一种用于治疗退行性颈椎病的自体脂肪源干细胞的提取方法与流程

1.本发明涉及干细胞提取相关技术领域，具体为一种用于治疗退行性颈椎病的自体脂肪源干细胞的提取方法。


背景技术：

2.颈椎退行性变是发生颈椎病的最主要原因，由于我们长期工作、生活姿势不当，颈椎长期承受超过颈椎负荷的压力，颈椎附着的肌肉、韧带、血管等劳损，颈椎退行性变就开始了，由于颈椎退行性变，颈椎局部产生血肿，长时间血肿得不到好转就会形成颈椎骨质增生；由于颈椎退行性变而颈椎间盘亦随之发生退变，颈椎间盘退变后椎间盘纤维环变脆，当颈椎发生外力刺激或损伤，纤维环破裂，椎间盘髓核溢出纤维环外，就是颈椎间盘突出，在退行性颈椎病进行治疗的时候，需要用到自体脂肪源干细胞，通过自体脂肪源干细胞的分化，进而达到治疗的作用；但是在进行提取培养的时候，往往因为各种原因影响提取效果；
3.由此，本发明设置了一种自体脂肪源干细胞的提取方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于治疗退行性颈椎病的自体脂肪源干细胞的提取方法，以解决上述背景技术提出的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种用于治疗退行性颈椎病的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：
6.s1、在无菌环境下，选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，用较小的手术刀沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，提取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用pbs缓冲液清洗3-5遍脂肪组织，再将其置于pbs缓冲液中用灭菌剪将脂肪组织进行剪碎处理，得到脂肪小块；
7.s2、将脂肪小块置于500ml生理盐水中，静置10-15min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50ml离心管，置于冷冻高速离心机中进行离心，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
8.s3、使用浓度为0.1％的胶原酶ⅰ对脂肪颗粒处理，得到细胞溶液，然后通过差数离心机对其进行提取，得到细胞组织液；
9.s4、然后将细胞组织液放置到培养皿中，通过加入培养液和诱导基因进行原代培养和传代培养；
10.s5、将培养后的干细胞保存在低温室内，将温度设置为4℃，从而方便后续的使用。
11.进一步的，所述步骤s4原代培养和传代培养的培养基采用dmem/f12基础培养基，并添加its、青霉素和链霉素，并且its、青霉素和链霉素的添加量分别为5ng/ml、100u/ml 和100u/m。
12.进一步的，所述步骤s3中胶原酶ⅰ的温度设置在人体生存的最适温度36℃-37℃，酶解处理时间为6～8小时。
13.进一步的，所述步骤s1中pbs缓冲液为浓度0.05％-2％的triton x-100或triton x
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200的pbs缓冲液。
14.进一步的，所述步骤s2中冷冻高速离心机在进行启动后，保证在温度4℃，转速 1000-1200r/min条件下，离心5min。
15.进一步的，所述步骤s3中差数离心机在进行离心的时候，保证离心转速为 1000-1200r/min，其中温度保证在人体生存的最适温度36℃-37℃。
16.进一步的，培养皿内的环境温度保证在人体生存的最适温度36℃-37℃，200rpm，培养时间为2-3天。
17.进一步的，所述步骤s1、步骤s2、步骤s3、步骤s4、步骤s5均在无菌条件下进行，步骤s1所述患者机体一处部位包括上臂、腹部以及大腿内侧任意一处。
18.与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：在进行使用的时候，通过pbs缓冲液对脂肪组织液进行清洗，从而保证了在进行清洗的时候，清洗的效果，通过冷冻离心机在生理盐水的配合下和在通过差数离心机通过胶原酶ⅰ的配合下，使得在对自体脂肪源干细胞进行提取的时候，提取的效果更加轻松方便，保证了提取的效率，同时通过对提取后的细胞通过原代培养和传代培养，从而有效的保证了对提取的自体脂肪源干细胞进行分化，方便后续更好的对其进行使用。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例
21.本发明提供技术方案：一种用于治疗退行性颈椎病的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
22.s1、在无菌环境下，选择患者机体一处部位作为抽取脂肪的部位并进行标记，用较小的手术刀沿着皮肤切口的方向插入皮下脂肪组织，提取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用pbs缓冲液清洗3-5遍脂肪组织，再将其置于pbs缓冲液中用灭菌剪将脂肪组织进行剪碎处理，得到脂肪小块；
23.s2、将脂肪小块置于500ml生理盐水中，静置10-15min，排出最下层，然后将剩余液体转移至50ml离心管，置于冷冻高速离心机中进行离心，离心结束后取上层，得到脂肪颗粒；
24.s3、使用浓度为0.1％的胶原酶ⅰ对脂肪颗粒处理，得到细胞溶液，然后通过差数离心机对其进行提取，得到细胞组织液；
25.s4、然后将细胞组织液放置到培养皿中，通过加入培养液和诱导基因进行原代培养和传代培养；s5、将培养后的干细胞保存在低温室内，将温度设置为4℃，从而方便后续的使用。
26.在对自体脂肪源干细胞进行提取的时候，保证其环境处于无菌的环境，从而保证了提取的效果，通过设置的生理盐水用于位置细胞的正常形态，从而方便对细胞的提取，通
过低温室的设置，方便对培养后的干细胞进行保存。
27.具体的，步骤s4原代培养和传代培养的培养基采用dmem/f12基础培养基，并添加its、青霉素和链霉素，并且its、青霉素和链霉素的添加量分别为5ng/ml、100u/ml和100u/m，。
28.具体的，步骤s3中胶原酶ⅰ的温度设置在人体生存的最适温度36℃-37℃，酶解处理时间为6～8小时，。
29.具体的，步骤s1中pbs缓冲液为浓度0.05％-2％的triton x-100或triton x-200 的pbs缓冲液，通过将pbs缓冲液中加入了triton x-100或triton x-200，有效的提高了pbs缓冲液使用的效果。
30.具体的，步骤s2中冷冻高速离心机在进行启动后，保证在温度4℃，转速 1000-1200r/min条件下，离心5min。
31.具体的，步骤s3中差数离心机在进行离心的时候，保证离心转速为1000-1200r/min，其中温度保证在人体生存的最适温度36℃-37℃。
32.具体的，培养皿内的环境温度保证在人体生存的最适温度36℃-37℃，200rpm，培养时间为2-3天。
33.具体的，步骤s1、步骤s2、步骤s3、步骤s4、步骤s5均在无菌条件下进行，步骤 s1所述患者机体一处部位包括上臂、腹部以及大腿内侧任意一处。
34.通过pbs缓冲液对脂肪组织液进行清洗，从而保证了在进行清洗的时候，清洗的效果，通过冷冻离心机在生理盐水的配合下和在通过差数离心机通过胶原酶ⅰ的配合下，使得在对自体脂肪源干细胞进行提取的时候，提取的效果更加轻松方便，保证了提取的效率，同时通过对提取后的细胞通过原代培养和传代培养，从而有效的保证了对提取的自体脂肪源干细胞进行分化，方便后续更好的对其进行使用。
35.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
36.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。