水稻粒形调控蛋白HOS59及其编码基因和应用

水稻粒形调控蛋白hos59及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及水稻粒形调控蛋白hos59及其编码基因和应用。


背景技术：

2.水稻是世界上是重要的粮食作物之一，曾养育了世界半数以上的人口。水稻面临着需求增加和耕地减少的现实问题，这对农作物单产提升提出了极大的要求。此外，根据预测，由于气候变化世界主要粮食作物水稻、小麦和玉米预计将遭受大量减产。这对于水稻的环境适应性同样提出了很高的要求。在此要求下，水稻高产基因的挖掘对于实现水稻生产的“高产、优质、高效、生态、安全”的目标具有重要意义。
3.水稻粒型是水稻产量和稻米品质的一个重要指标，目前已有许多相关基因被克隆。但水稻粒型是一个复杂的调控过程，想要全面系统的阐释水稻粒型的调控机制，仍有待遇更多的功能基因的挖掘和鉴定。
4.在开花植物中，结节状同源盒基因(knox)家族基因编码含有同源异形盒结构域的转录因子，存在于所有绿色植物中。基于序列相似性、表达模式和系统发育分析，knox家族分为两个亚类，knoxi亚类和knoxii亚类。knoxi亚类基因在茎尖分生组织中特异性表达，在侧器官原基中未检测到。目前已经发现拟南芥中的knoxii亚类基因knat3参与调控aba反应，其在小麦中的直系同源基因lrd调节水分胁迫期间的根生长。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何调控植物籽粒的粒型和/或如何调控植物籽粒的长度。
6.为了解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的应用。
7.所述应用可为下述任一种：
8.p1、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控或提高植物籽粒长度中的应用；
9.p2、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控或提高植物籽粒表皮细胞长度中的应用；
10.p3、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物单株产量数或增加植物单株产量中的应用；
11.p4、所述蛋白质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种或品质改良中的应用；
12.所述蛋白质可为如下a1)、a2)、a3)、a4)或a5)的蛋白质：
13.a1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；
14.a2)氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质；
15.a3)氨基酸序列是序列表中序列9的蛋白质；
16.a4)将a1)、a2)或a3)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)、a2)或a3)衍生的或与a1)、a2)或a3)所示的蛋白质具有70％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
17.a5)在a1)、a2)、a3)或a4)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
18.上文所述蛋白质可来源于水稻。
19.上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。
20.上述应用中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质的编码基因的物质和/或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质。
21.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
22.上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
23.所述基因敲除(gene knockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
24.所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活,包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
25.上述应用中，所述调控基因表达的物质可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
26.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
27.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
28.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
29.上述应用中，所述70％以上的同一性可为至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。
30.为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上文所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
31.q1、所述生物材料在调控或提高植物籽粒长度中的应用；
32.q2、所述生物材料在调控或提高植物籽粒表皮细胞长度中的应用；
33.q3、所述生物材料在调控植物单株产量数或增加植物单株产量中的应用；
34.q4、所述生物材料在植物育种或品质改良中的应用。
35.所述生物材料可为下述b1)至b9)中的任一种：
36.b1)编码上文所述蛋白质的核酸分子；
37.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
38.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
39.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
40.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
41.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
42.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官；
43.b8)抑制或降低上文所述蛋白质的编码基因表达或上文所述蛋白质活性的核酸分子；
44.b9)含有b8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
45.上文所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：
46.b1)编码序列是序列表中序列1所示的dna分子；
47.b2)编码序列是序列表中序列8所示的dna分子；
48.b3)编码序列是序列表中序列10所示的dna分子；
49.b4)与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质的dna分子；
50.b5)在严格条件下与b1)、b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质的dna分子；
51.b6)在严格条件下与b1)、b2)、b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质的dna分子。
52.上文b8)所述核酸分子可为表达靶向上文a1)所述蛋白编码基因的grna的dna分子或靶向上文a1)所述蛋白编码基因的grna。
53.所述靶向上文a1)蛋白编码基因的grna的靶序列可如序列表序列1的第801-820位的核苷酸和/或序列表序列1的第711-730位核苷酸所示。
54.术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件
进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述具有90％或90％以上同一性可为至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％的同一性。
55.上述生物材料中，b2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
56.可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。
57.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
58.上文所述植物可为下述任一种：
59.d1)双子叶植物；
60.d2)单子叶植物，
61.d3)禾本目植物，
62.d4)禾本科植物，
63.d5)稻属植物，
64.d6)水稻。
65.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种增加植物籽粒长度和/或增加植物籽粒表皮细胞长度和/或增加植株单株产量的方法，包括通过抑制或降低植物中上文中a1)所述的蛋白质的编码基因的表达量或上文中a1)所述的蛋白质的活性来增加植物籽粒长度和/或增加植物籽粒表皮细胞长度和/或增加植株单株产量。
66.上述降低或抑制植物中上文所述蛋白编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、rnai、基因组定点编辑或同源重组等。
67.上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,zfn)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,talen)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr associated,crispr/cas9 system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的外显子或5’utr等作为靶标。
68.上文所述方法还可包括向所述植物中导入降低或抑制上文所述蛋白质编码基因表达的物质；所述降低或抑制上文所述蛋白质编码基因表达的物质可为如下c1)-c4)任一种物质：
69.c1)抑制或降低上文所述蛋白编码基因表达的核酸分子；
70.c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
71.c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
72.c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或
含有c3)所述重组载体的重组微生物。
73.上文所述方法中的蛋白具体可为上文a1)中所述的蛋白质。上文c1)所述的核酸分子可为表达靶向上文所述a1)蛋白编码基因的grna的dna分子或靶向上文所述a1)蛋白编码基因的grna；
74.所述靶向上文所述a1)蛋白编码基因的grna的靶序列可如序列表中序列1的第801-820位核苷酸所示和序列表中序列1的第711-730位核苷酸所示。
75.上文所述方法具体可为通过crispr/cas9方法对上文所述a1)蛋白编码基因进行定点编辑，使植物中的上文所述a1)蛋白编码基因的表达量降低或被抑制，例如将表达cas9蛋白和grna的重组质粒载体通过农杆菌的侵染实现外源基因向植物细胞的转移和整合。
76.上文所述抑制或降低植物中上文所述的a1)蛋白质的编码基因的表达可为将植物基因组中的序列2所示的所述a1)蛋白编码基因进行下述至少一种突变：
77.1)在序列表中序列1的第817和818位核苷酸之间插入了1个核苷酸t；
78.2)缺失了序列表中序列1的第724-727位的4个核苷酸aact。
79.上文所述方法中所述的蛋白质可为上文所述a1)中的蛋白质。
80.上述方法为改造后得到的植物可以是所有染色单体均被定点编辑的植物。
81.上文所述植物可为水稻。
82.上文所述的蛋白质和/或上文所述的生物材料也属于本发明的保护范围。
83.本发明发现hos59在水稻发育过程尤其是对于籽粒形状起着重要的调控作用。本发明通过设计的靶点对hos59基因进行编辑，实验证明，在成熟期的水稻中，hos59基因编辑株系的籽粒粒长和籽粒表皮细胞较野生型水稻日本晴明显变长；而在hos59转基因过表达株系中，籽粒粒长和籽粒表皮细胞较野生型明显变短。对hos59的研究将有助于增加植物新的粒形调控方面基因资源；在实际生产中，通过调控hos59可以对水稻籽粒性状进行调控，进而培育新的高产品种。
附图说明
84.图1为crispr/cas9基因编辑载体bgk03靶点序列信息和基因编辑株系突变形式。其中，target1和target2分别代表设计的位于hos59基因两个编辑位点，grna代表引导rna，pam代表前间隔序列邻近基序。
85.图2为重组载体pchf3-hos59的t-dna区结构示意图。其中，lb和rb分别代表t-dna的左臂和右臂，rbcs term代表水稻rubpcase小亚基基因终止子，35s promoter代表花椰菜花叶病毒35s启动子，kanr代表卡那霉素抗性基因，spect代表壮观霉素抗性基因。
86.图3为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系中hos59基因相对表达量结果。
87.图4为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期植株情况。
88.图5为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒情况。
89.图6为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒长度测量结果情况。***代表p《0.001。
90.图7为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒宽度测量结果情况。
91.图8为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒厚度测量结果情况。
92.图9为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒表皮细胞电镜观察结果情况。
93.图10为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒表皮细胞长度测量结果情况。***代表p《0.001
94.图11为t3代纯合hos59基因编辑株系、野生型和hos59过表达株系成熟期籽粒表皮细胞宽度测量观察结果情况。
具体实施方式
95.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
96.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
97.实施例1、通过控制水稻中hos59基因水平调控水稻粒宽和粒长
98.1、crispr-cas9重组质粒的构建
99.水稻knox家族knoxii亚类蛋白hos59由317个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为序列表中序列2所示。hos59基因的全长cds序列如序列表中序列1所示。
100.在hos59基因的cds区寻找前间隔序列邻近基序，并设计靶向hos59基因的两条引导rna序列grna1和grna2，grna1靶点(hos59-靶点1)的核苷酸序列为5
’‑
ggacaaggctcgcttggtgc-3’，对应于序列表中序列1的第801-820位；grna21靶点(hos59-靶点2)的核苷酸序列为5
’‑
ggaagagctggaaaactccc-3’，对应于序列表中序列1的第711-730位。
101.在靶点序列上添加接头设计获得引物对hos59-t1f/hos59-t1r和引物对hos59-t2f/hos59-t2r。其中引物对hos59-t1f/hos59-t1r经体外变性退火形成引物二聚体得到grna1的编码dna对应的双链dna片段；引物对hos59-t2f/hos59-t2r经体外变性退火形成引物二聚体得到grna2的编码dna对应的双链dna片段。
102.利用t4 dna连接酶分别将grna1的编码dna对应的双链dna片段和grna2的编码dna对应的双链dna片段与用bsai酶切的crispr-cas9载体bgk03载体(中科院遗传与发育生物学研究所储成才实验室惠赠，相关文献：yuming lu,xiao ye,renming guo,jing huang,wei wang,jiuyou tang,longtao tan,jian-kang zhu,chengcai chu,yangwen qian.genome-wide targeted mutagenesis in rice using the crispr/cas9 system.molecular plant,2017,volume 10,issue 9,pages 1242-1245.)得到的线性化后的载体片段连接，获得最终crispr-cas9重组质粒bgk03-hos59-t1和bgk03-hos59-t2。
103.hos59-t1f：5
’‑
tgtgtggacaaggctcgcttggtgc-3’(序列表序列3所示)
104.hos59-t1r：5
’‑
aaacgcaccaagcgagccttgtcca-3’(序列表序列4所示)
105.hos59-t2f：5
’‑
tgtgtggaagagctggaaaactccc-3’(序列表序列5所示)
106.hos59-t2r：5
’‑
aaacgggagttttccagctcttcca-3’(序列表序列6所示)
107.2、水稻hos59基因的获得
108.取正常生长2周的日本晴水稻的植株，利用trizol试剂提取总rna，并以总rna为模板，使用m-mlv反转录酶进行反转录得到cdna，再以此cdna为模板，使用引物hos59-cds-pf和引物hos59-cds-pr，进行pcr扩增得到pcr产物，将获得的pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化954bp左右的dna片段，对该片段进行测序，结果表明，该dna片段含有序列表中序列1的第1—954位核苷酸所示的hos59基因cds序列。
109.引物hos59-cds-pf：5
’‑
gctctagaatggcgttccactaccagga-3’(带下划线碱基为限制性内切酶xbai识别位点及保护碱基)；
110.引物hos59-cds-pr：5
’‑
ggggtaccttagaagtccacgacacgata-3’(带下划线碱基为限制性内切酶kpni识别位点及保护碱基)。
111.3、水稻hos59基因重组表达载体的构建
112.取步骤2回收并纯化的954bp左右的dna片段，用限制性内切酶xbai和kpni进行双酶切，与经xbai和kpni双酶切的载体pchf3的骨架片段连接，获得重组表达载体pchf3-hos59，经测序证实，重组表达载体pchf3-hos59为将载体pchf3的xbai和kpni酶切识别位点间的小片段替换为序列表中序列1第1—954位核苷酸，并保持pchf3载体的其它核苷酸不变得到的重组载体。其t-dna区结构示意图如图2所示。
113.4、重组农杆菌的获得
114.取步骤1制备得到的crispr-cas9重组质粒载体bgk03-hos59-t1和bgk03-hos59-t2分别转化农杆菌gv3101的感受态细胞，28℃于含50μg/ml卡纳霉素和50μg/ml利福平的yeb固体培养中筛选培养；得到阳性克隆即为含有基因编辑载体bgk03-hos59-t1或bgk03-hos59-t2的重组农杆菌，分别命名为gv3101/bgk03-hos59-t1和gv3101/bgk03-hos59-t2。
115.取步骤2制备得到的重组表达载体pchf3-hos59转化农杆菌gv3101的感受态细胞，28℃于含100μg/ml壮观霉素和50μg/ml利福平的yeb固体培养中筛选培养；挑取筛选阳性单克隆提质粒，用步骤2中的引物hos59-cds-pf和引物hos59-cds-pf进行pcr检测得到阳性克隆即为含有重组表达载体pchf3-hos59的重组农杆菌，命名为gv3101/pchf3-hos59。
116.5、重组农杆菌转化水稻愈伤
117.1)使用水稻日本晴成熟胚培养诱导愈伤。将去除颖壳的水稻饱满种子用70％(v/v)乙醇清洗1分钟，无菌水冲洗3次，然后用2.5％(v/v)的次氯酸钠溶液消毒45分钟，再用灭菌水漂洗5次后播种于nb培养基上诱导愈伤组织，每两周在nb培养基上继代一次，直到获得表面光滑、致密和色泽淡黄的胚性愈伤组织用于转基因。
118.2)重组农杆菌培养。将重组农杆菌gv3101/bgk03-hos59-t1和gv3101/bgk03-hos59-t2依照抗生素抗性接种于含浓度卡那霉素(50mg/l)(基因编辑载体)与利福平(50mg/l)液体yep培养基和gv3101/pchf3-hos59农杆菌依照抗生素抗性接种于含壮观霉素(50mg/l)(过表达载体)与利福平(50mg/l)的液体yep培养基中，28℃振荡培养至od
600nm
值为0.8-1.0。5,000rpm离心10分钟收集菌体，然后用含有100μm的乙酰丁香酮的农杆菌浸染液重悬重组农杆菌菌体至od
600nm
值约为1，分别得到三种重组农杆菌浸染液。
119.3)农杆菌浸染。分别使用三种重组农杆菌浸染液侵染水稻愈伤组织的步骤如下：将步骤1)得到的生长良好的愈伤组织与重组农杆菌浸染液共培养2分钟，期间不时的晃动。
然后用无菌滤纸吸干愈伤组织表面菌液，转移愈伤组织至含有多层无菌滤纸的培养皿中，22℃条件下暗培养2-3天，随后将gv3101/bgk03-hos59-t1重组农杆菌和gv3101/bgk03-hos59-t2重组农杆菌侵染后的愈伤组织转入含有潮霉素(50mg/l)和羧苄青霉素(100mg/l)，gv3101/pchf3-hos59重组农杆菌侵染后的愈伤组织转入含有卡纳霉素(50mg/l)和羧苄青霉素(100mg/l)的nb培养基上进行筛选。
120.4)抗性愈伤组织的筛选及植株再生。每周更换一次选择培养基，经过约四轮连续的潮霉素(基因编辑植株)或卡那霉素(过表达植株)抗性筛选后，将生长旺盛、致密的抗性愈伤组织转移至分化培养基上。先28℃暗培养3-5天，然后转入正常光照条件下培养，大约生长4周后再生出水稻幼苗。转移至生根培养基上生根壮苗，大约生长20天后，敞开培养瓶培养2-3天，分别得到t0代crispr-cas9重组质粒转基因水稻小苗和t0代转重组表达载体转基因水稻小苗，随后移栽到温室或者大田。
121.6、t0代水稻转基因株系的鉴定
122.6.1 t0代水稻基因编辑植株突变类型的分子鉴定
123.取t0代crispr-cas9重组质粒转基因水稻小苗植株的叶片，利用ctab法提取总dna，并以总dna为模板，使用鉴定引物hos59-identf和hos59-identr进行pcr扩增，然后对扩增产物进行测序。查看测序序列与水稻日本晴参考基因组(tigr 7)进行比对，查看其突变形式。选择hos59基因被成功编辑的植株继续种植，得到t0代植株种子后再次种植得到t1代植株，并提取dna并测序鉴定，得到纯合t1代转基因植株。将t1代植株种子继续种植后得到纯合t2代转基因植株，对t2代植株继续提取dna并测序鉴定，确定编辑植株稳定遗传。将编辑植株稳定遗传t2代植株种子继续种植后得到纯合的t3代转基因植株，将得到的纯合的t3代基因编辑株系种子进行潮霉素筛选，选取两个不带有潮霉素抗性的纯合的基因编辑株系(基因编辑1株系和基因编辑2株系)进行后续实验。两个基因编辑株系hos59基因编辑情况示意图如图1所示。
124.hos59-identf：5
’‑
tgctgtgccagttccgttta-3’(序列11)
125.hos59-identr：5
’‑
gctttggccccttaatgctg-3’(序列12)
126.图1的结果表明：hos59基因编辑株系中hos59基因被编辑。基因编辑1株系与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中hos59的基因发生了突变：两条同源染色体中，基因编辑1株系在hos59基因中存在1个核苷酸的插入(即在序列表中序列1的第817位-818位核苷酸后插入了“碱基t”)，造成hos59蛋白移码，翻译提前终止，只能翻译出284个氨基酸，从而将hos59基因敲除。基因编辑1突变体中突变后的hos59-t1蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列7所示，其编码序列如序列8所示。
127.基因编辑2株系与野生型水稻日本晴相比，水稻基因组中hos59的基因发生了突变：两条同源染色体中，hos59基因中发生了“aact”4个核苷酸的缺失(即缺失了序列表中序列1的第724位-727位的核苷酸)，造成hos59蛋白移码，翻译提前终止，只能翻译出249个氨基酸，从而将hos59基因敲除。基因编辑2突变体中突变后的hos59-t2蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列9示，其编码序列如序列10示。
128.6.2 t0代水稻过表达株系的鉴定
129.取t0代重组表达载体转基因水稻小苗植株的叶片，利用ctab法提取总dna，并以总dna为模板，使用鉴定引物hos59oe-identf和hos59oe-identr进行pcr扩增鉴定，得到阳性
hos59过表达株系。选择hos59过表达株系植株继续种植，得到t0代植株种子后再次种植得到t1代植株，并提取dna并进行pcr扩增鉴定。将t1代阳性植株种子继续种植后得到纯合t2代转基因植株，并提取dna并进行pcr扩增鉴定。将t2代阳性植株的种子进行潮霉素筛选，发芽率为高于90％的株系植株即为t3代纯合hos59过表达株系。
130.hos59oe-identf：5
’‑
gtgctcgacgttgtcactgaag-3’(序列13)
131.hos59oe-identr：5
’‑
tcttcagcaatatcacgggtagcca-3’(序列14)
132.7、转基因水稻株系的实时荧光定量rt-pcr鉴定
133.取同一正常培养环境中生长两周的、经步骤6鉴定为阳性的纯合过表达株系、纯合基因编辑株系(基因编辑1株系和基因编辑2株系)和野生型水稻日本晴幼苗，用trizol试剂分别提取总rna，licl沉淀纯化后测定浓度及od260/280和od260/230值，严格定量后进行反转录，稀释得到浓度为2ng/μl的cdna，再以此cdna为模板，以hos59基因特异引物hos59q-fp和hos59q-rp为引物进行实时荧光定量pcr扩增，分析各株系植株内hos59基因的表达情况，以18srna为内参基因，引物为18s-f和18s-r。实时荧光定量pcr在abi7000实时荧光定量pcr仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用livak kj和schmittgen td(2001)报道的方法，即2-δδct
计算相对表达量。
134.δδc
t
＝(c
t.target
－c
t.18s
)
time x
－(c
t.target
－c
t.18s
)
time 0
135.time x表示任意时间点，time0表示经18s校正后1倍量的目标基因表达。
136.hos59基因的特异引物序列如下：
137.hos59q-fp：5'-caggaaacagggttgcaact-3'(序列15)；
138.hos59q-rp：5'-ggatgaagcaggattgctgt-3'(序列16)；
139.扩增产物序列为序列表序列1的第820-906位；
140.18srna基因的特异引物序列如下：
141.18s-f:5'-cggctaccacatccaaggaa-3'；
142.18s-r:5'-tgtcactacctccccgtgtca-3'。
143.图3的结果表明：hos59基因编辑株系(图3中基因编辑1和基因编辑2所示)的hos59基因相对表达量明显低于野生型，hos59过表达株系(图3中过表达1所示)的hos59基因相对表达量明显高于野生型。
144.8、田间籽粒性状观察
145.将野生型水稻日本晴以及纯合的基因编辑株系和纯合的过表达株系植株的种子各100粒在北京上庄大田进行种植(6月到10月)，采用随机区组设计，3次重复，处理小区面积为40m2(20m
×
2m)。观察植株表型(如图4所示)；同时观察并统计成熟后的不同株系的籽粒表型(如图5)，对籽粒的长度(如图6和表1所示)，籽粒的宽度(如图7和表2所示)和厚度(如图8和表3所示)进行测量并统计。粒长、粒宽和粒厚测量方法为：选取生长状态相近的植株籽粒，晾干后使用游标卡尺对籽粒长度、宽度和厚度进行测量。每个株系选取4个植株，每个植株随机选择10粒种子。
146.观察和统计结果表明：水稻转基因株系和野生型植株在籽粒长度表型上存在显著差异，hos59基因编辑株系籽粒(图6和表1中基因编辑1和基因编辑2所示)的长度较野生型明显变长(p《0.001)，hos59基因过表达株系籽粒(图6和表1中过表达1所示)的长度较野生型明显变短(p《0.001)。hos59基因编辑植株和过表达植株的籽粒宽度、籽粒厚度与野生型
水稻植株相比无显著差异。
147.表1.hos59相关株系的籽粒长度测量结果(单位：毫米)
148.株系平均值
±
标准差基因编辑18.004
±
0.03377基因编辑27.655
±
0.03563野生型7.198
±
0.03256过表达16.8438
±
0.07122
149.表2.hos59相关株系的籽粒宽度测量结果(单位：毫米)
[0150][0151][0152]
表3.hos59相关株系的籽粒厚度测量结果(单位：毫米)
[0153]
株系平均值
±
标准差基因编辑12.2083
±
0.01473基因编辑22.1923
±
0.02421野生型2.1791
±
0.01700过表达12.1993
±
0.01556
[0154]
9、籽粒表皮细胞扫描电子显微镜观察
[0155]
取野生型水稻日本晴的籽粒以及纯合的基因编辑株系和纯合过表达株系植株的籽粒，使用tm-4000扫描电子显微镜(日本日立公司)观察籽粒表皮细胞形态(如图9所示)。同时使用imagej软件测量对籽粒表皮细胞的长度(如图10和表4所示)与宽度(如图11和表5所示)进行测量和统计。不同株系的籽粒细胞的长度和宽度测量均包含来自不同植株共100个重复(每个株系选取10个植株，每个植株随机选择10粒种子)。观察和统计结果表明：hos59基因基因编辑株系籽粒表皮细胞长度(图9、图10和表4中基因编辑1和基因编辑2所示)较野生型明显变长(p《0.001)，过表达株系籽粒表皮细胞长度(图9、图10和表4中过表达1所示)较野生型明显变短(p《0.001)。而在籽粒表皮细胞宽度表型上，转基因株系和野生型不存在显著差异(图9、图11和表5)。
[0156]
表4.hos59相关株系的籽粒表皮细胞长度测量结果(单位：微米)
[0157]
株系平均值
±
标准差基因编辑199.7806
±
1.83572基因编辑288.1082
±
1.49501野生型78.9073
±
1.25468过表达170.2834
±
1.12643
[0158]
表5.hos59相关株系的籽粒表皮细胞宽度测量结果(单位：微米)
[0159]
株系平均值
±
标准差
基因编辑170.1478
±
0.59288基因编辑269.9972
±
0.75410野生型68.8913
±
0.58888过表达167.1197
±
0.95311
[0160]
综上所述，hos59基因表达量的降低或hos59蛋白的功能丧失会导致水稻的粒长增加，籽粒表皮细胞变长。而hos59基因表达量的提高会导致水稻的粒长变短，籽粒表皮细胞变短。因此，通过调控水稻中hos59基因的表达量，可以调控水稻籽粒的大小，进而影响水稻单株的产量。
[0161]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。