一种针对dna甲基化监测的定量分析方法
技术领域
1.本发明涉及dna甲基化定量分析技术领域，尤其涉及一种针对dna甲基化监测的定量分析方法。
背景技术：
2.dna甲基化是指在甲基转移酶的催化作用下，甲基基团从腺苷蛋氨酸中转移至具有特殊序列dna的腺嘌呤或者胞嘧啶核苷酸上，常见于基因5
’‑
cpg-3’，5
’‑
g-a-t-c-3’序列等，甲基化后分别形成5
’‑
mcpg-3’和5
’‑
g-ma-t-c-3’。在表观遗传学研究当中，dna甲基化是最早被发现的基因修饰途径之一。dna的甲基化对原核/真核生物起到了基因保护作用，并且影响着哺乳动物的基因转录和复制，以及胚胎的形成和发育。而对于人类而言，dna甲基化畸变会抑制dna的转录，使得dna表达失控，进而引起一系列机体病变。因此，dna甲基化的监测对其相关的癌症早期诊断和辅助治疗具有极大的临床意义。
3.到目前为止，各种检测手段都被应用与dna甲基化水平的检测和监测，但现有的监测定量分析效果不够理想，因此提出一种针对dna甲基化监测的定量分析方法。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种针对dna甲基化监测的定量分析方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种针对dna甲基化监测的定量分析方法，包括以下步骤：
7.s1，首先提取各类样品中dna，并将基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的dna为模板，在p16基因的启动子区扩增一个长273bp的目的片段；
8.s2，同时以正常人外周血白细胞dna作阴性对照，以重蒸水做空白对照，以t-24肿瘤细胞dna作为阳性对照；
9.s3，检测时，首先用hso
3-处理待检测dna，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行pcr扩增，引物设计在原序列中不含cpg位点但含有胞嘧啶残基的序列；
10.s4，pcr扩增完后，取扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol，补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至48℃，取20μl加入到链霉亲和素包被的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗-地高辛-过氧化物酶复合物，25℃温育40min，pbs洗涤5次，加入200μl发光检测底物，静置2min；
11.作为本发明优选的方案，所述s1由于引物序列中不含有cpg位点，故这对引物可以同时扩增经亚硫酸氢盐修饰后的、甲基化及非甲基化的目的片段，而且两者具有相同的扩增效率。
12.作为本发明优选的方案，所述s2设计两条地高辛标记的寡核苷酸探针，分别与甲基化和非甲基化的pcr产物互补，两条引物有3处不同，分别对应于3个cpg位点探针序列。
13.作为本发明优选的方案，所述s3纯化pcr产物，限制酶酶切，聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，最后杂交检测，原始dna甲基化水平可通过消化的与未消化的pcr产物的相对数量来表示。
14.作为本发明优选的方案，所述s4用超弱发光检测仪测定6发光积分值，同时测定空白管，甲基化百分率-rm/(rm ru)x100％，rm：甲基化pc：甲基化cr产物的相对发光值。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.本发明中，通过基于亚硫酸氢钠处理的甲基化检测方法，这种dna序列的改变可导致新的甲基化依赖性限制性酶切位点的产生或可以引起原来已存在的甲基化依赖性限制性酶切位点的丢失，并且设计合成两条地高辛标记的、分别与甲基化和非甲基化pcr产物互补的寡核苷酸探针，然后在链霉亲和素包被的发光管中用这两条探针分别与pcr产物杂交，化学发光检测，根据两根探针的杂交信号强度之比确定样品dna中甲基化的程度，使dna甲基化监测的定量分析效果和效率较好。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.为了便于理解本发明，下面将参照相关对本发明进行更全面的描述，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例；相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
19.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明，本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
20.本发明提供一种技术方案：
21.一种针对dna甲基化监测的定量分析方法，包括以下步骤：
22.s1，首先提取各类样品中dna，并将基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的dna为模板，在p16基因的启动子区扩增一个长273bp的目的片段；
23.s2，同时以正常人外周血白细胞dna作阴性对照，以重蒸水做空白对照，以t-24肿瘤细胞dna作为阳性对照；
24.s3，检测时，首先用hso
3-处理待检测dna，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行pcr扩增，引物设计在原序列中不含cpg位点但含有胞嘧啶残基的序列；
25.s4，pcr扩增完后，取扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol，补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至48℃，取20μl加入到链霉亲和素包被的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗-地高辛-过氧化物酶复合物，25℃温育40min，pbs洗涤5次，加入200μl发光检测底物，静置2min；
26.s1由于引物序列中不含有cpg位点，故这对引物可以同时扩增经亚硫酸氢盐修饰
后的、甲基化及非甲基化的目的片段，而且两者具有相同的扩增效率。
27.s2设计两条地高辛标记的寡核苷酸探针，分别与甲基化和非甲基化的pcr产物互补，两条引物有3处不同，分别对应于3个cpg位点探针序列。
28.s3纯化pcr产物，限制酶酶切，聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，最后杂交检测，原始dna甲基化水平可通过消化的与未消化的pcr产物的相对数量来表示。
29.s4用超弱发光检测仪测定6发光积分值，同时测定空白管，甲基化百分率-rm/(rm ru)x100％，rm：甲基化pc：甲基化cr产物的相对发光值；
30.通过基于亚硫酸氢钠处理的甲基化检测方法，这种dna序列的改变可导致新的甲基化依赖性限制性酶切位点的产生或可以引起原来已存在的甲基化依赖性限制性酶切位点的丢失，并且设计合成两条地高辛标记的、分别与甲基化和非甲基化pcr产物互补的寡核苷酸探针，然后在链霉亲和素包被的发光管中用这两条探针分别与pcr产物杂交，化学发光检测，根据两根探针的杂交信号强度之比确定样品dna中甲基化的程度，使dna甲基化监测的定量分析效果和效率较好。
31.实施例：首先提取各类样品中dna，并将基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的dna为模板，在p16基因的启动子区扩增一个长273bp的目的片段，由于引物序列中不含有cpg位点，故这对引物可以同时扩增经亚硫酸氢盐修饰后的、甲基化及非甲基化的目的片段，而且两者具有相同的扩增效率；
32.同时以正常人外周血白细胞dna作阴性对照，以重蒸水做空白对照，以t-24肿瘤细胞dna作为阳性对照，设计两条地高辛标记的寡核苷酸探针，分别与甲基化和非甲基化的pcr产物互补，两条引物有3处不同，分别对应于3个cpg位点探针序列；
33.检测时，首先用hso
3-处理待检测dna，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行pcr扩增，引物设计在原序列中不含cpg位点但含有胞嘧啶残基的序列，然后纯化pcr产物，限制酶酶切，聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，最后杂交检测，原始dna甲基化水平可通过消化的与未消化的pcr产物的相对数量来表示；
34.pcr扩增完后，取扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol，补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至48℃，取20μl加入到链霉亲和素包被的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗-地高辛-过氧化物酶复合物，25℃温育40min，pbs洗涤5次，加入200μl发光检测底物，静置2min，用超弱发光检测仪测定6发光积分值，同时测定空白管，甲基化百分率-rm/(rm ru)x100％，rm：甲基化pc：甲基化cr产物的相对发光值；
35.通过基于亚硫酸氢钠处理的甲基化检测方法，这种dna序列的改变可导致新的甲基化依赖性限制性酶切位点的产生或可以引起原来已存在的甲基化依赖性限制性酶切位点的丢失，并且设计合成两条地高辛标记的、分别与甲基化和非甲基化pcr产物互补的寡核苷酸探针，然后在链霉亲和素包被的发光管中用这两条探针分别与pcr产物杂交，化学发光检测，根据两根探针的杂交信号强度之比确定样品dna中甲基化的程度，使dna甲基化监测的定量分析效果和效率较好。
36.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
技术领域
1.本发明涉及dna甲基化定量分析技术领域，尤其涉及一种针对dna甲基化监测的定量分析方法。
背景技术：
2.dna甲基化是指在甲基转移酶的催化作用下，甲基基团从腺苷蛋氨酸中转移至具有特殊序列dna的腺嘌呤或者胞嘧啶核苷酸上，常见于基因5
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cpg-3’，5
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g-a-t-c-3’序列等，甲基化后分别形成5
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mcpg-3’和5
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3.到目前为止，各种检测手段都被应用与dna甲基化水平的检测和监测，但现有的监测定量分析效果不够理想，因此提出一种针对dna甲基化监测的定量分析方法。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种针对dna甲基化监测的定量分析方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种针对dna甲基化监测的定量分析方法，包括以下步骤：
7.s1，首先提取各类样品中dna，并将基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的dna为模板，在p16基因的启动子区扩增一个长273bp的目的片段；
8.s2，同时以正常人外周血白细胞dna作阴性对照，以重蒸水做空白对照，以t-24肿瘤细胞dna作为阳性对照；
9.s3，检测时，首先用hso
3-处理待检测dna，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行pcr扩增，引物设计在原序列中不含cpg位点但含有胞嘧啶残基的序列；
10.s4，pcr扩增完后，取扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol，补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至48℃，取20μl加入到链霉亲和素包被的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗-地高辛-过氧化物酶复合物，25℃温育40min，pbs洗涤5次，加入200μl发光检测底物，静置2min；
11.作为本发明优选的方案，所述s1由于引物序列中不含有cpg位点，故这对引物可以同时扩增经亚硫酸氢盐修饰后的、甲基化及非甲基化的目的片段，而且两者具有相同的扩增效率。
12.作为本发明优选的方案，所述s2设计两条地高辛标记的寡核苷酸探针，分别与甲基化和非甲基化的pcr产物互补，两条引物有3处不同，分别对应于3个cpg位点探针序列。
13.作为本发明优选的方案，所述s3纯化pcr产物，限制酶酶切，聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，最后杂交检测，原始dna甲基化水平可通过消化的与未消化的pcr产物的相对数量来表示。
14.作为本发明优选的方案，所述s4用超弱发光检测仪测定6发光积分值，同时测定空白管，甲基化百分率-rm/(rm ru)x100％，rm：甲基化pc：甲基化cr产物的相对发光值。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.本发明中，通过基于亚硫酸氢钠处理的甲基化检测方法，这种dna序列的改变可导致新的甲基化依赖性限制性酶切位点的产生或可以引起原来已存在的甲基化依赖性限制性酶切位点的丢失，并且设计合成两条地高辛标记的、分别与甲基化和非甲基化pcr产物互补的寡核苷酸探针，然后在链霉亲和素包被的发光管中用这两条探针分别与pcr产物杂交，化学发光检测，根据两根探针的杂交信号强度之比确定样品dna中甲基化的程度，使dna甲基化监测的定量分析效果和效率较好。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.为了便于理解本发明，下面将参照相关对本发明进行更全面的描述，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例；相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
19.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明，本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
20.本发明提供一种技术方案：
21.一种针对dna甲基化监测的定量分析方法，包括以下步骤：
22.s1，首先提取各类样品中dna，并将基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的dna为模板，在p16基因的启动子区扩增一个长273bp的目的片段；
23.s2，同时以正常人外周血白细胞dna作阴性对照，以重蒸水做空白对照，以t-24肿瘤细胞dna作为阳性对照；
24.s3，检测时，首先用hso
3-处理待检测dna，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行pcr扩增，引物设计在原序列中不含cpg位点但含有胞嘧啶残基的序列；
25.s4，pcr扩增完后，取扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol，补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至48℃，取20μl加入到链霉亲和素包被的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗-地高辛-过氧化物酶复合物，25℃温育40min，pbs洗涤5次，加入200μl发光检测底物，静置2min；
26.s1由于引物序列中不含有cpg位点，故这对引物可以同时扩增经亚硫酸氢盐修饰
后的、甲基化及非甲基化的目的片段，而且两者具有相同的扩增效率。
27.s2设计两条地高辛标记的寡核苷酸探针，分别与甲基化和非甲基化的pcr产物互补，两条引物有3处不同，分别对应于3个cpg位点探针序列。
28.s3纯化pcr产物，限制酶酶切，聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，最后杂交检测，原始dna甲基化水平可通过消化的与未消化的pcr产物的相对数量来表示。
29.s4用超弱发光检测仪测定6发光积分值，同时测定空白管，甲基化百分率-rm/(rm ru)x100％，rm：甲基化pc：甲基化cr产物的相对发光值；
30.通过基于亚硫酸氢钠处理的甲基化检测方法，这种dna序列的改变可导致新的甲基化依赖性限制性酶切位点的产生或可以引起原来已存在的甲基化依赖性限制性酶切位点的丢失，并且设计合成两条地高辛标记的、分别与甲基化和非甲基化pcr产物互补的寡核苷酸探针，然后在链霉亲和素包被的发光管中用这两条探针分别与pcr产物杂交，化学发光检测，根据两根探针的杂交信号强度之比确定样品dna中甲基化的程度，使dna甲基化监测的定量分析效果和效率较好。
31.实施例：首先提取各类样品中dna，并将基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，以修饰后的dna为模板，在p16基因的启动子区扩增一个长273bp的目的片段，由于引物序列中不含有cpg位点，故这对引物可以同时扩增经亚硫酸氢盐修饰后的、甲基化及非甲基化的目的片段，而且两者具有相同的扩增效率；
32.同时以正常人外周血白细胞dna作阴性对照，以重蒸水做空白对照，以t-24肿瘤细胞dna作为阳性对照，设计两条地高辛标记的寡核苷酸探针，分别与甲基化和非甲基化的pcr产物互补，两条引物有3处不同，分别对应于3个cpg位点探针序列；
33.检测时，首先用hso
3-处理待检测dna，转化未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，接着进行pcr扩增，引物设计在原序列中不含cpg位点但含有胞嘧啶残基的序列，然后纯化pcr产物，限制酶酶切，聚丙烯酰铵凝胶电泳分离，最后杂交检测，原始dna甲基化水平可通过消化的与未消化的pcr产物的相对数量来表示；
34.pcr扩增完后，取扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol，补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至48℃，取20μl加入到链霉亲和素包被的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗-地高辛-过氧化物酶复合物，25℃温育40min，pbs洗涤5次，加入200μl发光检测底物，静置2min，用超弱发光检测仪测定6发光积分值，同时测定空白管，甲基化百分率-rm/(rm ru)x100％，rm：甲基化pc：甲基化cr产物的相对发光值；
35.通过基于亚硫酸氢钠处理的甲基化检测方法，这种dna序列的改变可导致新的甲基化依赖性限制性酶切位点的产生或可以引起原来已存在的甲基化依赖性限制性酶切位点的丢失，并且设计合成两条地高辛标记的、分别与甲基化和非甲基化pcr产物互补的寡核苷酸探针，然后在链霉亲和素包被的发光管中用这两条探针分别与pcr产物杂交，化学发光检测，根据两根探针的杂交信号强度之比确定样品dna中甲基化的程度，使dna甲基化监测的定量分析效果和效率较好。
36.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
