一种芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌及其在茶树中的应用。


背景技术：

2.芽孢杆菌是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的细菌。芽孢杆菌属于芽孢杆 菌科、芽孢杆菌属，是一类能产生抗力内生孢子的革兰氏阳性菌，细胞呈杆状且外层覆 盖大量的吡啶二羧酸钙。其皮层位于核心和芽孢壳之间，含丰富的肽聚糖；核心是一种 高度浓缩的、惰性的染色体；最外层的外壁为一层肽聚糖壁，且一层或多层的成分为蛋 白质的芽孢衣。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强，对染料不易着 色，稳定性好，耐氧化、耐挤压、耐高温，能长期耐受60℃高温，在温度120℃下能 存活20min，且耐酸碱，在胃酸环境中能保持活性，这可能与芽孢独具的高含量吡啶二 羧酸有关。同时还具有广谱杆菌活性，能产生细菌素，抑制病原菌。目前应用较多的有 枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等类型。
3.本发明从安徽省黄山市祁门县历口镇茶园根际土壤中分离得到芽孢杆菌annong-2。 所述菌株分离的菌落在解钾培养基上28℃培养3-4天，直径8-13mm，在lb培养基中 活化或纯化培养24小时后菌落直径在8-10mm左右，培养3天菌落直径可达15-20mm。
4.茶氨酸(l-theanine)是茶叶特有一种氨基酸，化学式为c7h
14
n2o3，在干茶中占 重量的1％-2％。茶氨酸系1950年首次从绿茶中分离得到，是茶叶的特征氨基酸，也是 茶叶呈味物质之一，它与绿茶品质呈强正相关，相关系数达0.787～0.876。在茶叶存在 二十多种氨基酸中，茶氨酸约占茶叶氨基酸总量50％～60％；经研究发现，除在茶 梅、蘑菇、油茶等植物中已检测出微量存在外，在其它植物中尚未发现。
5.茶氨酸是茶叶中的一种重要的品质参数，绿茶中茶氨酸含量是茶叶鲜爽味的重要 组分，目前还没有关于菌株提高茶叶茶氨酸含量的报道。本专利筛选出提高茶氨酸总 量的菌株，为开发微生物肥料奠定基础。


技术实现要素：

6.本发明的目的提供一种芽孢杆菌annong-2及其应用，该菌株具有提高茶树叶片中 茶氨酸总量的特点，可用于制备微生物肥料，该菌株已于2021年9月10日保藏于在中 国典型培养物保藏中心，该芽孢杆菌annong-2的保藏号为：cctcc m 20211090，拉 丁名：芽孢杆菌annong-2地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027
‑ꢀ
68754052。
7.本发明保藏的芽孢杆菌annong-2菌落的特征为：菌落白色，呈圆形，表面光滑不 透明，边缘完整。
8.所述芽孢杆菌annong-2的基因序列为：
[0009][0010]
同时，本发明提供了新筛选出来的芽孢杆菌annong-2的用途，具体为：
[0011]
1、所述芽孢杆菌annong-2用于灌根处理茶树幼苗，可提高茶叶的茶氨酸总量。
[0012]
2、所述芽孢杆菌annong-2用于制备高茶氨酸茶叶的微生物肥料。
[0013]
3、所述芽孢杆菌annong-2用于提高茶苗的抗旱能力。
[0014]
同时，本发明还基于芽孢杆菌annong-2提供一种提高茶叶中茶氨酸总量的方法， 所述处理方法如下：
[0015]
①
采用活化后的芽孢杆菌annong-2接种至lb液体培养基中，在28-30℃的条件 下恒温摇床振荡培养，得到芽孢杆菌annong-2菌液；
[0016]
②
将所述芽孢杆菌annong-2菌液浇灌在茶树的根部；
[0017]
③
茶树生长成熟后，其茶叶中的茶含量有显著提升；
[0018]
其中，所述芽孢杆菌annong-2的保藏号为：cctcc m 20211090。
[0019]
同时，本发明还基于芽孢杆菌annong-2提供一种促进茶树茶氨酸合成合成的微生 物肥料，具体是所述微生物肥料中包括芽孢杆菌annong-2菌液，所述芽孢杆菌 annong-2的保藏号为：cctcc m 20211090。
[0020]
其中，所述芽孢杆菌annong-2菌液的菌落总数为：0.5～3.0
×
108个/ml。
[0021]
有益效果
[0022]
首先，本发明保藏的芽孢杆菌annong-2分离自生产旺盛且高产茶氨酸的茶园中。 采用本发明的芽孢杆菌annong-2灌根处理茶苗，在处理后，能够显著提高茶树叶片的 茶氨酸总量。根据实验测得数据，经过其处理后，幼龄茶树叶片的茶氨酸总量由对照组 的不到1.0％增加到约1.7％和2.4％(在同一标准曲线下测定)，不同处理的计算值，可见， 本发明
的芽孢杆菌annong-2增加茶氨酸的含量，且提高近1倍。发明人尚未查询到芽 孢杆菌annong-2提高茶树叶片茶氨酸总量的相关报道。
[0023]
其次，本发明的芽孢杆菌annong-2能够很好的适应自然环境，在提高茶树叶片 中茶氨酸总量的同时，不增加茶树叶片的茶多酚含量，对绿茶品质的提高有重要贡 献。而通过研究芽孢杆菌annong-2的分泌物发现，芽孢杆菌annong-2的分泌物中 不含有任何的氨基酸，但其分泌物中含有很多种的有机酸。增加茶氨酸的详细机理有 待进一步的研究。
[0024]
再次，本发明保藏的芽孢杆菌annong-2在干旱的条件下可以提高茶树的抗旱能 力。经过实验表明，在20天没有给茶苗浇水的实验条件下，施加本发明保藏的芽孢杆 菌annong-2的茶苗的生长速度与正常保持土壤湿度为60％的茶苗的生长速度几乎相 同，远高于不施加芽孢杆菌的处理组。因此本发明保藏的芽孢杆菌annong-2可以作 为有机肥料施加在茶树或者茶苗上，以增强茶树或者茶苗的抗旱能力。
[0025]
最后，本发明保藏的芽孢杆菌annong-2可以作为有机生物肥料，为树栽培提供 新的思路，可以帮助种植出风味浓郁优质的绿茶。同时，本发明菌株的培养条件简 单，培养成本低，有广泛的市场前景。
附图说明
[0026]
图1为本发明芽孢杆菌annong-2在lb培养基上的菌落形态图。
[0027]
图2为本发明芽孢杆菌annong-2菌种理化性质。
[0028]
图3为叶片茶氨酸总量柱状图
[0029]
图4为叶片茶多酚总量柱状图。
[0030]
图5为干旱菌株处理的叶绿素荧光对比图。
[0031]
图6为干旱菌株处理的叶绿素荧光数据对比图。
[0032]
图7为干旱菌株处理的茶苗长势对比图。
具体实施方式
[0033]
以下结合实例对本发明进行详细说明。所有方法及技术，如无特别说明，均为常规 方法和技术。
[0034]
实施例1
[0035]
一种芽孢杆菌annong-2，所述菌株已于2021年8月26日保藏于在中国典型培养 物保藏中心，该芽孢杆菌的保藏号为：cctcc m 20211090 annong-2。
[0036]
其中，本发明实施例所用的其他试剂均为分析纯。
[0037]
本发明保藏的芽孢杆菌annong-2是从安徽省黄山市祁门县历口镇茶园根际土壤中 分离得到的。具体步骤如下：
[0038]
1)菌株的筛选：称取10.0g新鲜土样，置于装90ml无菌水的250ml锥形瓶中，放 在28-30℃、180r
·
min-1
全温振荡培养箱振荡30min，充分混匀制成土壤悬液，取 100μl土壤悬液加入到盛有900μl无菌水的1.5ml的灭菌离心管中，采用十倍梯 度稀释法，依次稀释至10-2
、10-3
、10-4
，分别取50μl稀释液涂布于固态培养基 上，所述培养基的组成为：葡萄糖10.0g，mgso4·
7h2o0.2g，na2hpo40.2g， caco35.0g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o0.2g，钾长石粉(k2o
·
a12o3·
6sio2)2.5 g，琼脂粉20g，h2o1000ml，ph 7.2-7.5。
[0039]
2)菌株培养：培养基放入28-30℃培养箱中培养72-96h。挑取培养基上单菌落于lb 固体培养基中，lb固体培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g， 水1000ml，琼脂粉20g，ph 7.0-7.2。将菌株纯化后，选择菌圈半径最大直径用 40％甘油保藏法保存于-80℃备用。
[0040]
3)活化：取出保藏于甘油管中目标菌落于lb固体培养基进行活化，28-30℃培养2-3 d。
[0041]
4)菌株形态特征及生理生化特征
[0042]
形态特征：菌落白色，呈圆形，表面光滑不透明，边缘完整，其在lb培养基上的 菌落形态见图1。
[0043]
生理生化特征：经生理生化测定，目标菌株甲基红试验为阳性；吲哚试验为阳 性；双乙酰试验为阳性；尿素酶试验为阴性；硝酸盐还原试验为阳性；糖酵解试验为 阳性；淀粉水解试验为阳性；结果如图2。
[0044]
表1菌株生理生化特征
[0045][0046]
注：“ ”阳性；
“‑”
阴性
[0047]
5)菌株dna提取：将菌株接种于lb液体培养基中，28℃ 180r
·
min-1
振荡培养24
‑ꢀ
36h，取1ml菌液于eppendorf 1.5ml离心管中，8000rpm离心3min收集菌体，按照试 剂盒方法(上海生工生物工程公司)提取菌株dna。
[0048]
6)菌株鉴定
[0049]
16s rdna基因pcr扩增：正向引物27f：(5
′‑
aga gtt tga tcc tgg ctc ag
‑ꢀ3′
)；反向引物1492r：(5
′‑
ggt tac ctt gtt acg act t-3
′
)。
[0050]
pcr反应体系如表2所示：
[0051]
表2 pcr反应体系
[0052][0053]
反应程序如表3所示。
[0054]
表3：反应程序表
[0055][0056]
pcr扩增细菌16s rdna序列，扩增产物测序后与ezbiocloud中已知16s rdna 序列比对分析，将鉴定为bacillus属。
[0057]
实施例2
[0058]
将实施例1中保藏的芽孢杆菌annong-2置于lb培养基中培养48h，培养中每隔 一段时间取芽孢杆菌annong-2的分泌物，并检测分泌物中的氨基酸和有机酸含量，结 果如表4和表5所示。
[0059]
表4：芽孢杆菌分泌的氨基酸
[0060][0061]
表5本发明保藏的芽孢杆菌的有机酸分泌表
[0062][0063]
由表4和表5的数据可以看出，实施例1中保藏的芽孢杆菌annong-2在培养过程 中都没有分泌出氨基酸类物质，反倒分泌物中含有大量的醋酸、琥珀酸、酒石酸、苹果 酸、柠檬酸等有机酸。由此可以看出，本发明的芽孢杆菌annong-2并不是产生了氨基 酸。
[0064]
实施例3
[0065]
此实施例为本发明保藏的芽孢杆菌annong-2用于提高茶树叶片中茶氨酸含量的 实施例。
[0066]
首先，茶苗盆栽处理具体包括以下步骤：
[0067]
1)活化：取保藏于甘油中芽孢杆菌annong-2，上下摇晃甘油管使菌液与甘油分 布均匀，之后用灼烧且冷却的接种环蘸取甘油管中的菌液，将蘸取菌液的接种环在lb 固体培养基上划线活化，再对活化菌株的lb固体板用封口膜密封且用马克笔进行菌株 名称及日期标记。其中lb固体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠 5g，水1000ml，琼脂粉20g，ph 7.0-7.2。
[0068]
2)培养：将划线的活化菌株密封板倒置放置于28-30℃恒温培养箱培养2-3d。
[0069]
3)菌液制备：待活化平板上长出单菌落后，用接种环挑取一单菌落接种于装有 100ml lb液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1000ml，ph 7.0
‑ꢀ
7.2)的250ml锥形瓶中，于28-30℃、180r
·
min-1
恒温摇床振荡培养约10-12h，使用 提前预热后的紫外分光光度计测定菌株培养液的od
600
值，对照用lb液体培养基。待 菌株培养液的od
600
值在0.45-0.50时(菌落总数为2.3～2.8
×
108)停止恒温摇床的菌株扩 大培养，则此时的菌株养液即为菌株的液体菌剂。将完成培养后的菌株培养液转移至 550ml的塑料瓶中，做好标记，备用。
[0070]
4)施菌处理：2020年6月1日开始对茶苗进行施菌处理，先将茶苗四周的杂草及 落叶清理，再用刨土铲沿茶苗四周3-5em且距离地面10-13em深处刨坑，将刨出的土 壤按照刨坑的轮廓堆积，之后将培养后装在550ml塑料瓶中的菌液按照每盆3.5kg土 壤施用50ml菌液，对照施用同体积水的方式沿茶苗四周灌根处理，最后将坑四周的 土壤重新覆盖于施菌后的菌液表面，使菌液完全被覆盖，避免夏天的阳光直射。
[0071]
5)2020年8月1日，采处理后茶苗的一叶和二叶密封于提前标记好的自封袋中放 在干冰盒后存放于-80℃冰箱备用，用于茶氨酸总量测定。
[0072]
6)茶氨酸总量的测定具体操作步骤如下：
[0073]
(1)将同一处理下茶鲜叶一叶二叶混合均匀后，用液氮研磨后，称取混合茶鲜叶
[0074]
0.1000g左右于5ml离心管中，记录称取研磨后的茶鲜叶质量(g)；
[0075]
(2)向装有茶鲜叶的5ml离心管中加入2ml屈水，震荡后100℃水浴30min，其 间每隔10min上下摇晃一次；
[0076]
(3)在15000rpm条件下，离心15min，过2次0.22μm的水系膜后转移至进样小 瓶中。
[0077]
(4)茶氨酸标准储备液：称取0.05g茶氨酸(精确到0.0001g)，用屈水溶解后移入
[0078]
50ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升含1mg茶氨酸。
[0079]
(5)茶氨酸标准使用液配制：分别准确吸取茶氨酸标准储备液0.0，0.1，0.2，0.5，1， 1.5，2.0，5.0，10.0ml，用屈水定容至10ml，得到浓度分别为0.0，0.01，0.02，0.05， 0.10，0.15，0.20，0.50，1.0mg/ml的茶氨酸标准使用溶液。
[0080]
(6)在agilent高效液相色谱仪(1260)，waters e2695 hplc(waters，usa)， phenomenex
[0081]
c18反向色谱柱(5μm，250mm
×
4.6mm，phenomenex，los angeles，usa)条件下，
[0082]
采用流动相(a相：屈水，b相：纯乙腈)，用以下洗脱程序如表6进行茶氨酸的测 定：
[0083]
表6：茶氨酸测定洗脱程序表
[0084][0085]
由图3茶氨酸总量的结果可以看出，经过其处理后，幼龄茶树叶片的茶氨酸总量由 对照组的不到1.0％增加到约1.7％和2.4％，可以看出，本发明保藏的芽孢杆菌annong
‑ꢀ
2显著提高了叶片中茶氨酸总量。
[0086]
茶多酚含量采用甲醇提取茶鲜叶中茶多酚，通过标准曲线测定茶叶中的茶多酚，具 体方法如下：
[0087]
(1)将同一处理下茶鲜叶的一叶二叶进行真空冷冻干燥处理，之后使其混合均匀，用 液氮研磨后，准确称取混合茶鲜叶0.05g均匀磨碎的茶样到5ml离心管中；
[0088]
(2)将装有茶样的5ml离心管加入提前预热过的70％甲醇溶液1.25ml，将离心管 盖盖好放置于涡旋仪上进行1min振荡使茶样充分湿润混匀，再放入70℃水浴中浸提10 min(每隔5min上下振荡3次)，待浸提后冷却至室温；
[0089]
(3)在3500r/min条件下，离心10min，将离心后的上清液转移至5ml离心管中。 残余部分茶渣，再重复步骤(2)提取一次，合并提取液定容至2.5ml(上清液及定容均在 使用定量枪的条件下进行)，备用；
[0090]
测试液制备：移取合并后的样品提取液1.0ml置于100ml容量瓶中，用屈水定容 至刻度，混匀，待测；
[0091]
参考国标(gb/t 8313-2008)对标准测试液及样品进行测定，福林酚可将茶多酚的酚 羟基氧化，在765nm处呈现其最大吸收波长，在此波长下测定标准测试液及样品溶液 的吸光度。根据10-60μg/ml范围内的没食子酸工作液浓度测定其对应的吸光值求得 线性回归方程及相关系数(r2大于0.99)，再将样品测定值带入线性回归方程得到茶叶中 茶多酚的含量。测定结果见图4。根据图4可以看出，施加本发明保藏的bacillus sp. annong-2对茶多酚的影响不大。
[0092]
实施例4
[0093]
此实施例为本发明保藏的bacillus sp.annong-2用于提高茶苗抗旱能力的验证实施 例。
[0094]
本实施例中的实验茶苗采用半年生中茶108扦插苗。
[0095]
实验方法：取相同大小，相同时间培育的茶苗，通过土培的方式种植于盆中。
[0096]
将茶苗分为三个处理组(n＝3)
[0097]
处理组1(对照组)：茶苗的初始土壤含水量为60％，并监测保持(称重法确定) 其中的土壤含量为60％。
[0098]
处理组2(干旱处理组)：茶苗的初始土壤含水量为60％，并自然干旱(随后不进 行浇水处理)
[0099]
处理组3(干旱 菌处理组)：施菌处理后保持茶苗的初始土壤含水量为60％自然干 旱(随后不进行浇水处理)，其中，施菌方法为：解菌于lb液体培养基中，当菌液 od600＝0.8-0.95后，取150ml菌液4000rmp，4℃离心10min，随后用15ml无菌水悬浮， 每加入5ml悬浮菌液灌根。五天后进行第二次施菌处理。
[0100]
测试环境：温室温度：25℃，空气湿度25％。
[0101]
将上述处理组1、处理组2和处理组3于自然干旱后20天后取样，拍照，并测定其 叶绿素荧光图和荧光值，其结果见图5、图6和图7所示。
[0102]
实施例5
[0103]
本实施例提供一种灌根法施用的生物有机肥，本生物有机肥包括芽孢杆菌annong
‑ꢀ
2菌液，所述菌液的制备方法如下：
[0104]
1)活化：取保藏于甘油中芽孢杆菌annong-2，上下摇晃甘油管使菌液与甘油分 布均匀，之后用灼烧且冷却的接种环蘸取甘油管中的菌液，将蘸取菌液的接种环在lb 固体培养基上划线活化，再对活化菌株的lb固体板用封口膜密封且用马克笔进行菌株 名称及日期标记。其中lb固体培养基的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠 5g，水1000ml，琼脂粉20g，ph 7.0-7.2。
[0105]
2)培养：将划线的活化菌株密封板倒置放置于28-30℃恒温培养箱培养2-3d。
[0106]
3)菌液制备：待活化平板上长出单菌落后，用接种环挑取一单菌落接种于装有 100ml lb液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1000ml，ph 7.0
‑ꢀ
7.2)的250ml锥形瓶中，于28-30℃、180r
·
min-1
恒温摇床振荡培养约10-12h，控制 培养液的菌株含量为0.5～3.0
×
108个/ml，则此时的菌液即为所述生物有机肥。
[0107]
所需培养基：
[0108]
lb培养基：酵母粉5g/l、胰蛋白胨10g/l、naci 5g/l。
[0109]
固体lb每100ml加入1.5g的琼脂粉
[0110]
发酵培养基：豆粕1g/l、淀粉10g/l、nacl 5g/l ph＝6.0
[0111]
具体步骤：
[0112]
1、活化菌：从-80取出菌种，使用前适当摇匀，吸取200μl加入到6ml的lb液 体培养基中，置于摇床中28℃、转速设置200转，震荡培养10h直至浑浊。
[0113]
2、划线：用接种环挑取上述活化后的菌液，在固体lb板子上进行划线(四区划 线)，放置在28℃的培养箱中，培养13h，直至长出清晰地菌落。
[0114]
3、制备母液：从上述板子中挑取单克隆菌落置于100ml的lb液体培养基中，置于 摇床中28℃、转速设置200转，震荡培养13h。
[0115]
4、接种：将母液按照4％的接种量接种到发酵培养基中，置于摇床中35℃、转速设 置200转，震荡培养10h。即可作为施肥用的菌液。
[0116]
对施肥前的盆栽茶苗进行刨坑处理即用刨土铲沿茶苗四周3-5cm且距离地面10
‑ꢀ
13cm深刨土，将培养后的菌液按照每盆3.5kg土壤施用50ml生物有机肥，对茶树进行 四周灌根处理后，再覆土，完成施菌处理。
[0117]
本生物有机肥使用时，将上述生物有机肥浇灌在茶树的根部，也可以促进茶树快速 生长，增加茶叶中茶氨酸的含量。
[0118]
实施例6
[0119]
经过基因测序，本发明保藏的芽孢杆菌annong-2的基因序列为：
[0120][0121]