一株樊庆笙氏红球菌及其获取方法与应用

1.本发明属于微生物技术领域，进一步属于微生物分离培养应用技术领域，具体涉及一株樊庆笙氏红球菌及其获取方法与应用。


背景技术：

2.苹果是世界产量排名第二的水果，仅次于香蕉（统计截止至2016年）。中国苹果的栽培面积、总产量居世界苹果主产国第一位，是第一苹果生产大国。随着苹果的大量集约化种植，提高肥料利用率，降低土壤环境负荷的问题越来越重要。这首先适用于氮肥，氮肥是最限制作物产量的营养物质，它们兼具高能源强度和高污染环境的特性。高剂量的氮肥施用会对土壤性质和果实质量产生负面影响。
3.通过生物固氮作用固定的氮素能与有机物结合且不易流失，能被生物完全利用而不会对环境造成污染。因此研究生物固氮在改善生态平衡和促进农业可持续发展上具有重要意义。内生菌位于植物体内部，在植物组织内生活而不引起植物病症或者伤害。它们可以和植物形成复杂的共缔合，能在自然环境下促进宿主植物的生长和养分吸收，提高植物抗逆性和对病原菌的抵抗能力。其中内生固氮菌是在植物组织内部建立联合固氮体系，从而与植物形成紧密互惠共生关系的一类内生微生物。在1993年召开的第五届国际非豆科植物固氮大会总结报告中，评价内生固氮菌开辟了一条新的拓展生物固氮到非结瘤植物的途径。


技术实现要素：

4.本发明属于微生物技术领域，进一步属于微生物分离培养应用技术领域，具体涉及一株樊庆笙氏红球菌及其获取方法与应用。
5.本发明的第一目的在于提供一株樊庆笙氏红球菌；第二目的在于提供所述的樊庆笙氏红球菌的获取方法；第三目的在于提供所述的樊庆笙氏红球菌的应用。
6.本发明的第一目的是这样实现的，一株樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshengii），命名为srq-21，经鉴定为樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshengii）的一个株系，是从红富士苹果的树皮中分离得到，已于2021年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号为cgmcc no.23566，所述樊庆笙氏红球菌属于真细菌界，放线菌门，棒杆菌目、诺卡菌科、红球菌属，该菌内生于苹果树皮内具有联合固氮的能力。
7.内生固氮菌，最早于1986年在甘蔗中分离获得。后针对禾本科作物内生固氮菌的分离及应用的相关研究比较多。如研究表明甘蔗内生固氮菌可为植株提供高达70%的氮素需求；某些条件下水稻中内生固氮菌可为植株提供36%-42%氮素需求等；目前，木本植物内生固氮菌的研究还比较少，但现已开始逐渐深入。如已用
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n标记的方法证明了杨树内生菌具有固氮功能。本发明已通过高通量测序的方法验证在苹果的各个组织部位均有丰富的内
生固氮菌存在。同时通过传统的分离方法获得了大量的内生固氮菌株。苹果内生固氮菌这一新微生物资源的应用，有望减少苹果栽培过程中化肥的使用。
8.本发明的第二目的是这样实现的：一种所述樊庆笙氏红球菌的获取方法，包括分离、纯化及分子验证、菌株鉴定工序。具体包括：a、分离1）将红富士新鲜枝条用流水冲洗干净，转移至超净工作台，剪成5 cm左右的小段，用75 %的乙醇溶液消毒30 s，0.1 %的升汞溶液消毒1 min，之后用无菌水清洗3次。
9.2）将消毒完样品撕取枝条树皮，称取3 g，将其剪切为0.5 cm左右的组织块，在灭菌后的研钵中加27 ml去离子水研磨，静止沉淀10 min后取上清液梯度稀释为10-1
、10-2
和10-3
，每个梯度取100μl涂布在jensen无氮培养基上，每个梯度3个重复。
10.3）涂布后培养皿用封口膜密封，倒置于28℃恒温培养箱培养。每天观察菌落情况，约5 d后，可见明显单菌落。为了检验表面消毒效果，将最后一次清洗样品的无菌水取100μl涂布在na培养基上。若无菌落生长则表示表面消毒彻底。
11.培养条件为：28℃时间为：5djensen无氮培养基成分以g/l计为：蔗糖15.0~25.0、磷酸氢二钾（k2hpo4 ）0.5~1.5、七水硫酸镁（mgso4
•
7h2o）0.5~1.5、nacl 0.4~0.6、琼脂10.0~20.0、硫酸亚铁（feso4）0.05~0.15、钼酸钠（na2moo4）0.004~0.006、碳酸钙（caco3）1.5~2.5、ph6.5~7.5。
12.b、纯化将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshengii）srq-21；培养条件为：28℃，时间4~5d；纯化培养基成分以g/l计为：蔗糖15.0~25.0、磷酸氢二钾（k2hpo4）0.5~1.5、七水硫酸镁（mgso4•
7h2o）0.5~1.5、nacl 0.4~0.6、琼脂10.0~20.0、硫酸亚铁（feso4）0.05~0.15、钼酸钠（na2moo4）0.004~0.006、碳酸钙（caco3）1.5~2.5、ph6.5~7.5。
13.c、分子验证通过扩增固氮基因nifh从分子生物学角度验证菌株樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshengii）srq-21为苹果内生固氮菌。验证流程包括，菌株总dna提取、nifh基因pcr扩增、电泳检测基因片段。具体包括：a、菌株总dna提取用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取纯化的细菌菌株的总dna。试剂盒购自上海生物工程股份有限公司。
14.提取步骤如下：1）取1ml过夜培养的细菌菌液，加入2ml离心管中，室温10000 rpm离心5 min，弃上清收集菌体。加入100 μl buffer digestion和80 μl溶菌酶溶液。重悬菌液，37℃水浴30 min（使用前将相应的溶菌酶加入到enzymatic lysis buffer中，配置成20 mg/ml的溶菌酶溶液）；2）加入20 μlproteinase k溶液，震荡混匀。56℃水浴40 min至细胞完全裂解；3）加入200 μlbuffer bd，充分颠倒混匀，70℃水浴10 min；4）加入200 μl无水乙醇，充分颠倒混匀；
qingshengii）。
32.本发明所述的srq-21菌株其16 s rdna序列如seq id no：1所示。本发明的第三目的是这样实现的，所述的樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshenggii）srq-21在制备作为促进植物生长的单一固氮菌种菌剂中的应用。
附图说明
33.图1为srq-21菌株nifh基因扩增示意图；图2为乙烯标准曲线绘制示意图。
具体实施方式
34.下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
35.一株樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshenggii）srq-21，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为cgmcc no.23566，所述樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshenggii）srq-21属于真细菌界，放线菌门，棒杆菌目、诺卡菌科、红球菌属。
36.所述的樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshenggii）srq-21的获取方法，包括分离、纯化步骤，具体包括：a、分离：1）将红富士新鲜枝条经清洗后剪成段，经消毒、清洗得到枝条材料a；2）自枝条材料a上取纸条树皮，剪切为0.4~0.6cm的组织块，加入去离子水研磨，静置沉淀8~12min后取上清液梯度稀释为10-1
、10-2
和10-3
，每个梯度取100μl涂布在jensen无氮培养基上，每个梯度3个重复；所述的jensen无氮培养基成分以g/l计为：蔗糖15.0~25.0、k2hpo
4 0.5~1.5、七水硫酸镁（mgso4•
7h2o）0.5~1.5、nacl 0.4~0.6、琼脂10.0~20.0、硫酸亚铁0.05~0.15、钼酸钠0.004~0.006、碳酸钙1.5~2.5、ph6.5~7.5；3）将涂布后的培养皿密封，于温度26~30℃条件下培养4~6 d，得到明显单菌落；b、纯化：取明显单菌落用纯化培养基平板划线纯化培养，获得长势旺盛的单菌落，即目标菌株樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshengii）srq-21；所述的纯化培养基成分以g/l计为：蔗糖15.0~25.0、k2hpo40.5~1.5、七水硫酸镁（mgso4•
7h2o）0.5~1.5、nacl 0.4~0.6、琼脂10.0~20.0、硫酸亚铁0.05~0.15、钼酸钠0.004~0.006、碳酸钙1.5~2.5、ph6.5~7.5。
37.a步骤1）中所述的消毒是用75 %的乙醇溶液消毒20~40 s，0.1 %的升汞溶液消毒0.5~1.5 min。
38.a步骤1）中所述的清洗是用无菌水清洗2~4次。
39.a步骤1）清洗后还包括检验表面消毒效果步骤，所述的检验表面消毒效果是将最后一次清洗样品的无菌水取100μl涂布在na培养基上，若无菌落生长则表示表面消毒彻底。
40.a步骤中所述的jensen无氮培养基成分以g/l计为：蔗糖20.0、k2hpo
4 1.0、七水硫
酸镁（mgso4•
7h2o）1.0、nacl 0.5、琼脂15.0、硫酸亚铁0.10、钼酸钠0.005、碳酸钙2.0、ph7.0。
41.a步骤3）是将涂布后的培养皿密封，于温度28℃条件下培养5 d，得到明显单菌落。
42.b步骤中所述的纯化培养基成分以g/l计为：蔗糖20.0、k2hpo
4 1.0、七水硫酸镁（mgso4•
7h2o）1.0、nacl 0.5、琼脂15.0、硫酸亚铁0.10、钼酸钠0.005、碳酸钙2.0、ph7.0。
43.b步骤中纯化培养的温度为28℃，时间为4~5d。
44.所述的樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshenggii）srq-21的应用为所述的樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshenggii）srq-21在制备作为促进植物生长的单一固氮菌种菌剂中的应用。
45.下面通过实施例加以说明：实施例1——樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshenggii）srq-21的获取与鉴定（1）樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshenggii）srq-21的获取a、分离1）将红富士新鲜枝条用流水冲洗干净，转移至超净工作台，剪成5 cm左右的小段，用75 %的乙醇溶液消毒30 s，0.1 %的升汞溶液消毒1 min，之后用无菌水清洗3次。
46.2）将消毒完样品撕取枝条树皮，称取3 g，将其剪切为0.5 cm左右的组织块，在灭菌后的研钵中加27 ml去离子水研磨，静止沉淀10 min后取上清液梯度稀释为10-1
、10-2
和10-3
，每个梯度取100μl涂布在jensen无氮培养基上，每个梯度3个重复。
47.3）涂布后培养皿用封口膜密封，倒置于28℃恒温培养箱培养。每天观察菌落情况，约5 d后，可见明显单菌落。为了检验表面消毒效果，将最后一次清洗样品的无菌水取100μl涂布在na培养基上。若无菌落生长则表示表面消毒彻底。
48.培养条件为：28℃时间为：5djensen无氮培养基成分以g/l计为：蔗糖20.0、k2hpo
4 1.0、硫酸（mgso4•
7h2o）1 .0、nacl 0.5、琼脂15.0、硫酸亚铁0.1、钼酸钠0.005、碳酸钙2.0、ph7.0。
49.b、纯化将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即樊庆笙氏红球菌（rhodococcusqingshengii）srq-21；培养条件为：28℃，时间4~5d；纯化培养基成分以g/l计为：蔗糖20.0、k2hpo
4 1.0、七水合硫酸（mgso4•
7h2o）1 .0、nacl 0.5、琼脂15.0、硫酸亚铁0.1、钼酸钠0.005、碳酸钙2.0、ph7.0。
50.c、分子验证通过扩增固氮基因nifh从分子生物学角度验证菌株樊庆笙氏红球菌（rhodococcus qingshengii）srq-21为苹果内生固氮菌。验证流程包括，菌株总dna提取、nifh基因pcr扩增、电泳检测基因片段。具体包括：a、菌株总dna提取用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取纯化的细菌菌株的总dna。试剂盒购自上海生物工程股份有限公司。
51.提取步骤如下：
1）取1ml过夜培养的细菌菌液，加入2ml离心管中，室温10000rpm离心5分钟，弃上清收集菌体。加入100 μl buffer digestion和80 μl溶菌酶溶液。重悬菌液，37℃水浴30min（使用前将相应的溶菌酶加入到enzymatic lysis buffer中，配置成20mg/ml的溶菌酶溶液）；2）加入20μlproteinase k溶液，震荡混匀。56℃水浴40min至细胞完全裂解；3）加入200μlbuffer bd，充分颠倒混匀，70℃水浴10min；4）加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀；5）将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静止2min，再12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液；6）将吸附柱放回收集管，加入500μl pw solution，10000rmp离心1min倒掉滤液。
52.7）将吸附柱放回收集管，加入500 μl wash solution，10000rmp离心1min倒掉滤液。
53.8）将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心3min，离去残留的wash solution。
54.9）取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入30 μl ce buffer静置5min，12000rmp室温离心2min，收集dna溶液。将dna溶液保存至-20℃。
55.10）取2μl dna溶液用nanodrop光度仪测得dna浓度为1000 ng/μl，a260/280=1.91b、nifh基因pcr扩增：nifh基因验证采用巢式pcr法。
56.第一轮扩增引物对为：fgphl9：5
’‑
tacggcaarggtggnathg-3’和polr：5
’‑
atsgccatcatytcrccgga-3’。
57.反应体系：（总体系20μl）其中模板2μl，引物fgphl9和polr各1μl，2
×
pcr mix10μl，补水6μl。
58.反应条件：95℃5min，95℃1min，55℃1min，72℃2min，30个循环，72℃10min。
59.第二轮pcr扩增以第一轮pcr产物作为模板。引物对为：aqer：5
’‑
gacgatgtagatytcctg-3’和polf：5
’‑
tgcgayccsaargcbgactc-3’。
60.反应体系：（总体系20μl）其中模板2 μl，引物aqer和polf各1 μl，2
×
pcr mix10 μl，补水6μl。
61.反应条件：95℃5min，95℃1 min，50℃1min，72℃2min，30个循环，72℃10min。
62.c、nifh基因片段电泳检测：琼脂糖凝胶电泳进行检测，可在330bp左右观察到清晰条带，证明该菌株具有nifh基因（图1）。
63.d、菌株的鉴定观察菌落的形态、大小、凹凸度、边缘，革兰氏染色，生理生化特征测试具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。该菌16s rdna序列扩增引物采用f27/r1492，扩增产物委托上海生工生物工程有限公司进行序列测定。
64.1）菌落形态观察：在jensen无氮培养基上可观察到菌落白色，圆形，边缘整齐，表面凸起光滑，不透明，菌落直径为1.0~2.0 mm。
65.2）显微形态观察：菌株显微镜下观察为短杆形。革兰氏染色呈阳性。
66.3）生理生化测试：甲基红反应为阴性；过氧化氢酶、vp 试验、吲哚产生试验、硝酸盐还原试验、产氨试验为阳性。
67.4）16s rdna序列分析：对该菌株进行16s rdna序列测定，得到了长度为1447bp的序列。srq-21菌株16s rdna序列与樊庆笙氏红球菌的菌株相似性达到99.72％，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于樊庆笙氏红球菌（rhodococcu sqingshengii）。
68.本发明所述的srq-21菌株其16 s rdna序列如seq id no：1所示，具体如下：tgctgaccatgagagtcgagcggtaaggcctttcggggtacacgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgcacttcgggataagcctgggaaactgggtctaataccggatatgacctcctatcgcatggtgggtggtggaaagatttatcggtgcaggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccgacctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggacgaagcgcaagtgacggtacctgcagaagaagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagttcgtaggcggtttgtcgcgtcgtttgtgaaaaccagcagctcaactgctggcttgcaggcgatacgggcagacttgagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggaacgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgtgggttccttccacggaatccgtgccgtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatataccggaaagctgcagagatgtggccccccttgtggtcggtatacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatcttatgttgccagcacgttatggtggggactcgtaagagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccagtacagagggctgcgagaccgtgaggtggagcgaatcccttaaagctggtctcagttcgggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggttaaccccttgtgggagggagccgtcgaaggtgggatcggcgattgggacgagcaccaaaggggggggccacaaatt。
69.用乙炔还原法测定固氮酶活。即在一定条件下，固氮酶将乙炔还原成乙烯的量与固氮酶活性高低呈正相关。乙烯含量测定采用福立gc9790ii型气相色谱仪（kromat corporation）。乙烯（80%）、乙炔（99.99%）气体购自云南铜业股份有限公司，乙烯平衡气体为氮气。使用0.5l泰德拉采样袋（购自上海会彬仪器有限公司）进行气体的转移。
70.1、标准曲线制定在7个25ml的西林瓶中分别注入0、100、200、300、400、500、600、700μl乙烯气体，用微量进样针（购自忧云之约针筒针头进样器实验器材）取200μl在气象色谱仪测量对应的峰值，最终绘制的标准曲线如图2所示。
71.2、菌株固氮酶活测定方法1）将待测菌株从-80℃冰箱取出使其在冰上融化，吸取200μl接种于2ml na培养液，置于28℃ 180r/min震荡培养48h。
72.2）用na培养液培养菌株，取5μl用nanodrop光度计测菌液浓度，至菌液od600=0.5
（对数生长期）。
73.3）取200μl菌液接种于含5ml无氮培养基jensen的25ml西林瓶中，置于28℃ 180r/min培养48h。
74.4）抽出10%的气体（2ml），充入同样体积的乙炔气体，继续培养24 h后，取200 μl的气体用气相色谱仪（gc9790ii型色谱仪）测定乙烯的生成量。进样器温度200℃、检测器230℃、柱温箱80℃。
75.5）以c2h
4 μmol/(h
·
ml)表示固氮酶活性大小c2h4浓度（μmol/(h
·
ml)）=样品c2h4峰面积
×
标准c2h4浓度
×
西林瓶容积/标准c2h4峰面积
×
c2h4反应时间
×
24.9因固氮菌在不同培养基上培养对固氮能力有影响，本研究测试了菌株在jensen、ash、jnfb3种培养基上固氮能力的差异，结果如下表。
76.表1 不同培养基srq-21菌株固氮能力培养基固氮酶活性（μmol/(hml)）jensen260.75
±
4.098ajnfb243.38
±
4.911bash182.34
±
1.730c由表1可以得出该菌株在jensen、ash、jnfb3种无氮培养基的固氮能力存在显著差异。其中在培养基jensen中固氮能力最强，达到260.75 μmol/(h
·
ml)。