的1 mm 亚甲基蓝滴加到修饰后的电极上，用0.5 ml的离心管遮盖，孵育1 h后，在pbs缓冲液(ph6.0)中，在-0.6 ~ 0.1v的电位范围内测量差分脉冲伏安图。
30.对实验条件进行优化，结果见附图8、9所示：t4 dna 连接酶最佳浓度为50 u、最佳反应时间为3 h；phi 29 dna 聚合酶的最佳反应量为2 u，最佳反应时间为1.5 h；kcl的最佳浓度为60 mm；比色法和电化学法的最佳ph值分别为4.5和6.0；血红素最佳为浓度20 μm。
31.在最佳测试条件下通过两种传感器进行浓度梯度定量测试，所提出的比色适配体传感器的最低1.949 nm，检测范围为1
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10
2 nm~1
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10
3 nm，回归方程为a=
ꢀ‑
1.15838 0.76404
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lgc (r2=0.99377)，结果见附图10；电化学适配体传感器具有更低的lod检测限为0.333 pm，更宽的检测范围1
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10-3 nm~ 2.5
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10
3 nm，回归方程为i=6.06574
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lgc 172.43087 (r2=0.99393)，结果见附图11。
32.在测试体系中分别加入浓度为50 μm的庆大霉素 (gen)、壮观霉素 (spe)、链霉素 (str)、新霉素 (neo)等干扰抗生素和1 μm卡那霉素，通过吸光度和差分脉冲伏安图峰值进行测试，以检测其抗干扰性，结果见附图12；分别准备了5批比色和电化学传感器，检测制备的双模式传感器的重现性，结果显示比色传感器的相对标准偏差(rsd)为4.64%，电化学传感器的rsd为3.16%。结果均低于5%。
33.制备了四种不同浓度的加标样品，进行实际样品分析：在测试之前，这些样品都要经过简单的预处理；滴加20%醋酸，调整牛奶样品的ph值至4.6，45℃孵育15 min以沉淀蛋白质；以10,000 rpm离心30 min，以去除凝固的蛋白和脂肪，取上清液，用0.22 μm膜过滤，调整ph至中性，进行实际样品检测分析；比色传感器的回收率范围为89.43%-111.18%，rsd范围为2.18%-5.41%；电化学传感器的回收率范围为90.52%~111.14%，rsd范围为1.01%-1.68%；这些结果表明，所制备的双模式适配体传感器可以检测牛奶中的卡那霉素。