一种抗幽门螺杆菌活性多肽及其应用

1.本发明属于治疗细菌感染疾病的药物技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌活性多肽及其应用。


背景技术：

2.幽门螺杆菌感染可导致慢性胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡、胃癌和粘膜相关淋巴组织瘤的临床症状。世界卫生组织已将这些细菌列为一类致癌物。幽门螺杆菌感染率高的人通常比没有感染的人患胃癌的风险更大。在中国，胃癌已经成为仅次于肺癌第二大癌症导致的死因。上述幽门螺杆菌感染的情况与幽门螺杆菌在胃中的长期定植有关。目前，质子泵联合两种抗生素三联疗法或再加铋剂的四联疗法是幽门螺杆菌感染的标准疗法。然而，幽门螺杆菌对多种抗生素产生耐药性，幽门螺杆菌的治愈率正在下降。因此，需要开发能够杀死对抗生素具有抗性幽门螺杆菌菌株的新抗菌化合物。
3.在已知的化合物中，抗菌肽(amps)可能是合适的候选物，比如，ll-37(一种阳离子抗菌肽)是一种来源于中性粒细胞和各种上皮细胞的抗菌蛋白，分子量为18kda。ll-37是人cathelicidin家族的一员，是从hcap18的羧基端切下来多肽。ll-37对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很强的抗菌作用。现有研究发现，ll-37不仅对野生幽门螺杆菌菌株具有比抗生素更强的杀菌作用，而且对抗生素抗性幽门螺杆菌菌株也具有更强的杀菌作用。不幸的是，胃的酸性环境和胃蛋白酶对其抗幽门螺旋杆菌活性有很大影响。质谱分析表明，ll-37在模拟胃液中温浴后成为了短肽。同时，它最初的抗幽门螺旋杆菌活性几乎丧失。
4.目前没有文献公开在胃的酸性环境和胃蛋白酶存在下对抗幽门螺旋杆菌活性有极少影响或无影响的抗菌肽或其他抗生素。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明目的在于提供一种抗幽门螺杆菌活性多肽或其功能性衍生物用于治疗幽门螺杆菌感染，该抗幽门螺杆菌活性多肽在胃酸或胃蛋白酶中对幽门螺杆菌具有抗菌活性，最小浓度低达8μg/ml。所述抗幽门螺杆菌活性多肽的氨基酸序列如sequence no:1所示。
6.具体地，所述幽门螺杆菌活性多肽是基于ll-37进行设计的。
7.具体地，ll-37的第18至29个氨基酸残基的短肽krivqrikdflr-nh2(命名为kr-12)表现出比ll-37更强的抗微生物活性，但是这种短肽在胃酸和胃蛋白酶存在下会被降解，降解的成分中有一个9个氨基酸的较短肽krivqrikd-nh2(命名为kr-9)被确定在ph《1.3和ph》2的条件下不被胃蛋白酶降解。基于在线研究资料:https://web.expasy.org/peptide_cutter/and mass spectrometric analysis.该研究根据结构与活性关系研究表明，kr-12是最小的具有抗菌活性的ll-37衍生短肽，kr-9没有抗菌活性，包括抗幽门螺杆菌活性。基于此，本发明创造性在kr-9的c-末端添加了3个氨基酸残基，形成每条短肽含有12个氨基酸残基的肽，在发明过程中设计了28个肽。
8.进一步，本发明为了确保28种设计的肽在低ph值和胃蛋白酶存在下稳定，使用了在线工作https://web.expasy.org/peptide_cutter/and mass spectrometric technique进行分析和质谱分析。然后从设计的28个多肽中筛选出抗菌活性最强的多肽，命名为samp-12aa。并且进一步验证了samp-12aa的杀菌活性及其临床应用的安全性，结果表明，基于ll-37设计的samp-12aa短肽在模拟胃液中保持了杀菌活性和杀菌动力学活性；samp-12aa在发挥抗菌作用同时自身不会诱导耐药菌株产生，并对已耐抗生素的幽门螺杆菌菌株也具有抗菌活性；并且发现其杀菌机制是基于增强外膜的渗透性和破坏内膜的完整性；samp-12aa对原核细胞表现出良好的选择性毒性，对真核细胞低毒性几乎没有毒性。
9.本发明目的在于还提供一种samp-12aa具有在模拟胃液中具有很好的杀幽门螺杆菌动力学。
10.进一步，所述有效剂量≥所述抗幽门螺杆菌活性多肽的抗幽门螺杆菌活性的最低浓度，即根据实际需要，选择对幽门螺杆菌产生抗菌活性的最小抑菌浓度或杀菌浓度的药物量。
11.进一步，所述8μg/ml为所述抗幽门螺杆菌多肽对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度，所述抗幽门螺杆菌多肽对幽门螺杆菌的最小杀菌浓度为32μg/ml。
12.进一步，所述药用可制备适合口服的剂型。
13.本发明目的在于还提供一种前任一所述的抗幽门螺杆菌活性多肽在制备用于抑制或杀灭幽门螺杆菌的制剂中的应用。
14.进一步，所述幽门螺杆菌具有抗生素耐药性。对于具有抗生素耐药性的幽门螺杆菌，所述抗幽门螺杆菌活性多肽也同样具有杀灭活性。
15.进一步，所述幽门螺杆菌对抗生素具有耐药性。对现有一线治疗幽门螺杆菌的抗生素(如甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素)具有耐药性的幽门螺杆菌，所述抗幽门螺杆菌活性多肽同样对其具有杀菌活性。
16.本发明目的在于还提供一种前任一所述的抗幽门螺杆菌活性多肽在作为或制备用于增加细菌细胞外膜渗透性的制剂中的应用，尤其对于幽门螺杆菌。
17.本发明目的在于还提供一种前任一所述的抗幽门螺杆菌活性多肽在作为或制备用于破坏细菌细胞内膜完整性的制剂中的应用，尤其对于幽门螺杆菌。
18.本发明目的在于提供一种前述的抗幽门螺杆菌活性多肽在制备用于由治疗幽门螺杆菌感染导致的疾病的药物中的应用，所述疾病包括但不限于慢性胃炎、消化性溃疡、十二指肠溃疡、胃癌、粘膜相关淋巴组织瘤。
19.本发明中，术语“功能性衍生物”指的所述抗幽门螺杆菌活性多肽的氨基酸经过调整后但是与所述抗幽门螺杆菌活性多肽具有同样功能的调整多肽。
20.本发明有益效果在于：本发明提供的抗幽门螺杆菌活性多肽在胃酸或胃蛋白中对幽门螺杆菌的抑制浓度低达8μg/ml；而且自身不会诱导耐药性幽门螺杆菌，具有抗耐抗生素幽门螺杆菌的活性；其对原核细胞表现出良好的选择性毒性，对真核细胞几乎没有毒性。
附图说明
21.图1为用生理盐水制备的samp-12aa对幽门螺杆菌atcc43504菌株的杀菌动力学。
22.图2为用人工胃液制备的samp-12aa对幽门螺杆菌atcc43504菌株的杀菌动力学。
23.图3为samp-12aa对幽门螺杆菌外膜通透性的影响。
24.图4为samp-12aa对幽门螺杆菌膜通透性的影响。
25.图5为在体外抗生素诱导幽门螺杆菌耐药菌菌株产生而samp-12aa肽自身不会诱导耐药菌株产生。
26.图6为samp-12aa对人胃腺癌细胞的细胞毒性很小几乎没有细胞毒性说明口服用药安全。
27.其中，图4中，a为1ml幽门螺杆菌菌悬液与1ml pbs(对照)和2ml 100μm碘化丙啶(pi)在微需氧条件下室温孵育90分钟后用荧光共聚焦显微镜观察细胞情况；b为1ml幽门螺杆菌菌悬液与2ml 100μm碘化丙啶(pi)和1ml 16μg/ml samp-12aa在微需氧条件下室温孵育90分钟后用荧光共聚焦显微镜观察细胞情况。
具体实施方式
28.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
29.本发明实施例中，按照下列配方制备人工胃液：每升人工胃液含有2.05克氯化钠、8.3克蛋白胨、0.6克磷酸二氢钾、0.37克kcl、3.5克d-葡萄糖、0.11克氯化钙、0.05克胆汁、13.3毫克胃蛋白酶和0.1克溶菌酶。此外，在人工胃液中补充5.5g尿素以评估幽门螺杆菌尿素酶活性作用。
30.本发明实施例中，使用的幽门螺杆菌菌株有：atcc43504(nctc11637)、幽门螺杆菌菌株atcc700392(26659)、幽门螺杆菌菌株atcc 63629(nctc 11639)、幽门螺杆菌菌株ss1、幽门螺杆菌胃溃疡临床菌株和幽门螺杆菌胃癌临床菌株在申请人的实验室中保存。
31.本发明实施例中，使用的液体培养基为幽门螺杆菌液体培养基(3.85克加93毫升蒸馏水121℃灭菌15分钟在50-55℃时加入胎牛血清或无菌脱纤维羊血7毫升)(青岛高科园海博生物技术有限公司)。
32.本发明实施中，幽门螺杆菌溶液的制备为：将幽门螺杆菌atcc43504在上述制备的液体培养基中复活；然后，将幽门螺杆菌接种于补充有7％去纤维蛋白羊血的哥伦比亚血琼脂中，在微需氧条件下于37℃培养36小时，收集处于对数生长期的细菌制备菌液备用。
33.本发明实施例中，测定幽门螺杆菌细胞的数量的方法为：通过将适当稀释的幽门螺杆菌细胞铺在哥伦比亚血琼脂平板上来计数存活的细菌细胞，并生长成单菌落，然后在固体培养基上进行菌落计数，通过细胞集落计数来确定存活的幽门螺杆菌细胞的数量。
34.实施例1多肽设计与合成
35.本发明实施中，根据人宿主防御素(抗菌肽)cathelicidin ll-37在酸性和胃蛋白酶水解的片段和测序及在线工具https://web.expasy.org/peptide_cutter/预测并通过质谱分析确立抗菌肽ll-37的18-26个氨基酸残基krivqrikd-nh2在酸性和胃蛋白酶存在下是稳定的，但其没有抗菌活性，根据前期本发明的大量试验发现12个氨基酸残基的肽是具有抗菌活性最短的肽。本发明实施例使用9个氨基酸残基在肽的羧基端(c-末端)补充3个氨基酸残基达到最终具有12个氨基酸残基的多肽，共设计了28条多肽，如表1所示，并且通过在线工具https://web.expasy.org/peptide_cutter/对这些多肽进行分析，通过质谱分析
这些短肽在模拟液中不会被胃蛋白酶降解。表1本发明设计的28条多肽表1本发明设计的28条多肽
36.本发明实施例中，所有多肽均由生工(上海)生物生物技术公司或强耀生物技术有限公司合成，经高效液相色谱检测纯度为95％。
37.实施例2筛选最强抗幽门螺杆菌活性多肽并命名为samp-12aa
38.本发明实施例中，检测抗幽门螺杆菌atcc43504活性最强的抗微生物多肽的具体步骤为：(1)通过上述在微需氧条件下于37℃培养幽门螺杆菌36小时获得对数生长期细菌，然后制备细菌溶液(1
×
108cfu/毫升)；(2)使用双倍稀释法用液体培养基将多肽从256μg/ml稀释到1μg/ml(在9个试管中连续稀释9次，第10个试管中没有多肽作为对照)，然后向每个试管中加入10微升细菌溶液，使得试管细菌的浓度约为106cfu/毫升；(3)然后在微需氧条件下，在37℃下以200转/分钟的速度摇动细胞培养物36小时，观察试管光学透明度，根据没有可见的混浊或细菌生长，来确定确定最小抑制浓度(mic)
39.本发明实施例中，通过倍比稀释法对实施例1设计的28个多肽对幽门螺杆菌抗幽门螺杆菌atcc43504的mic进行测定，确立抗幽门螺杆菌atcc43504活性最强的抗菌肽，结果如表2所示，这些多肽之间存在很大差异，这些多肽中抗幽门螺杆菌atcc43504活性最强的是krivqrikdvir，其mic为8μg/ml，krivqrikdvir被命名为samp-12aa。表2设计的多肽的抗幽门螺杆菌atcc43504菌株活性
40.实施例3幽门螺杆菌在人工胃液中的存活分析
41.本发明实施例中，对于幽门螺杆菌atcc43504在人工胃液中的存活分析的方法为：(1)将在微需氧气氛中于37℃在液体培养基中培养24小时的对数期幽门螺杆菌atcc43504以3000转/分钟，离心10分钟以收集细菌细胞沉淀；(2)然后将细菌细胞沉淀分成两等份，用于存活实验和用作对照，然后分别将细胞悬浮在生理盐水(pbs)作为对照组和人工胃液中作为存活实验，并将其浓度分别调节至108cfu/毫升；(3)然后在0分钟、30分钟和60分钟后，在暴露于pbs或人工胃液的不同时间点测定幽门螺杆菌atcc43504细胞的数量，结果如表3所示，幽门螺杆菌的存活率随时间而下降，幽门螺杆菌是一种微需氧细菌，高浓度的氧对它有一定的毒性作用，人工胃液对幽门螺旋杆菌的存活几乎没有影响，即表明幽门螺杆菌高度适应人工胃液。表3幽门螺杆菌atcc43504菌株在人工胃液中的存活结果
42.实施例4 samp-12aa在人工胃液中的抗幽门螺杆菌atcc43504最小抑菌和杀菌浓度及杀菌动力学
43.本发明实施例中，为了证明samp-12aa在人工胃液杀菌活性，在用生理盐水和人工胃液(实施例3的方法进行制备的)制备的液体和固体培养基中测定samp-12aa的最小抑制浓度(mic)、最小杀菌浓度(mbc)和杀菌动力学。
44.(1)samp-12aa在人工胃液中的最小抑菌浓度试验
45.本发明实施例中，samp-12aa的在人工胃液中的最小抑制浓度如实施例2所示，为8μg/ml；在生理盐水的最小抑制浓度也为8μg/ml。
46.(2)samp-12aa在人工胃液中的最小杀菌浓度试验
47.本发明实施例中，从实施例2中的samp-12aa组的澄清试管中取出5微升混合溶液，分别接种在固体琼脂培养基上；然后，将它们在微需氧条件下于37℃培养72小时。没有菌落生长的最小肽浓度是多肽samp-12aa的最小杀菌浓度(mbc)。
48.结果发现，samp-12aa在用生理盐水或人工胃液配制的液体培养基中表现出相同的抗菌活性，其mic和mbc分别为8μg/ml和32μg/ml，即说明samp-12aa的抗菌活性不受人工胃液的影响，如下表4所示。表4不同环境中幽门螺杆菌atcc43504菌株的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度介质制备最低抑菌浓度(μg/ml)最小杀菌浓度(μg/ml)生理盐水832人工胃液832
49.(3)samp-12aa在人工胃液中的杀菌动力学
50.本发明实施中，测定幽门螺杆菌暴露在samp-12aa溶液后存活细胞的数量的方法为：把106cfu/ml的幽门螺杆菌同不同浓度samp-12aa溶液温浴一定时间后测量活菌数(cfu),取不同暴露时间点的幽门螺杆菌液100μl进行10倍比连续稀释后，涂布在固体琼脂培养基上进行cfu计数，(菌落数在30和300之间为有效菌落数)。
51.本发明实施例中，为了进一步确定人工胃液是否对samp-12aa的杀菌动力学有影响，用浓度为2
×
mic、4
×
mic、8
×
mic和16
×
mic的生理盐水和人工胃液分别制备samp-12aa，并用106cfu/ml幽门螺杆菌孵育。测定在37℃下，暴露于用生理盐水和人工胃液分别制备的samp-12aa溶液0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟后活细胞的数量。结果如图1和图2所示：
52.在16μg/ml(2mic)和5分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟的暴露时间下，用生理盐水配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)10
5.8
±
0.36
,10 5.4
±
0.31
,10
3.5
±
0.32
,10 3.1
±
0.28
；用人工胃液配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)10
5.8
±
0.45
,10
5.5
±
0.36
,10 3.6
±
0.35
,10
3.2
±
0.34
(p》0.05没有显著差异)。
53.在32μg/ml(4mic)和5分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟的暴露时间下，用生理盐水配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)10
5.2
±
0.37
，10
3.5
±
0.33
，10
1.7
±
0.31
，10
0.3
±
0.37
用人工胃液配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)10
5.2
±
0.39
，10
3.7
±
0.36
，10
1.7
±
0.38
，10
0.4
±
0.34
(p》0.05没有显著差异)。
54.在64μg/ml(8mic＝2mbc)和5分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟的暴露时间下，用生理盐水配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)只有在5分钟和15分钟检测
到存活细菌数10
4.6
±
0.35
，10
2.4
±
0.39
在30分钟后没有检测到存活细菌；用人工胃液配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)只有在5分钟和15分钟检测到存活细菌数10
4.7
±
0.37
，10
4.5
±
0.31
在30分钟后没有检测到存活细菌，(p》0.05没有显著差异)。
55.在128μg/ml(16mic＝4mbc)和5分钟、15分钟、30分钟、45分钟和60分钟的暴露时间下，用生理盐水配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)只有在5分钟检测到存活细菌数10
3.3
±
0.37
在15分钟后没有检测到存活细菌；用人工胃液配制samp-12aa溶液中，幽门螺杆菌存活数(cfu)只有在5分钟检测到存活细菌数10
3.4
±
0.38
在15分钟后没有检测到存活细菌，(p》0.05没有显著差异)。
56.上述结果表明人工胃液对samp-12aa杀菌动力学的影响不明显，samp-12aa在胃液中显示出良好的抗幽门螺杆菌活性。
57.实施例5samp-12aa增加外膜的渗透性试验
58.本发明实施中，根据“多肽的抗菌机制是增强外膜通透性，破坏细胞膜的完整性时，细菌不容易对多肽产生耐药性”；和根据“幽门螺杆菌是一种具有外膜结构的革兰氏阴性细菌，细菌的外膜对药物进入细胞具有一定阻止作用，如果抗菌剂具有穿透外膜的能力，会比不能穿透外膜的情况有更好的杀菌效果；1-n-苯基萘胺(1-n-phenylnaphthylamine，npn)在水溶液中显示出比在疏水环境中更弱的荧光，如果samp-12aa具有增强幽门螺杆菌外膜渗透性的能力，npn探针从溶液进入细菌细胞壁(外膜)疏水环境这时npn荧光强度将增加。”的原理设计试验。
59.本发明实施例中，幽门螺杆菌atcc43504细胞悬浮液的制备方法为：(1)通过以5000
×
g离心10分钟50毫升对数生长期幽门螺杆菌细胞来收集细胞沉淀；(2)然后在用缓冲液洗涤三次后，将细胞沉淀悬浮在hepes钠缓冲液(ph 7.2)中；(3)然后将悬浮细胞的光密度值在od
600
下调节至0.5备用。
60.本发明实施中，制备浓度为4、8、16、32和64μg/ml的samp-12aa溶液；4毫升每个不同浓度的测试样品含有：1毫升samp-12aa溶液，2毫升幽门螺杆菌atcc43504细胞悬浮液和1毫升40mm npn；同时4毫升对照样品含有：1毫升不含肽的hepes缓冲液、2毫升幽门螺杆菌atcc43504细胞悬浮液和1毫升40mm npn。
61.本发明实施例中，使用以疏水性1-n-苯基萘胺(npn)为荧光探针的荧光分光光度计(f4600，hitachi，tokyo，japan),使用350nm激发波长和420nm发射波长，从开始到荧光密度不再增加，以30秒的间隔测量荧光强度的方法，测试samp-12aa对幽门螺杆菌atcc43504外膜通透性的影响。测试结果如图3所示，当幽门螺杆菌悬浮液含有samp-12aa时，npn的荧光强度明显增强，并且荧光的增强表现出剂量依赖性，且不同浓度的samp-12aa可以不同程度增加膜的通透性，如荧光强度随时间的变化所示(当npn穿透幽门螺杆菌外膜的疏水环境时，荧光强度增加)，即证明了由于samp-12aa对外膜的作用使得samp-12aa具有增强幽门螺杆菌外膜渗透性的能力。
62.实施例6 samp-12aa破坏细胞膜的完整性试验
63.本发明实施例中，根据“碘化丙啶(pi)可以进入死细胞，但不能进入活细胞；pi进入细胞后，与dna结合，发出荧光；即如果samp-12aa可以破坏细菌细胞膜的完整性，导致细胞死亡，就会产生荧光”的原理设计试验，试验结果可以使用直观可视的方法来证明samp-12aa是否破坏了幽门螺杆菌细胞内膜的完整性并导致细菌死亡，当细胞死亡时，促进pi的
吸收，会产生荧光。
64.本发明实施例中，为了确定samp-12aa是否破坏幽门螺杆菌atcc43504细胞膜的完整性，在充分混合后，使用下列方法进行测试：(1)将含有1ml幽门螺杆菌细胞悬浮液(按照实施例5的制备方法制备)、1ml 16μg/ml samp-12aa多肽和2ml 100μm碘化丙啶(pi)的4ml测试样品和含有1ml幽门螺杆菌细胞悬浮液(按照实施例5的制备方法制备)、1ml pbs缓冲液(ph＝7.2)和2ml 100μm碘化丙啶(pi)的4ml对照样品分别在室温下避光保存90分钟；(2)使用荧光共焦显微镜(lsm 710meta,zeiss,jene,gemany)在535nm激发波长和615nm发射波长下观察荧光。结果如图4所示，其中幽门螺杆菌与作为对照的pbs一起孵育结果如a所示，其没有观察到荧光点，表明pi不能被细胞吸收；然而，当幽门螺杆菌与samp-12aa孵育时结果如b所示，其有明显的荧光点，表明pi可以进入细胞并与dna结合。即samp-12aa具有破坏细菌细胞膜完整性的能力，因此具有杀菌功效。samp-12aa的这种杀菌机制不容易诱导耐药性。
65.实施例7 samp-12aa抗菌时自身不会诱导耐药性试验
66.本发明实施例中，使用幽门螺杆菌菌株atcc43504在体外探索samp-12aa肽在抗菌同时不会诱导耐药性。以甲硝唑、阿莫西林和克拉霉素是临床上用于治疗幽门螺杆菌感染的常规抗生素作阳性对照。根据实施例2的方法确定samp-12aa和抗生素的最小抑菌浓度(mic)。
67.本发明实施中，按照以下方法进行耐药性分析：(1)将处于指数生长期的幽门螺杆菌在微需氧条件下在含有亚抑菌浓度的抗不同抗菌物质的培养基中孵育36小时，然后离心收集显示出近50％生长抑制活性的细胞；(2)用新鲜培养基将细胞进一步稀释并调节至105cfu/毫升的浓度，并再次培养，直到达到15次类似的连续培养；不含抗微生物剂的培养基用作阴性对照；(3)评估幽门螺杆菌连续暴露于亚抑菌浓度的抗菌物后的mic的变化，如果每代的相对mic增加，则结果表明该药物诱导了耐药菌株的产生。
68.本发明实施例中，每次传代的相对mic通过计算mic与给定传代培养的测量值的比值来确定，该比值与从第一次暴露获得的值相比较；即在15次连续传代后，相对mic是给定传代培养获得的mic与首次暴露获得的mic的比值。
69.本发明实施例中，为了确定抗生素抗性幽门螺杆菌菌株是否对samp-12aa敏感，根据上述耐药性分析的方法检测了samp-12aa对抗性菌株的mic，从三次分析中处理统计数据。结果如图5所示，samp-12aa没有诱导幽门螺杆菌产生抗性；samp-12aa对幽门螺杆菌的相对mic在连续15次传代培养中保持稳定；然而，治疗幽门螺杆菌感染的一线抗生素不同程度地诱导了幽门螺杆菌对它们的耐药性。幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药性在重复给药后尤其明显。甲硝唑对幽门螺杆菌的mic增加了35倍，其次是克拉霉素，其对幽门螺杆菌的mic增加了16倍。幽门螺杆菌诱导了对阿莫西林的耐药性，其对幽门螺杆菌的mic增加了6倍。而且对抗生素有抗性的幽门螺杆菌菌株仍然对samp-12aa敏感。结果表明samp-12aa可用于治疗耐药幽门螺杆菌感染。
70.实施例8 samp-12aa的治疗指数试验
71.本发明实施例中，根据“如果抗菌多肽药物具有原核选择性，表现出最佳的抗菌活性并杀死细菌细胞而不杀死哺乳动物细胞，则该肽药物将具有良好的治疗潜力和相对的临床安全性。治疗指数(ti)反映了多肽的原核选择性。”设计试验。
72.本发明实施例中，通过计算针对六种不同幽门螺杆菌菌株(幽门螺杆菌43504(nctc11637)，幽门螺杆菌700392(26659)，幽门螺杆菌ss1atcc 63629(nctc 11639)，幽门螺杆菌ss1，幽门螺杆菌胃溃疡临床菌株，幽门螺杆菌胃癌临床菌株)获得的最小溶血浓度(mhc)值与mic值的几何平均值(gm)的比值来确定多肽的治疗指数(ti)；最小溶血浓度(mhc)被确定为多肽可以诱导10％溶血的浓度；治疗指数(pi)计算为mhc(μg/ml)与gm(μg/ml)的比值。
73.本发明实施例中，samp-12aa的溶血活性按照下列步骤确定：(1)使用1000
×
g离心7分钟的方法收集新鲜人血液以获得人红细胞(hrbcs)，然后用pbs(43mm na2hpo4、11mm kh2po4和80mm nacl)仔细并充分洗涤hrbcs 3次；(2)使用上述重新悬浮在pbs中的hrbc制备4％(w/v)hrbc悬浮液；(3)用从512μg/ml到32μg/ml的两倍系列稀释液制备五种不同浓度的samp-12aa，然后将250μl不同浓度的samp-12aa和250μl 4％w/v hrbc悬浮液加入到相同的0.5ml离心管中，充分混合；以同样的方式，将不含samp-12aa的250μl pbs和250μl 4％w/v hrbc悬浮液加入到相同的0.5ml离心管中作为阴性对照，然后将250μl的0.1％triton x-100和250μl的4％w/v hrbc悬浮液加入到与阳性对照相同的0.5ml离心管中。(4)所有混合物在37℃水浴中孵育1小时，然后以1000
×
g离心5分钟，从每个离心管中收集200微升上清液，然后添加到96孔板的孔中；(5)使用酶标仪在414nm处测量上清液的吸光度。
74.本发明实施例中，pbs的吸光度值(a
pbs
)被鉴定为零溶血，将0.1％(v/v)triton x-100-裂解的hrbcs的上清液的吸光度值(a
triton
)确定为100％溶血；samp-12aa的溶血活性根据以下公式计算为溶血的百分比:samp-12aa溶血(％)＝(a
sample-a
pbs
)/(a
triton-a
pbs
)
×
100。最小溶血浓度值(minimal hemolytic concentration)以mhc表示。
75.本发明实施例中，为了准确测定肽对六种不同幽门螺杆菌菌株的mic，samp-12aa以1μg/ml的增量从4μg/ml稀释至12μg/ml，根据实施例2的方法确定mic，由samp-12aa对不同幽门螺杆菌菌株的mic的几何平均数值【geometric mean(gm)of mic】值以gm表示。
76.本发明实施例中，按照上述方法计算samp-12aa的gm、mhc和ti值如表4所示。结果表明samp-12aa比所评价的抗生素具有更强的抗菌特异性；samp-12aa的溶血浓度达到216μg/ml，为低溶血活性(高mhc)。mic为8.5μg/ml，表明抗菌活性高(gm低)。因此，抗菌肽samp-12aa是治疗幽门螺杆菌感染的理想抗菌剂。表5治疗指标(ti)of samp-12aa
77.实施例9 samp-12aa的细胞毒性研究
78.本发明实施中，使用人胃腺癌细胞(atcc；crl-1739)用于测定samp-12aa的细胞毒性。
79.本发明实施例中，使用标准mtt增殖试验来确定samp-12aa对crl-1739细胞的细胞毒性，即通过测量不溶的蓝紫色结晶甲臜来评估，这种底物只能在活细胞中产生，其中线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原外源mtt，而死细胞没有这种功能；具体步骤为：
80.(1)crl-1739细胞在rpmi-1640培养基中培养3-5天，所述培养基补充有在5％co2中的10％胎牛血清。
81.(2)通过胰蛋白酶消化处理贴壁细胞以形成分散的单细胞，然后在1000
×
g离心4分钟后收集细胞沉淀。用含10％胎牛血清的培养基制备1
×
105细胞/ml的细胞悬液。
82.(3)然后将200μl细胞悬浮液添加到96孔板的每个孔中，并且将板在37℃下在5％co2中培养24小时以形成附着的细胞。
83.(4)将40微升samp-12aa溶液添加到孔中，该溶液用rpmi-1640培养基从256μg/ml连续2倍稀释到16μg/ml。仅含有40μl rpmi-1640培养基且不含samp-12aa的孔用作对照。将平板进一步培养48小时。
84.(5)然后将20μl 5mg/ml mtt加入每个孔中，并仔细彻底混合。将平板在37℃下孵育4小时。小心地去除每个孔的上清液。
85.(6)然后，向每个孔中加入150μl二甲基亚砜(dmso),以溶解mtt产生的不溶性蓝紫色结晶甲臜。微孔板elisa读数器用于测量溶解的完全甲晶体在550nm的吸光度。
86.本发明实施例中，使用以下公式计算crl-1739细胞存活率:survival(存活率)(％)＝(a550 of samp-12aa-treated cells(处理过细胞)/a550 of samp-12aa-untreated cells(未处理细胞))
×
100。
87.本发明实施例中，按照上述方法评估samp-12aa对人胃腺癌细胞(atcc；crl-1739)的细胞毒性，结果如图6所示，结果表明samp-12aa在128μg/ml时对crl-1739细胞无毒，并且在该浓度下有超过90％的活细胞。结果表明samp-12aa由于其对真核细胞的低毒性而成为开发和应用于治疗幽门螺杆菌感染的良好候选物。
88.实施例10 samp-12aa对幽门螺杆菌在小鼠胃中清除率试验
89.本发明实施中，samp-12aa纳米粒按照专利201410485607.3(专利名称：抗幽门螺杆菌活性抗菌肽胃黏膜纳米粒给药系统制备方法)中公开的技术方案进行制备。
90.本发明实施例中，使用幽门螺杆菌ss1菌株建立了幽门螺杆菌感染的动物模型。小鼠随机分成10组(每组中的8只)禁食24小时后，灌胃0.3毫升含108cfu幽门螺杆菌的bih肉汤。接种后14天(每组取2只，通过显微镜检查、氧化酶试验、过氧化氢酶试验和脲酶试验验证模型建立成功)，用samp-12aa和samp-12aa纳米粒以1、3、10或30mg/kg体重的剂量口服给药，每天一次，连续三天。以同样的方式口服安慰剂粘膜粘附纳米颗粒作为对照。最后一次给药后一天，在麻醉下对小鼠实施安乐死，用组织匀浆器将胃在1.5ml bhi肉汤中匀浆。使用微生物培养方法确定幽门螺杆菌的根除。将剩余的匀浆连续稀释10倍，均匀涂抹在补充有7％羊血和上述抗生素的bhi琼脂平板上。将平板在微需氧条件下于37℃孵育4天。通过对琼脂平板上的细菌菌落进行计数来确定幽门螺杆菌细菌的数量。
91.然后，通过显微镜检查、氧化酶试验、过氧化氢酶试验和脲酶试验进一步鉴定细菌。通过计数每个平板上的菌落来计算每个小鼠胃中的细菌菌落数，并表示为每个胃样品的对数cfu。结果如表6所示。表6比较服用samp-12aa和samp-12aa纳米颗粒粘膜给药系统对小鼠胃中幽门螺杆菌清除效果注：nd：not detected(没有检测到)
92.如表6显示了小鼠胃中的平均细菌计数，未接受药物的对照组小鼠，以及每个小鼠胃中平均约10
7.57
(cfu/胃)个细菌菌落。用口服samp-12aa治疗的小鼠胃中的平均细菌计数随着剂量的增加而减少，但是没有观察到完全清除，即使是30mg/kg的最高剂量。但服用samp-12aa制备的胃黏膜纳米粒对幽门螺杆菌的清除明显增强，在口服10mg/kg剂量时就把胃中幽门螺杆菌完全清除。
93.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技
术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。